JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הציגו כאן הם פרוטוקולים עבור ביוכימית מחוץ למבחנה המשתמשת בתוויות ביוטין שעשוי להיות מתאים באופן נרחב עבור לימוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה.

Abstract

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה לשחק תפקידים חשובים בתהליכים ביולוגיים כגון תמלול, שילוב מחדש, ו-RNA חילוף החומרים. שיטות נסיוניות ללמוד אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות דורשות שימוש בתגי פלורסנט, איזוטופים רדיואקטיביים, או תוויות אחרות כדי לזהות ולנתח מולקולות היעד הספציפי. Biotin, שאינה רדיואקטיבית חומצת גרעין התווית, משמש בדרך כלל בתנועה חשמלית אלקטרופואורית משמרת (EMSA) אבל לא היה מועסק באופן סדיר כדי לפקח על פעילות החלבון במהלך תהליכי חומצות גרעין. פרוטוקול זה ממחיש את כלי השירות של ביוטין תיוג במהלך התגובות אנזימטיות מבחנה, הוכחת כי תווית זו פועלת היטב עם מגוון של ביוכימיים שונים. באופן ספציפי, ביישור עם ממצאים קודמים באמצעות רדיואיזוטופ 32P-התווית מצעים, הוא אישר באמצעות biotin מתויג emsa כי meiob (חלבון מעורב במיוחד בשילוב meiob) הוא חלבון מחייב DNA, כי MOV10 (מ RNA הליקאז) פותר את מבני ה-RNA המסומנים בביוטין, והוא משאיר את התווית ביוטין. מחקר זה מדגים כי ביוטין מסוגל להחליף 32P ב שונים חומצות גרעין הקשורות ביוכימיה ביוכימית הקשורים בתחום החוץ.

Introduction

אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצה מעורבים בתהליכים סלולריים חיוניים רבים כגון תיקון DNA, שכפול, תמלול, עיבוד RNA, ותרגום. אינטראקציות חלבונים עם רצפי DNA ספציפיים בתוך כרומטוטין נדרשים לשליטה הדוקה של ביטוי הגנים ברמה הטרנסספית1. התקנה מדויקת של הפוסטסקריפט של קידוד רבים והתקנת RNAs שאינה מחייבת אינטראקציות נרחבות ומסובכות בין כל חלבון ו-RNA2. שכבות אלה של ביטוי גנטי מנגנון הרגולציה מהווים מפל של אירועים מולקולריים דינמיים, אשר מתואמים על ידי אינטראקציות של שעתוק/אפיגנטי גורמים או RNA-מחייב חלבונים עם מטרות חומצות גרעין שלהם, כמו גם אינטראקציות חלבונים בחלבון. כדי לנתח אם חלבונים בvivo משויכים במישרין או בעקיפין לחומצות גרעין וכיצד מתרחשות שיוכים ומתקרבים, באופן ביוכימיים מתורבת מתנהלים כדי לבחון את הזיקה הקשירה או הפעילות האנזימטית של חלבונים המעניינים ב עוצב מצעים של DNA ו/או RNA.

טכניקות רבות פותחו כדי לזהות ולאפיין חומצות גרעין מתחמי חלבון, כולל משמרת הניידות electrophoretic (emsa), הנקרא גם שיטת לפיגור ג'ל או משמרת הלהקה שיטת3,4,5 . EMSA היא שיטה מגוונת ורגישה ביוכימית המשמשת רבות ללימוד הכריכה הישירה של חלבונים עם חומצות גרעין. Emsa מסתמך על משמרת ג'ל אלקטרופסטי בלהקות, אשר באופן שגרתי דמיינו באמצעות chemiluminescence כדי לזהות תוויות ביוטין6,7, את הזריחה של תוויות fluorophore8,9, או על ידי האדיגרפיה של רדיואקטיבי 32P מדבקות10,11. מטרות אחרות של מחקרים ביוכימיים הם זיהוי ואפיון של פעילות עיבוד חומצות גרעין של חלבונים, כגון תגובות nuclease מבוסס להעריך את מוצרי מחשוף מתוך חומצות גרעין מצעים12, מיכל בן 13 , 14 ו-DNA/RNA מבנה-הרגיעה בחני להעריך את פעילות הליקאז15,16,17.

במסגרת הפעילות האנזימטית הזאת, חומצות הגרעין המסומנות ברדיואיזוטופ או fluorophore המסומנות בדרך כלל כסובסטרטיות בשל רגישותם הגבוהה. ניתוח רדיוגרפים של תגובות אנזימטיות הכרוכות ב- 32P המסומן באמצעות רדיומשדרים שנמצאו רגישים לבין18. עם זאת, במספר גדל והולך של מעבדות בעולם, השימוש ברדיואיזוטופים מוגבל או אסור אפילו בשל הסיכונים הבריאותיים הקשורים לחשיפה פוטנציאלית. בנוסף לחששות ביולוגיים, החסרונות האחרים הם הציוד הנדרש הדרוש כדי לנהל את העבודה עם רדיואיזוטופים, נדרש רדיואקטיביות רישיון, קצר מחצית חיים של 32P (כ 14 ימים), הידרדרות הדרגתית של איכות החללית בשל . בדיקת רדיופוליזיס Thus, שיטות חלופיות שאינן איזונושא פותחו (כלומר, תיוג הגשוש עם fluorophores מאפשר זיהוי על ידי הדמיה פלורסנט19). עם זאת, מערכת הדמיה ברזולוציה גבוהה יש צורך בעת שימוש בבדיקות מתויג פלואורוסקופים. Biotin, תווית בשימוש נפוץ, נקשר בקלות קרו ביולוגיים כגון חלבונים וחומצות גרעין. Biotin-streptavidin מערכת פועלת ביעילות ומשפרת את רגישות הזיהוי מבלי להגדיל את הרקע שאינו ספציפי20,21. מלבד emsa, ביוטין משמש רבות עבור טיהור חלבון ו-RNA למשוך למטה, בין השאר22,23,24.

פרוטוקול זה משתמש בהצלחה בחומצות גרעין ביוטין המסומנות כסובסטרטיות לשימוש בלתי-מתורבת ביולוגי הכולל EMSA, בנוסף לתגובות אנזימטית בהן לא נעשה שימוש נפוץ בביוטין. מתחם meiob OB הוא בנוי ושני מוטציות (מוטציה חיתוך נקודה) מבוטאים כמו gt היתוך חלבונים25,26,27, כמו גם עכבר MOV10 רקומביננטי דגל היתוך חלבון16. דו ח זה מדגיש את האפקטיביות של פרוטוקול משולב זה לטיהור חלבונים ולצורך ביוטין מתויג במטרות נסיוניות שונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת חלבון

  1. מבני ביטוי של MEIOB ו-MOV10
    1. ליצור cDNA ביטוי בונה קידוד העכבר באמצעות MEIOB-A, C, ו-E (איור 1א) ו MOV10.
      1. הגדר את תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) לכל רסיס. מערבבים 1 μL של העכבר cDNA (מ C57BL/6 בדיקת העכבר), 1 μL של dNTP, 2 μL של 10 μM קדימה פריימר, 2 μL של 10 הפוך להילוך אחורי, 1 μL של DNA פולימראז, 25 μL של מאגר ה-PCR 2x, ו 18 μL של כפול מזוקקים H2o (ddh2o) בגמר נפח של 50 μL.
        הערה: התחל של הגברה של שברי הגנים הMov10 מפורטים בטבלה 1.
      2. לבצע תגובות PCR באמצעות התוכניות הבאות: 95 ° c עבור 5 דקות, 35 מחזורים של חימום ב 95 ° c עבור 15 s, ריפוי בשעה 64 ° צ' עבור 15 s, הארכה ב 72 ° c עבור 20 s (2 דקות להרחבת אורך מלא MOV10), ואת הסיומת הסופית ב 68 ° c עבור 7 דקות.
        הערה: השתמש פריימר זוג MEIOB-E (F1) ו MEIOB-E-mut (R1) ו MEIOB-E-mut (F2) ו-MEIOB-E (R2) כדי להגביר שני מקטעים המכילים את רצף המוטציות בתוך רצף חופף ב 3 ' ו-5 ' הקצוות, בהתאמה, כדי ליצור תבנית
    2. לנתח את ה-DNA המוגבר על ידי ג'ל אלקטרופורזה, לחתוך את הלהקה בגודל הנדרש מן הג במהירות תחת מנורת UV, ומניחים לתוך צינור צנטריפוגה.
      הערה: גודלי המוצרים הצפויים נראים על ג'ל הצמח עבור MEIOB-A הוא 536 bp, MEIOB-C הוא 296 bp, MEIOB-E הם 312 bp ו 229 bp, ו MOV10 הוא ב3015 bp.
    3. לטהר את ה-DNA של ה-PCR עם ערכת חילוץ ג'ל בעקבות פרוטוקול היצרן.
      1. הוסף כמות שווה של מאגר המסת לתוך צינור הצנטריפוגה משלב 1.1.2 ולהמיס ג'ל באמבט מים 50-55 ° c עבור 5-10 דקות, להבטיח כי חתיכות ג'ל להמיס לחלוטין. צנטריפוגה לזמן קצר כדי לאסוף כל טיפות מהקיר של הצינור.
        הערה: ריכוז מסה/נפח של ג'ל ומאגר המסת הוא 1 מ"ג/μL.
      2. מקם את העמודה ספיחה בצינור האוסף, להעביר את הפתרון המכיל את קטע ג'ל מומס לעמודה ספיחה ו צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות.
      3. למחוק את פילטרט בחלק התחתון של צינורות האוסף. הוסף 600 μL של מאגר הכביסה לעמודה, צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות, ולמחוק את filtrate.
      4. חזור על שלב 1.1.3.3 פעם אחת.
      5. מניחים את העמודה בחזרה לתוך צינור האוסף, ואת צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 2 דקות כדי להסיר את כל מאגר הכביסה הנותרים.
      6. מניחים את העמודה ספיחה בצינור הצנטריפוגה 1.5 mL מעוקר, להוסיף 50 μl של ddh2O למרכז של עמודה ספיחה צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 1 דקות. למדוד את ריכוז ה-DNA של להתחמק באמצעות ספקטרוסקופיה.
    4. הגבלת העיכול של פלמידים
      1. תקציר pGEX-4T-1 וקטור עם BamHI ו NotI. כדי לעשות זאת, לערבב 4 μg של pGEX-4T-1 וקטור, 5 μL של מאגר תקציר 10x, 1 μL של BamHI, ו 1 μL של NotI ו ddH2O לנפח התגובה הסופי של 50 μl. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h.
      2. לעכל pRK5 וקטור עם BamHI ו-XhoI על ידי ערבוב 4 μg של pRK5 וקטור, 5 μL של מאגר תקציר 10x, 1 μL של BamHI, ו 1 μL של XhoI ו ddH2O לנפח התגובה הסופי של 50 μl. מודטה ב 37 ° c עבור 2 h.
    5. לנתח את ה-DNA וקטור על ידי ג'ל אלקטרופורזה, לחתוך את הלהקה בגודל הרצוי מן הג במהירות עם אזמל מתחת למנורה UV ולמקם אותו שפופרת צנטריפוגה.
    6. לטהר את ה-DNA וקטורי עם ערכת החילוץ ג'ל כמו 1.1.3 בעקבות ההוראה של היצרן.
      הערה: אורך הפלמידים: pGEX-4T-1, 4.4 kb; . pRK5, 4.7 kb
    7. הגדרת תגובת רקומביננטי לתקן סטנדרטי על ידי שילוב 0.03 pmol של וקטור לינסיאן, 0.06 pmol של רסיס cdna, 2 μl של ליגאז, ו 4 μl של מאגר ליגאז 5x ו ddh2O בנפח התגובה הסופי של 10 μl.
      הערה: שיבוט MEIOB-A, C, ו-E לתוך וקטור pGEX-4T-1 ו MOV10 לתוך וקטור pRK5.
    8. מודקון את התערובת ב 37 ° c עבור 30 דקות, ולאחר מכן לצנן את התגובה מיד 5 דקות על הקרח. שינוי צורה של MEIOB רקומביננטי מפלסטיק לתוך BL21 חיידקים MOV10 רקומביננטי פלמידים לתוך DH5α חיידקים.
      הערה: בדוק את כל המבנים הרקומביננטי על-ידי רצפי הרצף של Sanger.
    9. הכן מניות גליצרול של תרבויות חיידקית המכילה רקומביננטי פלמידים מאומת על ידי הוספת נפח שווה של 50% גליצרול לתרבויות נוזלי, ולאחסן ב-80 ° c.
      הערה: עבור כל ניסוי שלאחר מכן, רצף את החיידקים מן גליצרול מניות לתוך צלחת אגר טרי ולהשתמש במושבה אחת להרחבת כמתואר בשלב 1.2.
  2. תמציות חלבון MEIOB מחיידקים
    1. בחר מושבה אחת של כל מאמץ BL21 מנוכר עם הריק או רקומביננטי pGEX-4T-1 פלסטלינה מאומת על ידי רצף ואיחסן ב 3 mL LB המכיל 100 μg/mL אמפיצילין. לגדול בלילה ב 37 ° c עם טלטול ב 220 סל ד.
    2. אינוחישוב 300 mL LB המכיל 100 μg/mL אמפיצילין מ 3 ל לילה תרבות (משלב 1.2.1). לגדל את התרבויות עם טלטול ב 37 ° צ' עבור 2 h עד OD600 מגיע 0.5-1.0.
    3. הגבר את ביטוי החלבון על-ידי הוספת איזופרופילי ביתא-D-thiooside (IPTG) לריכוז הסופי של 0.2 מ"מ. מודאת התרבויות לתוספת 3 h עם טלטול ב 180 סל ד ו 18 ° c.
    4. צנטריפוגה את התרבות החיידקית ב-3,500 x g ו -4 ° c עבור 20 דקות.
    5. השהה מחדש את הגלולה ב -20 מ ל של מאגר הפוספט הממלוחים (DPBS) של הקרח הקר. Sonicate הבולם החיידקי על קרח עבור 25 מחזורים קצרים 10 s התפרצויות (כוח פלט 20%) ואחריו 2-3 s נח על הקרח.
    6. צנטריפוגה את הליפוסט ב 12,000 x g ו 4 ° צ' עבור 15 דקות. העבירו את כל הסופראנט. לשפופרת חדשה
    7. . חרוזי טרום-שטיפה
      1. הוסף 300 μL של חרוזים מספרד לצינור מחדש של 15 מ ל ולשטוף את החרוזים עם 10 מ ל של מאגר ה-PBS קר קרח.
      2. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° צ' עבור 1 דקות כדי גלולה החרוזים ולמחוק את הפתרון לשטוף.
    8. מוסיפים את הליפוסט לחרוזים שנשטפו ב-4 ° c עבור 2 h. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° c עבור 1 דקות כדי הגלולה החרוזים. לשטוף את החרוזים ב 10 מ ל של הקרח קר PBS 8x.
    9. Elute החרוזים עם 1 מ ל של מאגר להתחמק (10 מ"מ גלוטתיון 50 mM טריס-HCl ב-pH 8.0) 6x, הדגירה ב 4 ° צ' עבור 10 דקות לפני כל צעד הימנעות. צנטריפוגה ב 750 x g ו 4 ° צ' עבור 1 דקות כדי לגלולה את החרוזים. לאסוף ולבריכה את 6 שברים.
    10. להעביר את החלבונים לתוך מסנן צנטריפוגלי ולהתרכז על ידי צנטריפוגה ב 7,500 x g כדי לקבל את הנפח הסופי של 100-200 μl.
  3. תמציות חלבון MOV10 מתאי HEK293T
    1. מאוד מבטאים את החלבונים הMOV10 בתאי HEK293T מתורבתים.
      1. הכן MOV10-pRK5 פלמיד בריכוז > 500 ng/μL.
      2. הזרע HEK293T תאים ב 15 ס מ מנות. כאשר צפיפות התא מגיע ~ 70%-90%, להחליף את מדיום התרבות התא עם מדיום משתנה הנשר החדש של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% סרום עוברי העובר (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין.
      3. עבור מעבר אחד, לדלל 60 μg של ה-DNA MOV10-pRK5 פלמיד ב 3 מ ל של מדיום סרום מופחת, לאחר מכן להוסיף 120 μL של הזיהום משפר את מגיב, ומערבבים היטב.
      4. בצינור נפרד לדלל 90 μL של הזיהום מגיב עם 3 מ ל של בינוני סרום מופחת (ללא פניצילין-סטרפטומיצין) ומערבבים היטב.
      5. הוסיפו את הדנ א המדולל לכל שפופרת של מגיב מדולל בזיהום. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 15 דקות.
      6. הוסיפו את תערובת התרגום לתרבות התא ותאי תרבות עבור ~ 36-48 h.
    2. לאחר 36-48 h, לאסוף תאים מכל צלחת בצינור 50 mL. צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. לשטוף כל גלולה עם 10 מ ל של הקרח קר PBS, ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    3. השהה מחדש את הגלולה ב 3 מ ל של מאגר פירוק תאים המכיל חומצה מעכב פרוטאז חינם. מודקון למשך 30 דקות על הקרח. צנטריפוגה את הליפוסט ב 20,000 x g ו 4 ° צ' עבור 20 דקות.
    4. הוסף 100 μL של חרוזים נגד דגלים מגנטיים לכל מנה של תאים בצינור 1.5 mL.
    5. לשטוף את החרוזים המגנטיים 2x עם K150 מאגר (50 mM HEPES ב-pH 7.5, 150 mM KoAc, 1 מ"מ DTT, 0.1% NP-40).
      1. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים 1 מ ל של מאגר K150 קר קרח.
      2. מודאת החרוזים מגנטי עבור 2 דקות ב 4 ° צ' עם סיבוב עדין ואת הגלולה המגנטי חרוזים בעזרת מגנט. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
    6. הוסיפו את החרוזים המגנטיים לתא הליפוסט-סופרנט משלב 1.3.3 ו-דגירה ב -4 ° c עבור 2 h.
    7. לשטוף את החלבון מאוגד חרוזים מגנטיים 3x עם K150 מאגר, אז 2x עם K150 המכיל 250 מ"מ הנאל, אז 3x עם מאגר K150 כמו 1.3.5.
    8. השהה את החרוזים ב-300 μL של מאגר הדגל (100 מ"מ מילימטר, 20 מ"מ Tris-HCl ב-pH 7.5, 5 מ"מ MgCl2, 10% גליצרול), להוסיף פפטיד הדגל לריכוז הסופי של ה0.5 μg/μl, ו דגירה עם חרוזים על מסובבי ב 4 ° צ' עבור 1 h , ולאחר מכן הגלולה חרוזים מגנטיים בעזרת מגנט.
    9. לאסוף את סופרנטאנט המכיל את החלבונים MOV10, לקבוע את הריכוז, ולאחסן ב-80 ° צ' לשימוש עתידי.

2. הכנה לחומצות גרעין

  1. רכישת ה-DNA ו-RNA פורוזימטר (oligos) עם או בלי תוויות ביוטין ממקור מתאים. לדלל כל oligo ב RNase-חינם ddH2O כדי 20 μm ולשמור אותו ב-80 ° c לשימוש עתידי.
    הערה: רצפי oligo של DNA/RNA מצעים המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלה 2.
  2. הכינו את התערובת הבאה עבור רנ א כפולה (dsRNA) התגובה ריפוי MOV10 האליאז הפעילות שיטה: לערבב 60 mM N-2-הידרופרמיאזין-N-ethane-חומצה גופרתית (HEPES) ב-pH 7.5, 6 מ"מ KCl, 0.2 mM MgCl2 ו RNase-חינם ddh2 O בנפח התגובה הסופי של 20 μL.
  3. אל RNA אוליגוס ליצור דופלקס ה-RNA על ידי חימום תערובת של סטרנד ביוטין המסומן העליון (2 μM, הריכוז הסופי) ו 1.5-קיפול של סטרנד התחתון משלימה ללא תווית במאגר הריפוי (שלב 2.2) ב 95 ° צ' עבור 5 דקות, ולאחר מכן לצנן אותו לחדר טמפרטורה (RT).

3. מחוץ למבחנה ביוכימית

  1. תגובות EMSA ו-אנזימטיות
    1. עבור שיטת emiob אמסה, לערבב 50 mM Tris HCl ב-pH 7.5, 2 מ"מ MgCl2, 50 Mm הנאקל, 10 מ"מ edta, 2 מ"מ dithioitol (dtt), 0.01% NP-40, 0.8 מ"מ (או ריכוזים רלוונטיים אחרים כפי שמוצג באיור 2 ואיור 3) חלבון מיובי, ו 10 ביוטין-מתויג מאוליונודיאודות ו-ddH2O בנפח התגובה הסופי של 20 μl. דגירה ב RT עבור 30 דקות, ולהוסיף 5x מאגר לעצור (125 mM EDTA, 50% גליצרול) כדי לעצור את התגובה.
    2. הגדרת תגובות הפעילות של MEIOB כמתואר בשלב 3.1.1 אך ללא תוספת של 10 מ"מ EDTA.
    3. עבור הMOV10 של הפעילות הליקאז, לערבב 50 mM טריס-HCl ב-pH 7.5, 20 מ"מ koac, 2 מ"מ mgcl2, 0.01% NP-40, 1 מ"מ dtt, 2 U/μl rnase מעכב, 10 ננומטר ביוטין התווית רנ א, 2 מ"מ-אדנוזין טריפוספט (ATP), 100 nm מלכודת ה-rna, ו 20 ng של חלבון MOV10 > 2O בנפח התגובה הסופי של 20 μL. מודיית את תערובת התגובה ב 37 ° c עבור 10 דקות, 30 דקות, ו 60 דקות. להוסיף את מאגר העצירה 5x כדי לעצור את התגובה.
      הערה: מלכודת RNA, ביוטין-ללא תווית oligo עם רצף, משלימה את התווית oligo, אשר מונע את dsRNA הסרת הפצע מפני ריפוי שוב.
  2. ג'לים פוליאקרילאמיד
    1. לשטוף את צלחות ג'ל (16 ס"מ x 16 ס מ) ו 1.5 מ"מ מסרקים. להרכיב יחידות אלקטרופורזה ג'ל.
    2. כדי להכין 10% פוליאקרילאמיד ג'ל, מערבבים 14 מ ל של ddH2O, 1.25 מ ל של 10X טריס-חומצה BORIC (tbe), 8.3 ml של 30% אקרילאמיד, 1.25 ml של 50% גליצרול, 187.5 μl של 10% אמוניום (APS) המוכן טרי, ו-12.5 μl של טטרמתתילילאדיאמין (טמאד).
    3. כדי להכין למעלה מ -20% מקורי, מערבבים 5.5 mL של ddH2O, 1.25 ml של 10X tbe, 1.25 ml של 50% גליצרול, 16.7 ml של 30% אקרילאמיד, 187.5 μl של 10% APS, ו 12.5 ΜL של temed.
    4. יוצקים את התמיסה אקרילמיד לג ומכניסים את המסרק. תנו לתערובת לעבור במשך כ -30 דקות.
  3. ג'ל ריצה
    1. להסיר את המסרק, למלא את הטנקים עם האלקטרופורזה פועל מאגר (0.5 x TBE).
    2. לשטוף את הבארות לדוגמה עם מאגר של 0.5 x TBE, ולאחר מכן להפעיל מראש את הג ב 100 V על הקרח עבור 30 דקות. החלף את המאגר הפועל באמצעות האפשרות החדשה של 0.5 x TBE.
    3. טען 20-25 μL דגימות לכל טוב.
    4. השתמש בג'ל אקרילי מקורי של 10% לצורך השימוש ב-EMSA ובג'ל אקרילי טבעי של 20% לצורך האנזימטי. הפעל אלקטרופורזה ב 100 V על אמבט הקרח עד הסמן הכחול ברומרופנול הועבר לרבע התחתון של הג.
  4. פרק את לוחיות הג'ל, חתוך את הג על-ידי הסרת בארות טעינה ונתיבים שאינם בשימוש. הניחו את הג במאגר של 0.5 x TBE.
  5. חותכים את נייר הסינון ואת קרום ניילון לגודל של ג'ל. הרטבת מוקדם את נייר הסינון הנקי וקרום הניילון.
  6. אסוף את המחסנית להעברה.
    1. הניחו את הקרום הרטוב מראש על נייר הסינון הטרום-רטוב.
    2. הניחו את הג'ל על הקרום.
    3. כסו את הג בשכבה נוספת של נייר סינון טרום-רטוב.
    4. להסיר את כל בועות האוויר על ידי גלגול צינורות נקי מהמרכז לקצה.
  7. להעביר את הדגימות מן הג אל הקרום במנגנון electrophoretic חצי יבש ב 90 mA עבור 20 דקות.
  8. הפסק את ההעברה ולאחר מכן ייבש את הקרום על נייר סינון חדש עבור 1 דקות.
  9. Crosslink את הדגימות על ידי הקרנת הממברנה ב 120 mJ/cm2 עבור 45-60 s ב-UV-light הקשר מצויד עם 254 ננומטר (הפונקציה crosslink אוטומטית). האוויר יבש את קרום ב RT עבור 30 דקות.
  10. גילוי כימומימיננסאואלי
    1. פרוטוקול 1: השתמש בנפח סטנדרטי של ערכת זיהוי הגרעין של הכלמימיננטהמסחרי.
      1. הוסף 20 מ ל של מאגר חוסם את הקרום ו-דגירה עבור 15-30 דקות עם טלטול עדין על מסובבי ב 20-25 rpm.
      2. הכנת פתרון מאגר המשלים/חוסם על ידי הוספת 66.7 μL התייצב streptavidin-חזרת peroxidase המשלים ל 20 מ ל של חסימה מאגר.
      3. הסר בעדינות את המאגר החוסם והחלף אותו במאגר מתואם/חסום. דגירה עבור 15 דקות על מסובבי ב 20-25 סל ד.
      4. לשטוף את הממברנה 4x עם טלטול ב 40-45 סל ד עבור 5 דקות כל אחד.
      5. הוסף 30 מ ל של מאגר המצע בסיס לקרום. דגירה הקרום עבור 5 דקות עם טלטול ב 20-25 סל ד.
      6. הכנת פתרון עבודה מצע על-ידי הוספת 6 מ ל של לומירול/פתרון שיפור 6 מ ל של פתרון תחמוצת יציבה. . הימנע מהאור
      7. לכסות את כל המשטח של הקרום עם פתרון עבודה מצע ו מודטה עבור 5 דקות.
      8. לסרוק את קרום במערכת הדמיה כימית עבור 1-3 s.
    2. פרוטוקול 2: השתמש 2x מדולל כמקמינטהגרעין לזיהוי חומצה מערכת ובצע את השלבים 3.10.1.1-3.10.1.8.
    3. פרוטוקול 3: שימוש בריאגנטים מתוצרת עצמית6.
      1. הכנת מאגר חוסם: לערבב 0.1 M טריס-HCl ב-pH 7.5, 0.1 M הנאל, 2 מ ר MgCl2, ו-3% בסרום פרה השבר V. AP 7.5 מאגר: לערבב 0.1 M-HCl ב-pH 7.5, 0.1 m הנאל, ו 2 מ"מ MgCl2. AP 9.5 מאגר: mix 0.1 M Tris-HCl ב-pH 9.5, 0.1 M הנאל, ו 50 mM MgCl2. מאגר TE: לערבב 10 mM טריס-HCl ב-pH 8.0, 1 מ"מ EDTA ב-pH 8.0.
      2. להשרות את הקרום בתוך חסימת מאגר ב 30 ° צ' עבור 1 h.
      3. הוסף 8.5 μL של streptavidin בסיסי פוספספטאז כדי 10 מ ל של AP 7.5 מאגר. טלטל את הקרום בעדינות בפתרון זה ב-RT למשך 10 דקות. אז, לשטוף את הממברנה 2x ב 15 מ ל של AP 7.5 מאגר עבור 10 דקות.
      4. לשטוף את הקרום עוד פעם אחת 20 מ ל של AP 9.5 מאגר עבור 10 דקות. הוסף 20 מ ל של מאגר TE כדי לעצור את התגובה.
      5. להוסיף 7.5 mL של פתרון הפיתוח על הקרום, ולסרוק את קרום במערכת הדמיה כימית עבור 1-3 s.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מבנה החלבון של MEIOB ובניית הביטויים המשמשים במחקר זה מומחשים באיור 1א. OB קפלים ב MEIOB הם קומפקטי כמו חבית מבנים שיכולים לזהות ולתקשר עם אחד תקוע חומצות גרעין. אחד מתחומי OB (aa 136-307, לבנות A) נקשר DNA אחד תקוע (ssDNA), החלבון נחתך (aa 136-178 הגישות, לבנות C) ואת הטופס מוטציה הנקודה (R235...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

חקירת אינטראקציות חלבון-גרעין של חומצות הוא קריטי להבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס תהליכים ביולוגיים מגוונים. לדוגמה, meiob הוא חלבון ספציפי להעיד חיוני עבור meiob ופריון ביונקים25,26,27. MEIOB מכיל תחום OB הנקשר ל-DNA בודד נטוש ומוצגים 3 ' כדי 5 ' הפע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

אין קונפליקטים של עניין מוצהר.

Acknowledgements

אנו מודים P. ג'רמי וואנג (אוניברסיטת פנסילבניה) עבור עריכות ודיונים מועילים. אנחנו גם מודים Sigrid Eckardt לעריכת שפה. ק. ז. היה נתמך על ידי תוכנית מפתח לאומי R & D של סין (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) והקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31771653). ל. י. הייתה נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81471502, 31871503) ותוכנית חדשנית ויזמית של מחוז ג'יאנגסו. J. N. נתמך על ידי ג'ה-ג'יאנג מדע הרפואה והטכנולוגיה פרויקט (2019KY499). מ. ל. הייתה נתמכת על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31771588) ו-1000 תוכנית כישרון הנוער.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
CentrifugeEppendorf, Germany5242R
Chemiluminescent Imaging SystemTanon, China5200
Digital soniferBranson, USABBV12081048A450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotterHoefer, USATE77XP
Tube Revolver Crystal, USA3406051
UV-light cross-linkerUVP, USACL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Milipore, USAUFC8010964 ml/10 K
Nylon membraneThermo Scientific, USATG263940A
TC-treated Culture DishCorning, USA430167100 mm 
TC-treated Culture DishCorning, USA430597150 mm 
Microtubes tubesAXYGEN, USAMCT-150-C1.5 mL 
TubesCorning, USA43079115 mL
Reagents 
AmpicillinSunShine Bio, China8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beadsSigma, USAM8823
ATPThermo Scientific, USA591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotime, ChinaC3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent Sigma, USA107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit Vazyme, ChinaC112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection KitThermo Scientific, USAT1269950
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
DMEMGibco, USA10569044
DPBS bufferGibco, USA14190-136
EDTAInvitrogen, USAAM9260G0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktailRoche, USA04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit Vazyme, China 
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini KitVazyme, ChinaDC301-01
FBSGibco, USA10437028
FLAG peptideSigma, USAF4799
GlycerolSigma, USASHBK3676
GST Bulk KitGE Healthcare, USA27-4570-01
HEPES bufferSigma, USASLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific, USA34060
KoAcSangon Biotech, China127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection ReagentThermo Scientific, USAL3000001
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G1 M
NaClInvitrogen, USAAM9759
 		5 M 
NP-40Amresco, USAM158-500ML
Opti-MEM mediumGibco, USA31985062
PBSGibco, USA10010023PH 7.4
RNase InhibitorPromega, USAN251B
Streptavidin alkaline phosphatasePromega, USAV5591
TBEInvitrogen, USA15581044
Tris-HCI Buffer Invitrogen, USA155670271 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer Invitrogen, USA155680251 M, PH 8.0
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560

References

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788(2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149EMSAbiotinnuclease

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved