Zebrafish objektif Nucleus yerelleştirme ve sütür bütünlüğü değerlendirmesi

Özet

Bu protokoller kortikal lens morfolojisi, sabit ve canlı lenslerde zebra balığı lens sütürler yapısal bütünlüğü analiz etmek ve anterior-posterior eksen boyunca zebra balığı lens çekirdeğinin konumunu ölçmek için geliştirilmiştir.

Özet

Zebra balığı, genetik manipülasyon ve In vivo görüntüleme için benzersiz bir şekilde uygundur ve bu da ters genetik çalışmalar için ve in vivo görüntüleme için transgenics üretimi için giderek daha popüler bir model haline gelmiştir. Bu benzersiz yetenekleri zebra balığı oküler lens geliştirme ve Fizyoloji çalışma için ideal bir platform olun. Son bulgularımız bir Aquaporin-0, Aqp0a, anterior objektif sütür istikrar için gerekli olduğunu, hem de yaş ile objektif merkezi objektif çekirdeğinin kayması için bize özellikle zebra balığı lensler özelliklerini analiz etmek için uygun araçları geliştirmeye yol açtı. Burada hem larva hem de yetişkin lensler için uygulanabilir objektif diseksiyon için ayrıntılı Yöntemler özetlemektedir, histolojik analiz, immünhistokimya ve görüntüleme için hazırlamak. Objektif sütür bütünlüğü ve kortikal hücre morfolojisi analizine odaklanıyoruz ve objektif morfolojisinin In vivo görüntülemesinde elde edilen verilerle disseke lenslerden üretilen verileri, genetik olarak bir yeni transgenik zebra balığı hattı ile mümkün hale kodlanmış floresan Marker. Optik eksenine dik olan disseke lenslerin analizi, objektif çekirdeğinin anterior-posterior eksen boyunca göreli konumunun ölçülmesini sağlar. Bir ilk anterior konumdan merkeze objektif çekirdeğinin hareketi yetişkin zebrafish normal lens optik için gereklidir. Böylece, objektif nükleer pozisyon nicel bir ölçü doğrudan optik özellikleri ile ilişkilidir.

Giriş

Zebra balığı, memeliler lenslere anatomik benzerlik, genetik ve farmakolojik manipülasyon, embriyonik göz gelişimi hızı, küçük boyut ve şeffaflık nedeniyle objektif gelişimi ve fizyolojisinin incelenmesi için mükemmel bir modeldir. In vivo görüntüleme için izin erken aşamalarında. Burada açıklanan yöntemler, sütür bütünlüğü, kortikal membran morfoloji in vitro ve in vivove objektif nükleer pozisyonun konumu ile birlikte embriyonik ve yetişkin aşamalarında zebra balığı lens morfolojisi analiz etmek için geliştirilmiştir. anterior-posterior eksen ex vivo. Bu yöntemler, objektif gelişimi ve fizyolojisinin fonksiyonel çalışmaları için bir başlangıç noktası olarak ve zebrafish objektif fenotürleri için ters genetik ekranlar olarak hizmet vermektedir.

Görüntüleme zebra balığı objektif morfoloji

Aquaporin 0 (AQP0) en bol objektif membran proteindir ve memelilerde birden çok temel fonksiyon nedeniyle, objektif gelişimi ve netlik için kritik öneme sahiptir. Zebrafish iki Aqp0s (Aqp0a ve Aqp0b) ve biz hem embriyonik ve yetişkin lensler fonksiyonlarının kaybını analiz etmek için yöntemler geliştirdik. Çalışmalarımız, aqp0a^-/-mutantların anterior sütür istikrarsızlığından dolayı anterior kutup opaklığı geliştirmesini ve aqp0a/b çift mutantların nükleer opaklık geliştirilmesi olduğunu ortaya koyuyor¹. AQP0 su taşımacılığı², yapışma^3,4, sitorsel çapa⁵ ve Refraktif endeks gradyan⁶nesil roller oynamak için gösterilmiştir, ancak bu çalışmalar büyük ölçüde yapılmıştır vitro. Zebra balığı, fonksiyon kaybına veya Aqp0a veya Aqp0b 'in tedirgin fonksiyonunun yaşam merceğinin morfolojisi ve fonksiyonunu nasıl etkileyeceğini incelemek için benzersiz bir fırsat sağlar. Gelişme sırasında objektif hücre morfolojisi ve sümetik bütünlüğünü değerlendirmek için, embriyonik ve yetişkin lenslerde kullanılmak üzere mevcut in vitro immünohistokimyasal yöntemleri⁷ ' ye değiştirdik ve bu süreci izlemek için üretilen transgenikler içinde vivo .

Tüm sabit embriyolar ve yetişkin lenslerde plazma membranı yapısı ve sütür bütünlüğü immunhistokimyasal analizi yapıldı. Zebrafish lensleri son derece küçüktür (objektif çapı, embriyolarda ~ 100 μm ve yetişkinlerde 1 mm 'ye kadar), memeli meslektaşları ile karşılaştırıldığında Böylece, tüm lensler dikiş bütünlüğü analiz etmek için gereklidir. Ön sütür oluşumunun In vivo Analizi ve hassas objektif hücre mimarisinin görüntülenmesi Için, Mapple 'ı özellikle objektif membranlarının etiketlemesi konusunda ifade eden transgenikler ürettik.

Objektif membran transgeniklerin canlı görüntülemenin avantajları şunlardır: 1) zaman atlamalı filmlerde dinamik morfolojik değişiklikleri okuyan, 2) sabitleme eserler kaçınarak, ve 3) daha önceki olayların daha sonra korelasyon olabilir uzunlamasına çalışmalar sağlayan fenotipleri. İris pigmentasyon normalde objektif çevre net görüntüleme önler. Primordia-5 (prim-5) aşamasından önce 1-fenil 2-Thiourea (PTU) eklenmesi, melanogenesis ve göz pigmentasyonunu yaklaşık 4 gün postfertilizasyon (DPF) olarak önler. Ancak 4 DPF 'den sonra lens çevresi özellikle eski aşamalarda in vivoolarak gizlenir. Ayrıca, objektifin yoğunluğu kendisi arka kutup görüntüleme gizler. Bu nedenle, lens çevre veya posterior sütür morfoloji çalışma, 4 DPF sonra, lensler eksize ve sabit olması gerekir.

Zojenik zebrafit hatları , vivo 10 ' daembriyonik objektif membran yapısını analiz etmek için kullanılmıştır. Q01 transjenik bir membran hedefleme dizisi için erimiş bir Camgöbeği floresan protein ifade, Gap43, EF1α organizatör ve bir hegzamer tarafından tahrik DF4 PAX6 artırıcı elemanı her yerde objektif fiber hücreler¹¹. Q01 Retina içindeki amacrin hücreleri de dahil olmak üzere ekstra Lenticular ifade var, birincil faiz objektif ise arka plan sinyali ekler. Biz herhangi bir ekstra merceksi sinyal kaçınarak amacı ile özellikle objektif bir membran gergin mApple ifade eden bir roman transjenik çizgi geliştirdik.

Objektif çekirdeği lokalizasyonu

Biz objektif çekirdeğinin larva zebra balığı ilk anterior konumdan yetişkin lensler anterior-posterior ekseninde merkezi bir konuma hareket keşfetti. Yüksek refraktif indeks objektif çekirdeğinin pozisyonunda bu vardiya zebra balığı lens optik¹normal gelişimi için bir şart olduğu düşünülmektedir. Yöntemlerimiz lens yarıçapı ile ilgili olarak objektif nükleer merkezileştirmenin ölçülmesine olanak sağlar. Bu yöntemi kullanarak, Aqp0a objektif nükleer merkezileştirme¹için gerekli olduğunu gösterdi ve bu basit yöntem objektif geliştirme ve fizyolojisi ve zebra balığı modelinde optik özellikleri diğer çalışmalara uygulanabilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan hayvan protokolleri, oftalmik ve vizyon araştırmalarında hayvanların kullanımı için ARVO Ifadesine uyarak California Üniversitesi Irvine 'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıASUC) tarafından onaylanmıştır.

1. zebrafish yetiştiriciliği ve ötenazi

1. Standart Laboratuar koşulları altında zebra balığı (AB strain) yükseltmek ve korumak¹². Embriyo Orta (EM)¹²embriyoları yükseltin. Ekle 0,003% PTU EM için 20-24 h sonrası (prim-5 aşaması önce) embriyolar pigment oluşumu önlemek için¹² embryonik aşamalarında görüntüleme için kullanılan⁹. 6-30 gün sonrası (DPF) 14 DPF kadar canlı rotiferler bir diyet ve 14 DPF¹²sonra canlı Artemia dan larva yükseltmek.
   Dikkat: PTU çok zehirli
2. Dokunmaya duyarlı olmayan kadar tricaine kullanarak balık anestezize.
   1. 3-amino Benzoik acidethylester 400 mg birleştirerek tricaine stok hazırlayın, 2,1 mL 1 M Tris (pH 9), içinde 100 mL ddH₂O. pH 7,0 olarak ayarlayın ve-20 °c ' de saklayın.
      Dikkat: Tricaine zehirli.
   2. Seyreltmeli 4,2 mL trikül stokta 100 mL tank suyunda larvaları/yetişkinleri veya EM 'de embriyoları anestezize etmek için (% 0,0165 w/v 'de tricain son konsantrasyonu).

2. embriyo ve larvaları sabitleme

Not: İmmünohistokimyasal protokoller daha önce yayınlanan materyallerden⁷' ye uyarlanmıştır.

1. Dechorionated embriyo veya larvaları 2 hafta sonrası% 4 (v/v) paraformaldehit (PFA) fosfat tamponlu tuzlu (PBS) bir rocker üzerinde 4 °C ' de bir gecede düzeltin.
   Dikkat: PFA yanıcı ve kanserojen.
2. Embriyoları PBS 'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve 4 °C ' de gece% 10 Triton ve% 1 DMSO (PBS-T) ile PBS 'de geçirgen.
   Dikkat: DMSO toksik, yutulması veya cilt emilimi ile zararlı, cilt yoluyla tehlikeli maddeler taşır, ve yanıcı. Triton zehirli, korozif ve su ortamları için tehlikelidir.

3. larval ve yetişkin zebrafish lensler diseksiyon

1. 6 DPF larvaları ile yetişkinliğe kadar tricaine 'e dokunmayan, dokunmak için yanıt vermeyen ama hala güçlü bir kalp atışı gösteren balık anestezize edilir. ¹³. aşama için balık standart uzunluğunu Schilling (2002) uyarınca ölçün.
2. Hemen mikro Diseksiyon makas ve PBS (Şekil 2 yetişkin gözleri için gösterilen) bir diseksiyon çanak içine yer kullanarak gözleri eksizler.
   1. Objektif disikleri için silikon ile dolu özel bir 35 mm çanak olun. Silikon ayarlandıktan sonra, diseksiyon sırasında yetişkin gözleri/lensleri immobilize etmek için 2-3 mm çapında ve 0,5 mm derinlikte bir Divot dışarı çıkarın.
3. Yetişkin zebra balığı lensler diseksiyon
   1. PBS ile dolu çanak Divot posterior yan içine yetişkin bir göz yerleştirin. Optik disk üzerinden < 45 ° açı forseps ekleyerek göz immobilize. Nick veya objektif sıkıştırmak için dikkatli olun. Retina ve sklera aracılığıyla optik diskten Diseksiyon makas ile siliyer bölgeye iki veya üç radyal kesikler olun.
   2. Çiçek yaprakları gibi Retina ve sklera geri Peel ve göz ters, kornea tarafı yukarı. Retina ve forseps ile bağlı dokulara uzağa çekerek, makas düz tarafı ile sklera ve kornea manipülasyon yoluyla dolaylı objektif immobilize. Dikkatle objektif aşırı doku Trim.
      Not: Sürekli sağlıklı lensler elde etmek için dikkatle incelemek için hayati önem taşımaktadır.
4. Larva zebra balığı lenslerin diseksiyonu
   1. PBS ile dolu silikon çanak düz parçası üzerine bir larva göz arka tarafı yukarı yerleştirin ve başka bir tungsten iğne veya forseps ile göz immobilizing ederken Retina ve sklera üzerinden radyal kesikler yapmak için bir keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanın.
      Not: Objektif zarar vermemek için dikkatli olun.
      1. % 10 (w/v) NaOH içine tel ucu askıya alarak elektron 0,1 mm Tungsten Tel 2 cm uzunluğunun ucunu keskinleştirmek ve düşük voltaj alternatif akım¹⁴uygulama. İğne, bir Bunsen brülörü kullanarak cam ucunu erime ile Pasteur pipet içine sabitleyin.
         Not: Alternatif ince diseksiyon araçları da kullanılabilir.
         Dikkat: NaOH korozif.
   2. Hafifçe iğne künt bir tarafı ile kesildiği göz objektif dışarı kepçe ve dikkatle bağlı doku çekin.

4. dissected lensler sabitleme

1. Oda sıcaklığında (RT) 24 saat boyunca PBS 'de% 1,5 (v/v) PFA 'da disseke lensler hemen düzeltin. PBS 'de üç kez her biri 10 dakika yıkayın lensler.
2. Tüm montaj analizi veya kriyobölümleme için kriyokoruma için lensler geçirgen (bkz. Bölüm 8).
   1. 4 °C ' de bir gecede PBS-T lensler geçirgen.

5. objektif Immünhistokimya

1. Phalloidin-Alexa Fluor 546 (1:200) ve PBS-T ' d a k i 4 °c ' de DAPI (1:1000 of 5 mg/ml stokta) ile hücre çekirdekleri ile sabit embriyo/larval veya yetişkin lenslerin etiket membranları.
   Dikkat: DAPı bir cilt ve göz tahriş edici.
2. Her biri 10 dakika boyunca PBS-T ile üç kez yıkayın. % 30,% 50 ve% 70 gliserol PBS-T (v/v) içinde inkübasyon ile net doku her biri en az 1 saat veya 4 °C ' de bir gecede.
3. PBS-T ' d a (v/v) 70% rogliserin içinde cam alt 35 mm 'lik mikrowell yemeklere, düz ve direkt olarak kapak kayma karşı mümkün olduğunca Mount balık. Küçük balık için, hafif bir anterior-lateral Tilt coverslip paralel olmak için objektif sütür yönlendirmek için yardımcı olabilir.

6. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi

1. Tol2 kiti¹⁵kullanarak TG (βB1cry: mAppleCAAX) hatları oluşturun. Tol2 transpoze eleman sistemi¹⁵ Mapple insan βb1300 BP tarafından tahrik olduğu yapının istikrarlı entegrasyonu sağlar-kristalin promotör¹⁶ ifade sonuçlanan caax sırası ile membran gergin Özellikle lens fiber hücreli membranlarda.
   Not: Bu yapı (ID: 122451) satın alınabilir.
   1. Enjeksiyon sabahı, enjeksiyon karışımı hazırlamak ve buz üzerinde tutun. RNase-ve DNase-Free H₂O içeren son 10 μL hacmine ulaşmak için, ekle: 1,5 μL huβb1Cry: 50 ng/μL-[0.375-0.75 pg/final enjeksiyon] de mAppleCAAX DNA yapısı, 1,5 μL Tol2 Transposase mRNA Içinde 300 ng/μL (Tol2 kit)¹⁵ [15-30 pg/ Son enjeksiyon] ve 1 μL fenol kırmızı göstergesi% 1 w/v [1 x10^-5% (w/v)/final enjeksiyon].
   2. Enjekte 50-100 pL enjeksiyon karışımı 1 hücreli aşama embriyo¹².
2. 3 DPF 'de Mapple pozitif lensler ile embriyo sıklığını ölçerek F0 enjekte embriyolar nakliyle verimliliği ölçmek.
   Not: Bu yöntemi kullanarak >% 80 nakliyle verimliliği bekliyoruz. F0 mozaikler, bireysel hücrelerin membran morfolojilerinin ayrıntılı analizine izin verir. Farklı seviyede mozaikçilik, tek veya küçük hücre gruplarının morfolojilerini görüntülere sağlar, daha küresel objektif ifadesi ise lens sütürler in vivogibi çok hücreli yapıların analizine olanak sağlar.
3. Outcross F0 mozaik balık tüm fiber hücre membranların etiket kararlı hatları, oluşturmak için. F0 kurucu transgeni ile germline entegre transgenik hatları olarak muhafaza edilebilir istikrarlı entegrasyonları ile yavru üretecek.

7. bir transjenik Line In vivo kullanarak zebrafish anterior lens sütürler Analizi

1. Anestezize 3 DPF veya yetişkin mozaik veya istikrarlı transjenik balık ve Mount 1% düşük Melt agaroz (lma) ile tricaine göz düz cam alt mikrokuyu yemekleri kapak kayma karşı.
   1. 1% LMA yapmak için 100 mL EM (metilen mavi olmadan) içinde LMA 1 g çözülür. 4 °C ' de 15 mL stoklar olarak uzun süreli saklayın. Mikrodalga her tüp kullanılıncaya kadar 42 °C ' de stok ve mağaza çözülür.
2. Trigren ile EM ile 6 DPF kadar kapak balık, veya LMA ayarlandığında yetişkinler için tricaine ile tank suyu ile.
   1. Metilen mavi veya tank suyu olmadan 5 mL EM Mix ile 250 μL tricaine stok ve 7 μL PTU görüntü PTU tedavi balık.

8. objektif Kriyobölümleme ve Immünhistokimya

1. PBS (w/v) içinde% 10 sakaroz, RT 'de 1 saat için% 20 sakaroz (ya da 4 °c ' de bir gecede) ve 4 °c ' de% 30 sakaroz içinde bir gecede, sabit embriyolar veya yetişkin lensleri koruyun.
2. Taban kalıplar Oct doku embed, ve sonra Ekim ile Aynalar üzerinde dondurmak. 12-14 μm de cryosection ve bir SuperFrost/Plus mikroskop slaytlar üzerine toplamak. 10 dakika boyunca slayt üzerine sıcak bölümler ~ 35 °C ' ye prewarmed.
3. Her biri 10 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkama bölümleri. Phalloidin-Alexa un 546 (1:200) ile DAPı (1:1000) veya WGA-Alexa un 594 (1:200) ile etiket bölümleri, ardından üç PBS yıkanıyor. Anti-Fade montaj orta ve tırnak cilası ile mühür lamel magazini ile Mount.

9. görüntüleme

1. Konfokal mikroskop ile görüntü kazanın. Z-yığınları veya optik dilimleri 60x N/A 1,2 su daldırma amacı veya benzer kullanarak, belirli bölgelerde posterior objektif kutup anterior elde. Aşağıdaki edinme ayarlarını kullanın: 1,2, 561 nm lazer, phalloidin-Alexa un 546 veya mApple için Texas kırmızı filtre veya DAPı için UV filtresi ile 405 lazer kullanarak havadar disk.
2. Objektif derinliği ile sinyal kaybını karşı koymak için doğru z yoğunluklu lazer gücü. Bu sabit ve canlı 3 DPF embriyo posterior kutup güçlü bir sinyal ve yetişkin balık lensler Ekvator optik dilimleri güçlü sinyal sağlar.
3. Resim işleme yazılımını kullanarak görüntüleri derleyin ve görüntüleyin.

10. anterior-posterior eksen objektif Nucleus yerelleştirme ölçümü

1. Odak düzlemine paralel olarak direkler ve dikişler ile bir coverglass alt ile 35 mm tabak içinde PBS eksenel olarak taze eksiz lensler Orient. Genellikle objektif çekirdeğini tanımlamak için lens korteks ve objektif çekirdeğinin arayüzünde meydana gelen kırılma indeksinde bir fark arayın.
   Not: Sağlıklı vahşi tip yetişkin lensler çok zor objektif sütürler ve çekirdek görmek, ya da objektif yönünü belirlemek için yapım şeffaftır. Bu durumda, lens kapsülü için forseps ile hafif bir Nick küçük hasar neden olur, bu ölçüm için objektif yönlendirmek için yardım yaklaşık 10 dakika içinde sütürler ve objektif çekirdeği belirgin hale getirir. Ancak, lensler artık hasar gördüğü için aşağı akış uygulamaları için kullanılamaz hale gelir.
2. Lens çekirdeği ile parlak alan aydınlatması altında veya DıC optik olmadan bir kamera bağlı bir diseksiyon mikroskop kullanarak objektif görüntüleri alın. Kalibrasyon için aynı büyütme altında bir mikrometre görüntü.
   1. Canlı Görünüm düğmesine tıklayın, objektif çekirdeği ve objektif çevre görselleştirmek için pozlama ayarlarını ayarlamak ve snap shot butonuna tıklayarak bir görüntü almak. Bir tif dosyası olarak kaydedin.
   2. Elde edilen lens görüntülerini kalibre etmek için görüntü işleme yazılımını kullanın. Düz çizgi aracını seçin ve mikrometre görüntüsünde bilinen uzunlukta bir çizgi çizin, analiz et | ölçek ayarlayın. Bilinen mesafeyi, birimleri girin ve ' Global ' kalibrasyonunu seçin ve Tamam 'ı tıklatın.
3. Objektif çekirdeğinin merkezinin ön kutuplu (a-r) mesafesini ölçün.
   1. Objektif çekirdeğinin görselli merkezinde eksenel yönde bir çizgi çizmek için görüntü işleme yazılımındaki düz çizgi aracını kullanın. Objektif çekirdeğinin merkezi olarak bu satırın merkezini alın.
   2. Objektif anterior Pole bu noktadan başka bir çizgi çizin ve seçin ' ölçmek ' ' analiz ' menüsünde uzaklığı ölçmek için (a-r), burada bir objektif yarıçapı ve r merkezine objektif merkezinden uzaklığı olduğunu Çekirdeği.
   3. Arka kutuplara anterior başka bir çizgi çizin ve objektif çapı (2A) olarak bu mesafeyi ölçmek. Bu uzunlukları ' sonuçlar ' penceresinden kopyalayın ve bir elektronik tabloya veya istatistik programına aktarın.
      Not: Merceğin merkezine objektif çekirdeğinin merkezinden ölçme daha, tam olarak ön kutup çekirdeğinin merkezinden ölçmek daha kolaydır. Bu ölçüm, lens çekirdeğinin merkezinin lensin merkezine uzaklığını bildirmek için 10.3.5 adımda formüle göre dönüştürülür. Embriyonik çekirdeğin belirgin olmasına rağmen her zaman ölçümler için yetişkin çekirdeğini kullanın.
   4. Objektif yarıçapını hesaplamak için çapı 2 ' ye bölün .
   5. Objektif yarıçapına göre objektif çekirdeğinin normalleştirilmiş lokalizasyonu olan r/adeğerini hesaplayın.
      Not: ön kutup daha yakın yerleştirilen bir kernel Için, r/a > 0.0 olacak, merkezi lokalize bir çekirdeğin 0,0 bir r/a olacak iken.
4. Zebra balığı gelişimi sırasında objektif çekirdeği lokalizasyonunda yapılan değişiklikleri belirlemek için normalleştirilmiş eksenel çekirdeği ölçümünün günlük olarak standart uzunluğun bir işlevi olarak grafiğini yapın.

Sonuçlar

Yetişkin zebra balığı göz anatomisi memelilerin yakından benzerdir (Şekil 1a). Zebrafit ve memelinin gözleri arasında bazı farklılıklar olmasına rağmen, örneğin bir siliyer vücudu yerine bir siliyer bölgesi olmak gibi¹⁷, optik özelliklerde farklar¹⁸, ve embriyonik gelişim sırasında morfojenin farklılıkları¹⁹, zebra balığı göz göz gelişimi ve anlayış oftalm...

Tartışmalar

Zebra balığı objektif morfoloji Analizi mutantlar fenotipleri anlamada ilk adımdır, ya da oküler objektif biyoloji okumaya yönelik farmakolojik müdahalelerin etkileri. Objektif sütürler, kortikal fiber hücre morfolojisi ve objektif çekirdeğinin yönlerini analiz etmek için yöntemleri özetlemektedir. Bu yaklaşımlar in vitro ve In vivo ( tablo 1 ' de karşılaştırıldığında) bir kombinasyonudur. In vitro yöntemleri dış kortikal hücre morfolojisi daha fa...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262