Avaliação da localização do núcleo da lente de zebrafish e integridade sutural

Resumo

Estes protocolos foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente cortical, a integridade estrutural das suturas da lente do zebrafish em lentes fixas e vivas e para medir a posição do núcleo da lente do zebrafish ao longo do eixo anterior-posterior.

Resumo

O zebrafish é serido excepcionalmente à manipulação genética e à imagem latente in vivo , fazendo lhe um modelo cada vez mais popular para estudos genéticos reversos e para a geração de transgênicos para in vivo Imaging. Estas capacidades únicas fazem o zebrafish uma plataforma ideal para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente da ocular. Nossos resultados recentes que um Aquaporin-Aqp0a, é exigido para a estabilidade da sutura anterior da lente, assim como para o deslocamento do núcleo da lente ao centro da lente com idade conduziu-nos desenvolver as ferramentas seridos especialmente para analisar as propriedades de lentes do zebrafish. Aqui nós esboçam métodos detalhados para a dissecção da lente que pode ser aplicada às lentes larval e adultas, para prepará-las para a análise histológica, immunohistochemistry e imagem latente. Nós focalizamos na análise da integridade da sutura da lente e da morfologia da pilha cortical e comparar dados gerados das lentes dissecadas com os dados obtidos da imagem latente in vivo da morfologia da lente feita possível por uma linha transgénica nova do zebrafish com um geneticamente marcador fluorescente codificado. A análise das lentes dissecadas perpendiculares ao seu eixo óptico permite quantificar a posição relativa do núcleo da lente ao longo do eixo ântero-posterior. O movimento do núcleo da lente de uma posição anterior inicial ao centro é exigido para o sistema ótico normal da lente no zebrafish adulto. Assim, uma medida quantitativa da posição nuclear da lente correlaciona-se diretamente com suas propriedades óticas.

Introdução

O zebrafish é um modelo excelente para estudar o desenvolvimento e a fisiologia da lente devido às similaridades anatômicas às lentes de mamíferos, à facilidade relativa da manipulação genética e farmacológica, à velocidade do desenvolvimento embrionário do olho, ao tamanho pequeno e à transparência em estágios iniciais permitindo in vivo Imaging. Os métodos descritos aqui foram desenvolvidos para analisar a morfologia da lente zebrafish em estágios embrionários e adultos com foco na integridade sutural, morfologia da membrana cortical in vitro e in vivo, e localização da posição nuclear da lente ao longo do eixo ântero-posterior ex vivo. Estes métodos servem como um ponto de partida para estudos funcionais do desenvolvimento e da fisiologia da lente, assim como telas genéticas reversas para fenótipos da lente no zebrafish.

Morfologia da lente do zebrafish da imagem latente

Aquaporin 0 (AQP0) é a proteína mais abundante da membrana da lente e é crítico para o desenvolvimento da lente e a claridade, devido às funções essenciais múltiplas nos mamíferos. Zebrafish tem dois Aqp0s (Aqp0a e Aqp0b) e nós desenvolvemos métodos para analisar a perda de suas funções nas lentes embrionárias e adultas. Nossos estudos revelam que aqp0a^-/-mutantes desenvolvem a opacidade polar anterior devido à instabilidade da sutura anterior, e aqp0a/b os mutantes duplos desenvolvem a opacidade nuclear¹. AQP0 tem demonstrado desempenhar papéis no transporte de água², adesão^3,4, fixação citoesquelética⁵ e geração do gradiente de índice de refração⁶, mas estes estudos foram amplamente realizados em em vitro. O zebrafish fornece uma oportunidade única de estudar como a perda de função, ou a função perturbada de Aqp0a ou Aqp0b afetaria a morfologia e a função em uma lente viva. Para avaliar a morfologia das células da lente e a integridade sutural durante o desenvolvimento, modificamos os métodos imunohistoquímicos in vitro existentes⁷ para uso em lentes embrionárias e adultas, e geramos transgênicos para monitorar esse processo in vivo .

A análise de immunohistochemical da estrutura da membrana do plasma e da integridade sutural foi executada em embriões fixos inteiros e em lentes adultas. As lentes de zebrafish são extremamente pequenas (o diâmetro da lente é ~ 100 μm nos embriões e até 1 milímetro nos adultos) comparados com seus homólogos mamíferos e tem as suturas de ponto⁸, que são capturadas infrequëntemente nos Cryosections. Assim, as lentes inteiras são essenciais para analisar a integridade sutural. Para a análise in vivo da formação anterior da sutura, e a imagem latente da arquitetura precisa da pilha da lente, nós geramos transgênicos expressando Mapple especificamente as membranas de rotulagem da lente.

As vantagens da imagem latente viva de transgênicos da membrana da lente incluem: 1) evitando artefatos da fixação, 2) estudando mudanças morfológicas dinâmicas em filmes do tempo-lapso, e 3) permitindo estudos longitudinais em que os eventos mais adiantados podem ser correlacionados com mais tarde Fenótipos. A pigmentação da íris impede normalmente a imagem latente desobstruída da periferia da lente. A adição de 1-phenyl 2-thiourea (PTU) antes do primordia-5 (Prim-5) estágio⁹ impede o melanogênese e a pigmentação do olho até ao redor 4 dias postfertilização (DPF). No entanto, após 4 DPF, a periferia da lente é obscurecida in vivo, particularmente em estágios mais antigos. Além disso, a densidade da lente própria obscurece a imagem latente de seu pólo do posterior. Portanto, para estudar a morfologia da periferia da lente, ou a sutura posterior, após 4 DPF, as lentes precisam ser excisadas e fixas.

As linhas de zebrafish transgênicas têm sido utilizadas para analisar a estrutura da membrana da lente embrionária in vivo¹⁰. O Q01 transgênicas expressa uma proteína fluorescente ciano fundida a uma seqüência da segmentação da membrana, Gap43, conduzida pelo promotor EF1α e por um hexamer do elemento de DF4 pax6 Enhancer ubiquitously em pilhas de fibra da lente¹¹. Q01 tem a expressão extra-lenticular, incluindo as pilhas do amácrinas no retina, que adiciona o sinal do fundo se o interesse preliminar é a lente. Nós desenvolvemos uma linha transgénica nova que expresse um mApple membrana-tethered especificamente na lente, com a finalidade de evitar todo o sinal extra-lenticular.

Localização do núcleo da lente

Nós descobrimos que o núcleo da lente se move de uma posição anterior inicial no zebrafish larval a uma posição central no eixo anterior-posterior em lentes adultas. Esta mudança na posição do núcleo elevado da lente do índice refração é pensada para ser uma exigência para o desenvolvimento normal do sistema ótico da lente do zebrafish¹. Nossos métodos permitem a quantificação da centralização nuclear da lente em relação ao raio da lente. Usando este método, nós mostramos que Aqp0a é exigido para a centralização nuclear da lente¹, e este método simples pode ser aplicado a outros estudos do desenvolvimento e da fisiologia da lente e de suas propriedades óticas no modelo do zebrafish.

Protocolo

Os protocolos animais utilizados neste estudo aderem à declaração de ARVO para o uso de animais em pesquisa oftalmológica e visão e foram aprovados pelo Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC) da Universidade da Califórnia, Irvine.

1. husbandry de zebrafish e eutanásia

1. Elevar e manter o zebrafish (cepa AB) condições laboratoriais padrão¹². Elevar embriões em meio embrionário (EM)¹². Adicionar 0, 3% PTU a EM de 20-24 h pós-fertilização (antes do estágio Prim-5) para prevenir a formação de pigmentos em embriões¹² utilizados para a imagem em estágios embrionários⁹. Levantar larvas de 6-30 dias pós-fertilização (DPF) em uma dieta de rotíferos vivos até 14 DPF, e Artemia ao vivo após 14 DPF¹².
   Cuidado: PTU é muito tóxico
2. Anestesiar peixes usando tricaína até não-responsivo ao toque.
   1. Prepare o estoque do tricaina combinando 400 MGS do acidethylester 3-amino benzóico, com 2,1 ml de 1 M Tris (pH 9), em 100 ml de DDH₂O. ajuste ao pH 7,0 e armazene-O no ° c-20.
      Cuidado: A tricaína é tóxica.
   2. Diluir 4,2 mL de estoque de tricaína em 100 mL de água do tanque para anestesiar larvas/adultos ou em em para anestesiar embriões (concentração final de tricaína a 0, 165% p/v).

2. fixação de embriões e larvas

Nota: Os protocolos de immunohistochemical foram adaptados dos materiais previamente publicados⁷.

1. Correção de embriões ou larvas dechorionated até 2 semanas pós-fertilização em 4% (v/v) paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado (PBS) durante a noite a 4 ° c em um roqueiro.
   Cuidado: A PFA é inflamável e é carcinogénica.
2. Lave os embriões três vezes por 10 min em PBS, e permeabilizar em PBS com 10% Triton e 1% DMSO (PBS-T) durante a noite a 4 ° c.
   Cuidado: DMSO é tóxico, é prejudicial pela ingestão ou absorção da pele, transporta materiais perigosos através da pele, e é combustível. Triton é tóxico, corrosivo e é perigoso para ambientes aquáticos.

3. dissecção das lentes larval e adulto zebrafish

1. Anestesiar os peixes de 6 larvas de DPF para a idade adulta com tricaína até não-responsivo ao toque, mas ainda mostrando um batimento cardíaco forte. Meça o comprimento padrão dos peixes como por Schilling (2002) para a encenação¹³.
2. Imediatamente o consumo de olhos usando tesoura de microdissecção e coloque em um prato de dissecção em PBS (Figura 2 mostrado para os olhos adultos).
   1. Faça um prato personalizado de 35 mm preenchido com silicone para dissecções de lentes. Uma vez que o silicone ajustou, o imposto de consumo um Divot em torno de 2-3 milímetros no diâmetro e 0,5 milímetros profundamente para imobilizar olhos/lentes adultos durante a dissecção.
3. Dissecção de lentes zebrafish adultas
   1. Coloc um olho adulto no lado posterior do Divot do prato acima enchido com o PBS. Imobilize o olho inserindo o fórceps no ângulo de < 45 ° através do disco ótico. Tenha cuidado para não Nick ou comprimir a lente. Faça duas ou três incisões radiais através do retina e do esclera do disco ótico à zona ciliar com tesouras da dissecção.
   2. Descasque para trás o retina e o esclera como pétalas da flor e inverta o olho, lado da córnea acima. Imobilizar a lente indiretamente através da manipulação do esclera e da córnea com o lado liso da tesoura, ao puxar afastado o retina e os tecidos Unidos com fórceps. Aparar cuidadosamente o excesso de tecido da lente.
      Nota: É vital dissecar cuidadosamente para obter lentes consistentemente saudáveis.
4. Dissecção de lentes de zebrafish larval
   1. Coloque um lado posterior do olho larval para cima na parte plana do prato de silicone preenchido com PBS e usar uma agulha de tungstênio afiada para fazer cortes radiais através da retina e esclera enquanto imobilizar o olho com outra agulha de tungstênio ou fórceps.
      Nota: Tenha cuidado para não danificar a lente.
      1. Afie a ponta de um comprimento de 2 cm de 0,1 milímetros de fio de tungstênio eletroeletricamente suspendendo a ponta do fio em 10% (w/v) NaOH e aplicando uma corrente alternada de baixa tensão¹⁴. Prenda a agulha em uma pipeta de Pasteur derretendo a extremidade de vidro usando um queimador de Bunsen.
         Nota: Ferramentas de dissecção finas alternativas também podem ser usadas.
         Cuidado: NaOH é corrosivo.
   2. Delicadamente retire a lente do olho dissociado com um lado sem corte da agulha, e puxe cuidadosamente o tecido anexado.

4. fixação de lentes dissecadas

1. Corrija imediatamente as lentes dissecadas em 1,5% (v/v) de PFA em PBS por 24 h à temperatura ambiente (RT). Lave as lentes três vezes em PBS por 10 min cada.
2. Lentes permeabilize para a análise de montagem inteira ou cryoprotect para criseccionamento (ver secção 8).
   1. Lentes permeabilize em PBS-T durante a noite a 4 ° c.

5. lente imunoistoquímica

1. Membranas de rótulo de embrião fixo/larval ou lentes adultas por incubação em Phalloidin-Alexa fluor 546 (1:200) e núcleos celulares com DAPI (1:1000 de 5 mg/ml de estoque) em PBS-T durante a noite a 4 ° c.
   Cuidado: DAPI é uma pele e irritação ocular.
2. Lave três vezes com PBS-T por 10 min cada. Limpar o tecido por incubação em 30%, 50% e 70% glicerol em PBS-T (v/v) por pelo menos 1 h em RT cada, ou durante a noite a 4 ° c.
3. Monte os peixes em 70% de glicerol em PBS-T (v/v) em pratos de micropoços de fundo de vidro de 35 mm com os olhos lisos e retos contra o deslizamento de cobertura possível. Para os peixes mais jovens, uma ligeira inclinação ântero-lateral pode ajudar a orientar a sutura da lente para ser paralela à lamínula.

6. análise de suturas de lentes anteriores zebrafish usando uma linha transgênica in vivo

1. Gere linhas TG (βB1cry: mAppleCAAX) usando o kit Tol2¹⁵. O sistema Tol2 do elemento transponíveis¹⁵ permite a integração estável do constructo onde o Mapple é conduzido por 300 BP do promotor humano βb1-crystallin¹⁶ amarrado à membrana pela seqüência de CAAX tendo por resultado a expressão especificamente em membranas de células de fibra de lente.
   Nota: Esta construção (ID: 122451) está disponível para compra.
   1. Na manhã da injeção, prepare a mistura de injeção e mantenha o gelo. Para atingir um volume final de 10 μL de contendo RNase-e DNase-Free H₂O, adicionar: 1,5 μL de Huβb1Cry: mAppleCAAX DNA construção em 50 ng/μl-[0.375-0.75 PG/injeção final], 1,5 μL de Tol2 transposase mRNA em 300 ng/μl (Tol2 kit)¹⁵ [15-30 PG/ injeção final] e 1 μL de indicador vermelho de fenol a 1% p/v [1 X10^-5% (p/v)/injeção final].
   2. Injete 50-100 pL de mistura de injecção em embriões de fase de 1 célula¹².
2. Meça a eficiência da transogênese em embriões injetados em F0 medindo a frequência de embriões com lentes mApple positivas em 3 DPF.
   Nota: Espere ter > 80% de eficiência de transogênese usando este método. Os mosaicos de F0 permitem a análise detalhada de morfologias da membrana de pilhas individuais. Diferentes níveis de mosaicismo permite uma imagem das morfologias de grupos de células simples ou pequenos, enquanto a expressão de lente mais global permite a análise de estruturas multicelulares como suturas de lente in vivo.
3. Outcross F0 mosaico de peixes para gerar linhas estáveis, que rotulam todas as membranas celulares de fibra. Os fundadores da F0 com o transgene integrado ao germline gerarão descendentes com integrações estáveis que podem ser mantidas como linhas transgênicas.

7. análise de suturas de lentes anteriores zebrafish usando uma linha transgênica in vivo

1. Anestesiar 3 DPF ou mosaico adulto ou peixe transgênico estável e montar em 1% de agarose de baixo derretimento (LMA) com tricaína com o olho liso contra o deslizamento de cobertura de pratos de micropoços de fundo de vidro.
   1. Dissolva 1 g de LMA em 100 mL de EM (sem azul de metileno) para fazer 1% de LMA. Armazene a longo prazo como estoques de 15 mL em 4 ° c. Microondas para dissolver o estoque e armazenar em 42 ° c até que cada tubo seja usado.
2. Cubra os peixes até 6 DPF com em com tricaina, ou com água do tanque com tricaina para adultos quando LMA é ajustado.
   1. Misturar 5 mL de EM sem azul de metileno ou água do tanque com 250 μL de estoque de tricaína e 7 μL de PTU se a imagem PTU tratada peixe.

8. cryosectioning da lente e immunohistochemistry

1. Cryoprotect embriões fixos ou lentes adultas, colocando em 10% sacarose em PBS (w/v), 20% sacarose para 1 h em RT cada (ou durante a noite a 4 ° c) e durante a noite em 30% sacarose a 4 ° c.
2. Incorporar tecido em OCT em moldes de base, e depois congelar em mandris com OCT. Crisosecção a 12-14 μm e recolher em lâminas de microscópio Superfrost/Plus. Seções quentes na corrediça por 10 minutos em um aquecedor da corrediça pré-aquecido a ~ 35 ° c.
3. Lave as secções três vezes com PBS durante 10 min cada. Seções da etiqueta com Phalloidin-Alexa farinha 546 (1:200) com DAPI (1:1000) ou WGA-Alexa farinha 594 (1:200), seguido por três lavagens de PBS. Monte com o meio de montagem anti-fade, e o lamela do selo com lustrador de prego.

9. imagem latente

1. Adquira imagens com um microscópio confocal. Adquira pilhas z ou fatias ópticas usando um objetivo de imersão em água de 60x N/A 1,2, ou similar, em regiões específicas do pólo de lente anterior ao posterior. Use as seguintes configurações de aquisição: 1,2 disco arejado usando o 561 nm laser, Texas filtro vermelho para Phalloidin-Alexa farinha 546 ou mApple, ou o 405 laser com o filtro UV para DAPI.
2. Corrija a potência do laser z-intensity para neutralizar a perda de sinal com profundidade na lente. Isto permite um sinal forte no pólo do posterior de 3 embriões DPF fixos e vivos, e o sinal forte em fatias óticas Equatorial em lentes adultas dos peixes.
3. Compile e exiba imagens usando o software de processamento de imagem.

10. medição da localização do núcleo da lente no eixo ântero-posterior

1. Oriente lentes recém-excisadas axialmente em PBS em um prato de 35 mm com um fundo de vidro, com pólos e suturas orientados paralelamente ao plano de foco. Procure uma diferença no índice de refração, que geralmente ocorre na interface do córtex da lente e do núcleo da lente para identificar o núcleo da lente.
   Nota: As lentes adultas saudáveis do tipo selvagem são extremamente transparentes, tornando difícil ver as suturas da lente e o núcleo, ou para determinar a orientação da lente. Neste caso, um ligeiro Nick com fórceps para a cápsula da lente provoca danos menores, o que faz com que as suturas e núcleo da lente aparente em cerca de 10 min ajudando a orientar a lente para esta medição. No entanto, as lentes se tornam inutilizáveis para aplicações a jusante como eles estão agora danificados.
2. Tirar imagens de lentes com o núcleo da lente em foco iluminação de campo brilhante com ou sem óptica DIC usando um microscópio de dissecção com uma câmera anexada. Imagem um micrômetro a mesma ampliação para a calibração.
   1. Clique no botão de visualização ao vivo, ajuste as configurações de exposição para visualizar o núcleo da lente e periferia da lente, e tirar uma imagem clicando no botão snap shot. Salvar como um arquivo TIF.
   2. Use o software de processamento de imagem para calibrar as imagens da lente adquirida. Selecione a ferramenta de linha reta e desenhe uma linha de comprimento conhecido na imagem do micrômetro, clique em analisar | escala ajustada. Insira a distância conhecida, as unidades e selecione a calibração "global" e clique em OK.
3. Meça a distância do centro do núcleo da lente ao pólo anterior (a-r).
   1. Use a ferramenta de linha reta no software de processamento de imagem para desenhar uma linha através do centro imaged do núcleo da lente em uma orientação axial. Tome o centro desta linha como o centro do núcleo da lente.
   2. Desenhe outra linha a partir deste ponto para o pólo anterior da lente e selecione ' medida ' no menu ' analisar ' para medir a distância (a-r), onde a é o raio da lente e r é a distância do centro da lente para o centro da Núcleo.
   3. Desenhe outra linha do anterior para os pólos posteriores e meça esta distância como o diâmetro da lente (2a). Copie esses comprimentos da janela ' Results ' e transfira para uma planilha ou programa de estatísticas.
      Nota: É mais fácil medir precisamente a partir do centro do núcleo para o pólo anterior, do que medir a partir do centro do núcleo da lente para o centro da lente. Esta medida é convertida pela fórmula na etapa 10.3.5 para relatar a distância do centro do núcleo da lente ao centro da lente. Use sempre o núcleo adulto para medições, mesmo que o núcleo embrionário seja evidente.
   4. Divida o diâmetro por 2, para calcular o raio da lente, a.
   5. Calcule r/a, como , que é a localização normalizada do núcleo da lente em relação ao raio da lente.
      Nota: para um núcleo posicionado mais próximo do pólo anterior, r/a será > 0,0, enquanto um núcleo centralmente localizado terá um r/a de 0,0.
4. Faça um gráfico do log da medida do núcleo axial normalizado em função do comprimento padrão para determinar alterações na localização do núcleo da lente durante o desenvolvimento do zebrafish.

Resultados

A anatomia ocular adulta do zebrafish assemelha-se pròxima àquela dos mamíferos (Figura 1a). Apesar de algumas diferenças entre os olhos de zebrafish e de mamíferos, tais como ter uma zona ciliar em vez de um corpo ciliar¹⁷, diferenças em propriedades óticas¹⁸, e diferenças na morfogênese durante o desenvolvimento embrionário¹⁹, o o olho de zebrafish é um modelo excelente para ...

Discussão

A análise da morfologia da lente zebrafish é o passo inicial na compreensão de fenótipos em mutantes, ou os efeitos de intervenções farmacológicas destinadas a estudar a biologia da lente ocular. Nós esboçam métodos para analisar suturas da lente, morfologia cortical da pilha da fibra e aspectos do núcleo da lente. Estas abordagens são uma combinação de in vitro e in vivo (em comparação com a tabela 1). Os métodos in vitro permitem maior detalhamento da morfolo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262