Évaluation de la localisation des noyaux de lentilles zebrafish et de l’intégrité suturale

Résumé

Ces protocoles ont été élaborés pour analyser la morphologie des lentilles corticales, l’intégrité structurale des sutures de lentilles poisson zèbre dans les lentilles fixes et vivantes et pour mesurer la position du noyau de lentille de zébrafish le long de l’axe antérieur-postérieur.

Résumé

Le zébrafish est particulièrement adapté à la manipulation génétique et à l’imagerie in vivo , ce qui en fait un modèle de plus en plus populaire pour les études génétiques inverses et pour la production de transgénics pour l’imagerie in vivo . Ces capacités uniques font du poisson zèbre une plate-forme idéale pour étudier le développement de lentilles oculaires et la physiologie. Nos récentes découvertes qu’un aquaporin-0, Aqp0a, est nécessaire pour la stabilité de la suture de lentille antérieure, ainsi que pour le déplacement du noyau de l’objectif au centre de lentilles avec l’âge nous a conduit à développer des outils particulièrement adaptés à l’analyse des propriétés des lentilles poisson zèbre. Ici, nous décrions des méthodes détaillées pour la dissection lentille qui peut être appliquée à la fois larvaire et lentilles adultes, pour les préparer pour l’analyse histologique, immunohistochimie et l’imagerie. Nous nous concentrons sur l’analyse de l’intégrité des suture des lentilles et la morphologie des cellules corticales et comparons les données générées à partir de lentilles disséqué avec des données obtenues à partir de l’imagerie in vivo de la morphologie des lentilles rendue possible par une nouvelle lignée de zébrafish transgénique avec un génétiquement marqueur fluorescent codé. L’analyse des lentilles disséqué perpendiculaires à leur axe optique permet de quantifier la position relative du noyau de l’objectif le long de l’axe antérieur-postérieur. Le mouvement du noyau d’objectif d’une position antérieure initiale au centre est exigé pour l’optique normale de lentille dans le zebrafish adulte. Ainsi, une mesure quantitative de la position nucléaire de lentille est directement corrélée avec ses propriétés optiques.

Introduction

Le poisson zèbre est un excellent modèle pour étudier le développement de lentilles et la physiologie en raison des similitudes anatomiques aux lentilles mammaliennes, la facilité relative de manipulation génétique et pharmacologique, la vitesse du développement des yeux embryonnaires, la petite taille et la transparence à des stades précoces permettant l’imagerie in vivo . Les méthodes décrites ici ont été développées pour analyser la morphologie des lentilles de zébrafish aux stades embryonnaires et adultes, en se concentrant sur l’intégrité suturale, la morphologie membranaire corticale in vitro et in vivo, et l’emplacement de la position nucléaire de l’objectif le long de la l’axe antérieur-postérieur ex vivo. Ces méthodes servent de point de départ pour les études fonctionnelles du développement de lentilles et de la physiologie, ainsi que des écrans génétiques inverses pour les phénotypes de lentilles dans le zébrafish.

Imagerie de la morphologie des lentilles poisson zèbre

Aquaporin 0 (AQP0) est la protéine la plus abondante de membrane de lentille et est critique pour le développement de lentille et la clarté, en raison de multiples fonctions essentielles chez les mammifères. Zebrafish ont deux Aqp0s (Aqp0a et Aqp0b) et nous avons développé des méthodes pour analyser la perte de leurs fonctions dans les lentilles embryonnaires et adultes. Nos études révèlent que les mutants aqp0a^-/-développent l’opacité polaire antérieure en raison de l’instabilité de la suture antérieure, et que les mutants doubles aqp0a/b développent l’opacité nucléaire¹. AQP0 a été montré à jouer des rôles dans le transport de l’eau², l’adhérence^3,4, l’ancrage cytosquelettique⁵ et la génération du gradient de l’indice de réfraction⁶, mais ces études ont été largement réalisées dans et non vitro. Le zébrafish offre une occasion unique d’étudier comment la perte de fonction, ou la fonction perturbée de Aqp0a ou Aqp0b affecterait la morphologie et la fonction dans un objectif vivant. Pour évaluer la morphologie des cellules de lentilles et l’intégrité de la suturie pendant le développement, nous avons modifié les méthodes immunohistochimiques in vitro existantes⁷ pour les lentilles embryonnaires et adultes et avons généré des transgéniques pour surveiller ce processus in vivo .

L’analyse immunohistochimique de la structure membranaire plasmatique et l’intégrité suturale ont été effectuées dans des embryons fixes entiers et des lentilles adultes. Les lentilles zebrafish sont extrêmement petites (le diamètre de l’objectif est ~ 100 μm dans les embryons et jusqu’à 1 mm chez les adultes) par rapport à leurs homologues mammifères et ont des sutures ponctuelles⁸, qui sont rarement capturées dans les Cryosections. Ainsi, les lentilles entières sont essentielles pour l’analyse de l’intégrité suturale. Pour l’analyse in vivo de la formation de suture antérieure et l’imagerie de l’architecture de cellules de lentilles précises, nous avons généré des transgéniques exprimant spécifiquement des membranes d’objectif de Mapple.

Les avantages de l’imagerie en direct des transgéniques membranaires de l’objectif comprennent: 1) éviter les artefacts de fixation, 2) étudier les changements morphologiques dynamiques dans les films Time-lapse, et 3) permettre des études longitudinales dans lesquelles des événements antérieurs peuvent être corrélés avec plus tard Phénotypes. La pigmentation de l’iris empêche normalement l’imagerie claire de la périphérie de l’objectif. L’addition de 1-phényl 2-thiourea (PTU) avant l’étape⁹ du primordia-5 (Prim-5) prévient la mélanogenèse et la pigmentation oculaire jusqu’à environ 4 jours après la fécondation (DPF). Cependant, après 4 DPF, la périphérie de la lentille est obscurcie in vivo, enparticulier à des stades plus anciens. En outre, la densité de la lentille elle-même obscurcit l’imagerie de son pôle postérieur. Par conséquent, pour étudier la morphologie de la périphérie de la lentille, ou la suture postérieure, après 4 DPF, les lentilles doivent être excisées et fixées.

Des lignées de zébrafish transgéniques ont été utilisées pour analyser la structure membranaire des lentilles embryonnaires in vivo¹⁰. Le transgénique Q01 exprime une protéine fluorescente cyan fusionnée à une séquence de ciblage membranaire, Gap43, entraînée par le promoteur EF1α et un hexamère de l’élément Df4 Pax6 Enhancer façon ubiquitaire dans les cellules de fibre optique¹¹. Q01 a l’expression extra-lenticulaire, y compris les cellules d’amacrines dans la rétine, qui ajoute le signal d’arrière-plan si l’intérêt principal est l’objectif. Nous avons développé une nouvelle ligne transgénique qui exprime une mApple membranaire spécifiquement dans la lentille, dans le but d’éviter tout signal extra-lenticulaire.

Localisation du noyau de l’objectif

Nous avons découvert que le noyau de l’objectif se déplace d’un emplacement antérieur initial dans le zébrafish larvaire à un emplacement central dans l’axe antérieur-postérieur dans les lentilles adultes. Ce changement dans la position du noyau de lentille de l’indice de réfraction élevé est considéré comme une exigence pour le développement normal de l’optique de lentille de zébrafish¹. Nos méthodes permettent de quantifier la centralisation nucléaire de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif. En utilisant cette méthode, nous avons montré que Aqp0a est nécessaire pour la centralisation de la lentille nucléaire¹, et cette méthode simple peut être appliquée à d’autres études sur le développement et la physiologie de l’objectif et ses propriétés optiques dans le modèle de zébrafish.

Protocole

Les protocoles animaux utilisés dans cette étude adhèrent à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de Californie à Irvine.

1. l’élevage et l’euthanasie du zébrafish

1. Élever et maintenir le zébrafish (souche AB) dans des conditions de laboratoire normales¹². Élever des embryons dans le milieu embryonnaire (EM)¹². Ajouter 0,003% de PTU à l’EM à partir de 20-24 h après la fertilisation (avant le stade Prim-5) pour empêcher la formation de pigments dans les embryons¹² utilisés pour l’imagerie aux stades embryonnaires⁹. Élever les larves à partir de 6-30 jours après la fertilisation (DPF) sur un régime de rotifères vivants jusqu’à 14 DPF, et Artemia vivants après 14 DPF¹².
   Attention: La PTU est très toxique
2. Anesthésier les poissons à l’aide de tricaïne jusqu’à ce qu’ils ne réagissent pas au toucher.
   1. Préparer le stock de tricaïne en combinant 400 mg d’acidéthylester 3-amino benzoïque, avec 2,1 mL de tris 1 M (pH 9), dans 100 mL de ddH₂O. ajuster au pH 7,0 et conserver à-20 ° c.
      Attention: La tricaïne est toxique.
   2. Diluer 4,2 mL de stock de tricaïne dans 100 mL d’eau du réservoir pour anesthésier les larves/adultes ou l’EM pour anesthésier les embryons (concentration finale de tricaïne à 0,0165% p/v).

2. fixation des embryons et des larves

Remarque: Les protocoles immunohistochimiques ont été adaptés à partir de documents publiés antérieurement⁷.

1. Fixer des embryons ou des larves déchorionés jusqu’à 2 semaines après la fécondation dans 4% (v/v) de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la nuit à 4 ° c sur un rocker.
   Attention: L’PFA est combustible et est cancérogène.
2. Laver les embryons trois fois pendant 10 min dans le PBS, et perméabilize dans le PBS avec 10% de Triton et 1% de DMSO (PBS-T) pendant la nuit à 4 ° c.
   Attention: DMSO est toxique, est nocif par ingestion ou absorption cutanée, transporte des matières dangereuses par la peau, et est combustible. Le Triton est toxique, corrosif et dangereux pour les milieux aquatiques.

3. dissection des lentilles de larves et de zebrafish adultes

1. Anesthésier les poissons de 6 DPF larves à l’âge adulte avec tricaïne jusqu’à ne pas répondre au toucher, mais toujours montrant un battement de coeur fort. Mesurer la longueur standard du poisson selon le Schilling (2002) pour la mise en scène¹³.
2. Immédiatement les yeux d’accise utilisant des ciseaux de micro-dissection et placez dans un plat de dissection dans le PBS (figure 2 montrée pour les yeux adultes).
   1. Faites un plat de 35 mm personnalisé rempli de silicone pour les dissections d’objectif. Une fois que le silicone a fixé, accise un Divot autour 2-3 mm de diamètre et 0,5 mm de profondeur pour immobiliser les yeux adultes/lentilles pendant la dissection.
3. Dissection des lentilles poisson zèbre adultes
   1. Placez un oeil adulte dans le plat Divot côté postérieur vers le haut rempli de PBS. Immobilisez l’œil en insérant des pinces à < angle de 45 ° à travers le disque optique. Veillez à ne pas Nick ou comprimer la lentille. Faire deux ou trois incisions radiales à travers la rétine et la sclérotique du disque optique à la zone ciliaire avec des ciseaux de dissection.
   2. Peler la rétine et la sclérotique comme des pétales de fleurs et inverser l’œil, côté cornée vers le haut. Immobilisez la lentille indirectement par la manipulation de la sclérotique et de la cornée avec le côté plat des ciseaux, tout en tirant loin la rétine et les tissus attachés avec forceps. Coupez délicatement l’excès de tissu de la lentille.
      Remarque: Il est vital de disséquer soigneusement pour obtenir des lentilles constamment saines.
4. Dissection des lentilles de zébrafish larvaire
   1. Placez un côté larvaire postérieur vers le haut sur la partie plate du plat en silicone rempli de PBS et utilisez une aiguille de tungstène aiguisée pour faire des coupes radiales à travers la rétine et la sclérotique tout en immobilisant l’œil avec une autre aiguille de tungstène ou forceps.
      Remarque: Veillez à ne pas endommager la lentille.
      1. Aiguisez l’embout d’une longueur de 2 cm de 0,1 mm de fil de tungstène électrolytiquement en suspendant la pointe du fil en NaOH à 10% (p/v) et en appliquant un courant alternatif à basse tension¹⁴. Fixez l’aiguille dans une pipette Pasteur en fondant l’extrémité du verre à l’aide d’un brûleur Bunsen.
         Remarque: D’autres outils de dissection fine peuvent également être utilisés.
         Attention: Le NaOH est corrosif.
   2. Retirez délicatement la lentille de l’œil dissocié avec un côté émoussé de l’aiguille, et tirez délicatement sur le tissu attaché.

4. fixation des lentilles disséqué

1. Fixer immédiatement les lentilles disséqué dans 1,5% (v/v) PFA en PBS pendant 24 h à température ambiante (RT). Laver les lentilles trois fois en PBS pendant 10 min chacune.
2. Lentilles perméabilize pour l’analyse de montage entier ou cryoprotect pour cryosectionnement (voir rubrique 8).
   1. Lentilles perméabilize en PBS-T pendant la nuit à 4 ° c.

5. immunohistochimie de l’objectif

1. Membranes d’étiquetage d’embryons fixes ou de lentilles adultes par incubation en phalloidine-Alexa Fluor 546 (1:200) et noyaux cellulaires avec DAPI (1:1000 de 5 mg/ml stock) en PBS-T pendant la nuit à 4 ° c.
   Attention: DAPI est un irritant pour la peau et les yeux.
2. Laver trois fois avec PBS-T pendant 10 min chacun. Tissus clairs par incubation dans 30%, 50% et 70% de glycérol dans le PBS-T (v/v) pendant au moins 1 h à RT chacun, ou pendant la nuit à 4 ° c.
3. Montez les poissons en 70% de glycérol dans le PBS-T (v/v) sur les plats de micropuits de fond de verre 35 mm avec les yeux comme plat et droit contre le glissement de couverture que possible. Pour les poissons plus jeunes, une légère inclinaison latérale antérieure peut aider à orienter la suture de l’objectif pour être parallèle à la lèvre.

6. analyse des sutures de lentilles antérieures zebrafish à l’aide d’une ligne transgénique in vivo

1. Générez des lignes TG (βB1cry: mAppleCAAX) à l’aide du kit Tol2¹⁵. Le système d’éléments transposables Tol2¹⁵ permet une intégration stable de la construction où Mapple est entraînée par 300 BP du promoteur humain βb1-crystallin¹⁶ attaché à la membrane par la séquence CAAX entraînant l’expression spécifiquement dans les membranes des cellules de fibre optique.
   Remarque: Cette construction (ID: 122451) est disponible à l’achat.
   1. Le matin de l’injection, préparer le mélange d’injection et garder sur la glace. Pour atteindre un volume final de 10 μL contenant de la RNase et de la DNase H₂O, ajouter: 1,5 μl de HUβb1Cry: construction de l’ADN mAppleCAAX à 50 ng/μl-[Tol2-0,75 PG/injection finale], 1,5 μl d’ARNm de transposase à 300 ng/μl (kit Tol2)¹⁵ [15-30 PG/ injection finale] et 1 μL d’indicateur rouge de phénol à 1% p/v [1 x10^-5% (p/v)/injection finale].
   2. Injecter 50-100 pL de mélange d’injection dans des embryons de stade à 1 cellule¹².
2. Mesurez l’efficacité de la transgenèse dans les embryons injectés F0 en mesurant la fréquence des embryons avec des lentilles positives mApple à 3 DPF.
   Remarque: Attendez-vous à avoir une efficacité de transgenèse de > 80% à l’aide de cette méthode. Les mosaïques F0 permettent une analyse détaillée des morphologies membranaires des cellules individuelles. Les différents niveaux de mosaïcisme permettent d’image les morphologies de groupes simples ou petits de cellules, tandis que l’expression plus globale de lentille permet l’analyse des structures multicellulaires comme les sutures de lentille in vivo.
3. Outcross F0 mosaïque de poissons pour générer des lignes stables, qui Étiquettez toutes les membranes de cellules de fibre. Les fondateurs F0 avec le transgène intégré dans le germinale généreront des descendants avec des intégrations stables qui peuvent être maintenues comme lignes transgéniques.

7. analyse des sutures de lentilles antérieures zebrafish à l’aide d’une ligne transgénique in vivo

1. Anesthésier 3 DPF ou une mosaïque adulte ou des poissons transgéniques stables et monter dans 1% d’d’agarose à faible fonte (LMA) avec tricaïne avec l’oeil à plat contre le glissement de couvercle des plats de micropuits de fond de verre.
   1. Dissoudre 1 g de LMA dans 100 mL d’EM (sans bleu de méthylène) pour faire 1% de LMA. Stocker à long terme comme 15 mL de stocks à 4 ° c. Micro-ondes pour dissoudre le stock et conserver à 42 ° c jusqu’à ce que chaque tube soit utilisé.
2. Couvrir le poisson jusqu’à 6 DPF avec l’EM avec tricaïne, ou avec de l’eau de réservoir avec tricaïne pour les adultes quand LMA est fixée.
   1. Mélanger 5 mL d’EM sans le bleu de méthylène ou l’eau du réservoir avec 250 μL de stock de tricaïne et 7 μL de PTU en cas d’imagerie du poisson traité par le PTU.

8. cryosectionnement et immunohistochimie des lentilles

1. Cryoprotect des embryons fixes ou des lentilles adultes en plaçant 10% de saccharose dans le PBS (w/v), 20% de saccharose pendant 1 h à RT chacun (ou pendant la nuit à 4 ° c) et la nuit dans 30% de saccharose à 4 ° c.
2. Incorporer le tissu en PTOM dans les moules de base, puis congeler sur les mandrins avec l’OCT. Cryosection à 12-14 μm et recueillir sur un SuperFrost/plus lames de microscope. Sections chaudes sur la glissière pendant 10 min sur un chauffe-lames préchauffé à ~ 35 ° c.
3. Laver les sections trois fois avec du PBS pendant 10 min chacune. Sections d’étiquettes avec Phalloidin-Alexa Flour 546 (1:200) avec DAPI (1:1000) ou WGA-Alexa Flour 594 (1:200), suivie de trois lavages PBS. Monture avec support de montage anti-fondu, et joint de lamelle avec vernis à ongles.

9. l’imagerie

1. Acquérir des images avec un microscope confocale. Acquérir des piles z ou des tranches optiques à l’aide d’un objectif d’immersion en eau de 60X N/A 1,2, ou similaire, à des régions spécifiques du pôle d’objectif antérieur à postérieur. Utilisez les paramètres d’acquisition suivants: 1,2 Airy Disc à l’aide du laser 561 nm, Texas Red Filter pour Phalloidin-Alexa Flour 546 ou mApple, ou le laser 405 avec le filtre UV pour DAPI.
2. Correction de la puissance du laser d’intensité z pour contrer la perte de signal avec la profondeur dans la lentille. Cela permet un signal fort au pôle postérieur des embryons fixes et vivants de 3 DPF, et un signal fort dans les tranches optiques équatoriales dans les lentilles de poissons adultes.
3. Compilez et visualisez des images à l’aide d’un logiciel de traitement d’image.

10. mesure de la localisation du noyau de l’objectif dans l’axe antérieur-postérieur

1. Orienter les lentilles fraîchement excisées axialement dans le PBS dans un plat de 35 mm avec un fond de lamelle, avec des poteaux et des sutures orientés parallèlement au plan de mise au point. Recherchez une différence dans l’indice de réfraction, qui se produit généralement à l’interface du cortex de l’objectif et du noyau de l’objectif pour identifier le noyau de l’objectif.
   Remarque: Les lentilles adultes saines de type sauvage sont extrêmement transparentes, ce qui rend difficile de voir les sutures et le noyau de l’objectif, ou de déterminer l’orientation de l’objectif. Dans ce cas, un léger Pseudo avec forceps à la capsule de lentille provoque des dommages mineurs, ce qui rend les sutures et le noyau de l’objectif apparent dans environ 10 min aidant à orienter la lentille pour cette mesure. Cependant, les lentilles deviennent inutilisables pour les applications en aval car elles sont maintenant endommagées.
2. Prenez des images de lentilles avec le noyau de lentille en focus sous un éclairage de champ lumineux avec ou sans optique DIC à l’aide d’un microscope de dissection avec une caméra attachée. Image un micromètre sous le même grossissement pour l’étalonnage.
   1. Cliquez sur le bouton d’affichage en direct, réglez les paramètres d’exposition pour visualiser le noyau de l’objectif et la périphérie de l’objectif, et prenez une image en cliquant sur le bouton Snap Shot. Enregistrer en tant que fichier TIF.
   2. Utilisez le logiciel de traitement d’image pour calibrer les images de lentilles acquises. Sélectionnez l’outil linéaire et tracez une ligne de longueur connue sur l’image du micromètre, cliquez sur analyser | l’échelle définie. Entrez la distance connue, les unités et sélectionnez l’étalonnage «global», puis cliquez sur OK.
3. Mesurez la distance du centre du noyau de l’objectif au pôle antérieur (a-r).
   1. Utilisez l’outil linéaire dans le logiciel de traitement d’image pour tracer une ligne à travers le centre imagé du noyau de l’objectif dans une orientation axiale. Prenez le centre de cette ligne comme centre du noyau de l’objectif.
   2. Dessinez une autre ligne à partir de ce point vers le pôle antérieur de l’objectif et sélectionnez «mesure» dans le menu «analyser» pour mesurer la distance (a-r), où a est le rayon de la lentille et r est la distance du centre de la lentille au centre de la noyau.
   3. Tracer une autre ligne de l’avant vers les pôles postérieurs et mesurer cette distance comme le diamètre de l’objectif (2A). Copiez ces longueurs dans la fenêtre «résultats» et transférez-les dans un tableur ou un programme de statistiques.
      Remarque: Il est plus facile de mesurer précisément du centre du noyau au pôle antérieur, que de mesurer à partir du centre du noyau de l’objectif au centre de la lentille. Cette mesure est convertie par la formule de l’étape 10.3.5 pour signaler la distance du centre du noyau de l’objectif au centre de la lentille. Utilisez toujours le noyau adulte pour les mesures, même si le noyau embryonnaire est évident.
   4. Diviser le diamètre par 2, pour calculer le rayon de l’objectif, a.
   5. Calculer r/a, comme , qui est la localisation normalisée du noyau de l’objectif par rapport au rayon de l’objectif.
      Remarque: pour un noyau placé plus près du pôle antérieur, r/a sera > 0.0, tandis qu’un noyau Localisé centralement aura un r/a de 0,0.
4. Tracer le journal de la mesure normalisée du noyau axial en fonction de la longueur standard pour déterminer les changements dans la localisation du noyau de l’objectif pendant le développement du zébrafish.

Résultats

L’anatomie des yeux de la zébrafish adulte ressemble étroitement à celle des mammifères (figure 1a). Malgré certaines différences entre les yeux de zébrafish et de mammifères, comme la présence d’une zone ciliaire au lieu d’un corps ciliaire¹⁷, les différences dans les propriétés optiques¹⁸, et les différences de morphogenèse au cours du développement embryonnaire¹⁹, ...

Discussion

L’analyse de la morphologie des lentilles poisson zèbre est la première étape dans la compréhension des phénotypes chez les mutants, ou les effets des interventions pharmacologiques visant à étudier la biologie de la lentille oculaire. Nous décrions des méthodes pour analyser les sutures de lentilles, la morphologie des cellules en fibres corticales et les aspects du noyau de l’objectif. Ces approches sont une combinaison de in vitro et in vivo (comparé dans le tableau 1)....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-phenyl-2-thiourea (PTU)	Sigma	P7629	CAUTION – very toxic
4% Paraformaldehyde aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	RT 157-4	CAUTION – health hazard, combustible
Confocal microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
Cryostat	Leica	CM3050S	Objective and chamber temperature set to -21˚C
DAPI	Invitrogen	D1306	CAUTION – irritating to eyes and skin
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128	CAUTION – combustible, penetrates skin
Disposable base mold	VWR Scientific	15154-631
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A
Dumont # 5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040	CAUTION - toxic
Glass bottom microwell dish (35mm petri dish, 14mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Glycerol	Sigma	G2025
huβB1cry:mAppleCAAX DNA construct	Addgene	ID:122451
ImageJ	Wayne Rasband, NIH	v1.51n
Low Melt Agarose (LMA)	Apex	902-36-6
NIS-Elements	Nikon	V 4.5
NIS-Elements AR software	Nikon
Olympus  with a model 2.1.1.183 controller	Olympus Corp	DP70
Olympus microscope	Olympus Corp	SZX12
Phalloidin-Alexa Flour 546	Thermo Fisher	A22283
Phenol Red indicator (1% w/v)	Ricca Chemical Company	5725-16
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Photoshop	Adobe	CS5 v12.0
Photoshop software	Adobe	CS5 v12.0
Plan Apo 60x/1.2 WD objective	Nikon
Power source	Wild Heerbrugg	MTr 22	Or equivalent power source
Slide warmer model No. 26020FS	Fisher Scientific	12-594
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - respiratory system, corrosive to metals
Superfrost/Plus microscope slide	Fisher Scientific	12-550-15
Sylgard 184 silicone Dow Corning	World Prevision Instruments	SYLG184
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583
Triton X-100 BioXtra	Sigma	T9284	CAUTION – Toxic, hazardous to aquatic environment, corrosive
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Vectashield antifade mouting medium	Vector laboratories	H-1000
Wheat Germ Agglutinin (WGA)-Alexa Flour-594	Life Technologies	W11262