ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

要約

ここに示すビオチン標識を用いてインビトロ生化学アッセイを用い、タンパク質-核酸相互作用の研究に広く適用可能なプロトコルを示す。

要約

タンパク質と核酸の相互作用は、転写、組み換え、RNA代謝などの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。タンパク質と核酸の相互作用を研究する実験的方法では、蛍光タグ、放射性同位体、またはその他の標識を使用して特定の標的分子を検出して分析する必要があります。非放射性核酸標識であるビオチンは、電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)で一般的に使用されていますが、核酸プロセス中のタンパク質活性を監視するために定期的に使用されていません。このプロトコルは、インビトロ酵素反応中のビオチン標識の有用性を示し、このラベルがさまざまな生化学アッセイの範囲でうまく機能することを実証する。具体的には、放射性同位^体32P標識基質を用いたこれまでの知見と整合して、MEIOB(特異的にマイオティック組換えに関与するタンパク質)がDNA結合タンパク質であるビオチン標識EMSAを介して確認され、そのMOV10(RNAヘリケース)は、ビオチン標識RNA二重構造を解決し、MEIOBがビオチン標識された一本鎖DNAを切断します。本研究は、ビオチンが様々な核酸関連生化学アッセイで32Pをインビトロで置換できることを示している。

概要

タンパク質-核酸相互作用は、DNA修復、複製、転写、RNA処理、翻訳などの多くの必須細胞プロセスに関与しています。クロマチン内の特定のDNA配列とのタンパク質相互作用は、転写レベル1における遺伝子発現の厳密な制御のために必要とされる。多数のコードおよび非コードRNAの正確な転写後調節は、任意のタンパク質とRNA2との間の広範で複雑な相互作用を必要とする。遺伝子発現調節機構のこれらの層は、転写/エピジェネティック因子またはRNA結合タンパク質の相互作用によって調整される動的分子間イベントのカスケードを含み、ならびにその核酸標的とのRNA結合タンパク質とタンパク質とタンパク質の相互作用。生体内のタンパク質が直接または間接的に核酸と関連しているかどうかを調べるために、そのような関連がどのように起こり、終わるかを調べるために、インビトロ生化学アッセイを行い、目的のタンパク質の結合親和性または酵素活性を調べるために実施される。DNAおよび/またはRNAの設計された基板。

電気泳動性シフトアッセイ(EMSA)を含む核酸タンパク質複合体を検出し、特徴付けるために多くの技術が開発され、ゲル遅滞アッセイまたはバンドシフトアッセイ3、4、5とも呼ばれる.EMSAは、核酸とのタンパク質の直接結合を研究するために広く使用されている汎用性と敏感な生化学的方法です。EMSAは、ビオチン標識6、7、蛍光標識8、9、またはによって検出するために化学発光を使用して日常的に視覚化されるバンドのゲル電気泳動シフトに依存しています。^放射性32Pラベルの自動無線撮影^10,11.生化学的研究の他の目的は、核酸基質からの切断産物を評価するヌクレアーゼベースの反応などのタンパク質の核酸処理活性の同定と特徴付け^{である12、13歳,14}およびDNA/RNA構造アンワインディングアッセイは、ヘリケース活性^を評価する15、16、17.

このような酵素活性アッセイでは、放射性同位体標識または蛍光色素標識核酸は、その高感度のために基質として使用されることが多い。^32P標識放射トレッサーを含む酵素反応の放射線写真の分析は、敏感で再現可能であることが判明^した18.しかし、世界で増加する研究室では、放射性同位体の使用は、潜在的な暴露に関連する健康上のリスクのために制限または禁止されています。バイオセーフティの懸念に加えて、放射性同位体、必要な放射能ライセンス、32Pの短い半減期(約14日間)、およびプローブ品質の徐々な劣化を行うために必要な機器が他に必要です。放射線を通して従って、代替の非同位体法が開発されている(すなわち、蛍光球でプローブを標識することで蛍光^{イメージング19}による検出を可能にする)。しかし、蛍光標識プローブを使用する場合は、高解像度のイメージングシステムが必要です。一般的に使用される標識であるビオチンは、タンパク質や核酸などの生体高分子に容易に結合します。ビオチン連鎖生物ビンシステムは効率的に動作し、非特異的な背景20、21を増加させることなく検出感度を向上させます。EMSAに加えて、ビオチンはタンパク質精製およびRNAプルダウンに広く使用され、その中で22、23、24である。

このプロトコルは、ビオチンが一般的に使用されていない酵素反応に加えて、EMSAを含むインビトロ生化学アッセイの基質としてビオチン標識核酸を使用することに成功しました。MEIOB OBドメインが構築され、2つの変異体(切り捨ておよび点突然変異)は、GST融合タンパク質25、26、27、ならびにマウスMOV10組換えFLAG融合タンパク^質16として発現される。本報告では、タンパク質精製およびビオチン標識アッセイに対するこの組み合わせプロトコルの有効性を強調する。

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プロトコル

1. タンパク質製剤

1. MEIOB および MOV10 式コンストラクト
   1. cDNA発現を生成し、マウスMEIOB-A、C、およびE(図1A)およびMOV10を符号化する。
      1. 各フラグメントに対するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)反応を設定する。マウスcDNAの1 μL(C57BL/6マウス試験から)、dNTPの1μL、10μM前方プライマーの2μL、10μMの逆プライマーの2μL、DNAポリメラーゼの1μL、2x PCRバッファーの25 μL、および18 μLの二重蒸留H2 O(ddH₂O)を混合する50 μLの容積。
         注:MeiobおよびMov10遺伝子断片の増幅のためのプライマーは、表1にリストされている。
      2. 以下のプログラムを使用してPCR反応を行います:95°Cを5分間、15sの95°Cで35サイクルの加熱、15sの64°Cでのアニーリング、20sの72°Cでの延長(全長MOV10を延長するための2分)、および7分間の68°Cでの最終延長を行います。
         注: プライマー ペア MEIOB-E (F1) と MEIOB-E-mut (R1) と MEIOB-E-mutット (F2) と MEIOB-E(R2) を使用して、3' と 5' の両端で重なり合うシーケンス内の変異シーケンスを含む 2 つのセグメントを増幅し、それぞれ変異型 PCR テンプレートを生成します。
   2. ゲル電気泳動によって増幅されたPCR DNAを分析し、必要なサイズのバンドをUVランプの下で素早くゲルから切断し、遠心管に入れます。
      注:MEIOB-Aのアガロースゲルに表示される期待される製品サイズは536bp、MEIOB-Cは296bp、MEIOB-Eは312 bpおよび229 bp、MOV10は3015 bpです。
   3. 製造元のプロトコルに従ってゲル抽出キットでPCR DNAを精製します。
      1. ステップ1.1.2から遠心管に同量の溶解バッファーを追加し、50-55°Cの水浴でゲルを5〜10分間溶かし、ゲル片が完全に溶けるようにします。チューブの壁から任意の液滴を収集するために簡単に遠心分離機。
         注:ゲルおよび溶解バッファーの質量/体積濃度は1mg/μLです。
      2. 吸着カラムを回収管に入れ、溶解したゲル断片を含む溶液を吸着カラムに移し、遠心分離機を12,000×gで2分間回す。
      3. 回収管の下部にある濾過を破棄します。カラムに600μLの洗浄バッファーを追加し、1分間12,000 x gで遠心分離機を加え、濾液を廃棄します。
      4. 手順 1.1.3.3 を 1 回繰り返します。
      5. カラムを回収管に戻し、遠心分離機を12,000 x gで2分間取り除き、残りの洗浄バッファーをすべて取り除きます。
      6. 吸着カラムを1.5mLの殺菌遠心管に入れ、吸着カラムの中心に50μLのddH2Oを加え、遠心分離機を1分間12,000xgで測定します。
   4. プラスミドの消化制限
      1. BamHIおよびNotIを使用してpGEX-4T-1ベクターをダイジェストする。これを行うには、pGEX-4T-1ベクターの4 μg、10倍のダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびNotIとddH₂Oの1 μLを50μLの最終反応量に混合します。37 °Cで2時間インキュベートします。
      2. pRK5ベクターの4μg、10倍ダイジェストバッファーの5μL、BamHIの1μL、およびXhoIおよびddH₂Oの1μLを50μLの最終反応体積に混合することにより、BamHIおよびXhoIを使用したダイジェストpRK5ベクトルを消化する。37 °Cで2時間インキュベートします。
   5. ゲル電気泳動によってベクターDNAを分析し、UVランプの下のメスでゲルから所望のサイズのバンドを素早く切断し、遠心管に入れます。
   6. 製造元の指示に従って、ゲル抽出キットを 1.1.3 としてベクター DNA を精製します。
      注:線形プラスミドの長さ:pGEX-4T-1、4.4 kb;pRK5、4.7 kb。
   7. 線形化ベクターの0.03 pmol、cDNA断片の0.06 pmol、2 μLのリガーゼ、5xリガーゼバッファーの4μL、およびddH2 Oを10μLの最終反応量で組み合わせて標準的な組換えライゲーション反応を設定します。
      注: MEIOB-A、C、および E を pGEX-4T-1 ベクトルにクローンし、MOV10 を pRK5 ベクトルにします。
   8. 37°Cで30分間インキュベートし、その後、氷上で5分間反応を直ちに冷却します。MEIOB組換えプラスミドをBL21細菌およびMOV10組換えプラスミドをDH5α細菌に変換する。
      注: サンガー シーケンスによってすべての組み換えコンストラクトを確認します。
   9. 液体培養物に50%のグリセロールを同量添加して確認済みの組換えプラスミドを含む細菌培養物のグリセロールストックを調製し、-80°Cで保存する。
      注:その後の実験のたびに、グリセロールストックから新鮮な寒天プレートに細菌を取り出し、ステップ1.2で説明するように、単一のコロニーを使用して拡張を行います。
2. 細菌からのMEIOBタンパク質抽出物
   1. 100 μg/mLアンピシリンを含む3mL LBでシーケンシングおよび接種により検証された空または組換えpGEX-4T-1プラスミドでトランスフェクトされた各BL21株の1つのコロニーを選択します。220 rpmで振りながら37°Cで一晩成長します。
   2. 3 mL の一晩培養から 100 μg/mL アンピシリンを含む 300 mL LB を接種します (ステップ 1.2.1 から)。OD₆₀₀が0.5-1.0に達するまで2時間37 °Cで揺れで培養物を成長させる。
   3. イソプロピルβ-D-チオガラクピラノシド(IPTG)を0.2mMの最終濃度に添加してタンパク質発現を誘導する。180 rpmおよび18 °Cで振盪と付加的な3時間の培養物をインキュベートする。
   4. 細菌培養を3,500xg、4°Cで20分間遠心分離します。
   5. 冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理食生(DPBS)バッファーの20 mLでペレットを再中断します。短い10sのバースト(出力電力20%)の25サイクルのための氷の上の細菌の懸濁液を超音波処理続いて2-3で氷の上に置く。
   6. 12,000 x gと4 °Cで15分間、ライサテを遠心分離し、すべての上清を新鮮なチューブに移します。
   7. ビーズを洗浄する前に。
      1. 新鮮な15 mLチューブにグルタチオンセファローズビーズを300μL加え、10mLの氷冷PBSバッファーでビーズを洗浄します。
      2. 750 x gおよび4 °Cで遠心分離機はビーズをペレットし、洗浄液を捨てる1分間。
   8. 洗浄したビーズにライサートを加え、ビーズをペレットに1分間750xgと4°Cで2°C4°Cでインキュベートします。 ビーズを10mLの氷冷PBS 8xですすいでください。
   9. 溶出バッファーの1mL(pH 8.0で50mMトリス-HClで10mMグルタチオン)6xでビーズを溶出し、各溶出工程の前に10分間4°Cでインキュベートする。750 x gおよび4 °Cで遠心分離機を1分間ビーズをペレットする。6分の1を収集し、プールします。
   10. elutedタンパク質を遠心フィルターに移し、7,500 x gの遠心分離によって濃縮し、100-200 μLの最終体積を得る。
3. HEK293T細胞からのMOV10タンパク質抽出物
   1. 培養HEK293T細胞におけるMOV10タンパク質を一過性に発現させる。
      1. MOV10-pRK5プラスミドを濃度>500 ng/μLで調製します。
      2. 15 cm皿の種子HEK293T細胞。細胞密度が〜70%〜90%に達すると、細胞培養培地を10%の胎児ウシ血清(FBS)および1%ペニシリン連鎖筋ミンを含む新鮮なダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)に置き換える。
      3. 1回のトランスフェクションでは、減らされた血清培地の3mLでMOV10-pRK5プラスミドDNAの60μgを希釈し、次いでトランスフェクションエンハンサー試薬の120μLを加え、よく混合する。
      4. 別のチューブで減らされた血清媒の3 mLを持つトランスフェクション試薬の90 μLを希釈し(ペニシリン-ストレプトマイシンなし)とよく混合する。
      5. 希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈DNAを添加する。室温で15分間インキュベートします。
      6. トランスフェクション混合物を細胞培養に加え、〜36〜48時間培養した。
   2. 36-48 hの後、50 mLチューブで各プレートから細胞を集集める。4 °Cで5分間500 x gの遠心分離機。各ペレットを10mLの氷冷PBSで洗浄し、500 x gで遠心分離して4°Cで5分間細胞を集めます。
   3. 完全なエヒレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)フリープロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファーの3 mLでペレットを再中断する。氷の上で30分間インキュベートします。20,000 x gおよび 4 °C で 20 分間のリサートを遠心分離します。
   4. 1.5 mLチューブに細胞の皿あたり100 μLの抗FLAG磁気ビーズを追加します。
   5. 磁気ビーズをK150バッファで2倍に洗浄します(pH 7.5、150 mM KoAc、1mM DTT、0.1%NP-40)。
      1. 磁気ビーズを1mLの氷冷K150バッファーに再サスペンドします。
      2. 穏やかな回転で4°Cで2分間磁気ビーズをインキュベートし、磁石の助けを借りて磁気ビーズをペレットします。上清を取り除いて捨てます。
   6. ステップ1.3.3から細胞に磁気ビーズを加え、4°Cで2時間インキュベートします。
   7. タンパク質結合磁気ビーズを K150 バッファーで 3 倍洗い、次に 250 mM NaCl を含む K150 で 2x、K150 バッファーを 1.3.5 として 3x 洗浄します。
   8. FLAG溶出バッファーの300 μL(100 mM NaCl、pH 7.5で20mMトリス-HCl、5mM MgCl 2、10%グリセロール)でビーズを再中断し、0.5 μg/μLの最終濃度にFLAGペプチドを加え、4°Cのローターにビーズをインキュベートします。磁石の助けを借りて、磁気ビーズをペレットします。
   9. ELUSE MOV10タンパク質を含む上清を回収し、濃度を決定し、将来の使用のために-80°Cで保存します。

2. 核酸製剤

1. 適切な供給源からビオチン標識の有無にかかわらずDNAおよびRNAオリゴヌクレオチド(オリゴレオチド)を購入する。RNaseフリーddH₂O~20 μMで各オリゴを希釈し、将来の使用のために-80°Cに保ちます。
   注:本研究で使用されるDNA/RNA基板のオリゴ配列は表2に記載されています。
2. MOV10ヘリケース活性アッセイに対する二本鎖RNA(dsRNA)アニール反応に対して以下の混合物を調製する:pH 7.5、6 mM KCl、0.2mM MgCl₂およびRNas-Free ddHで60mM N-2-ヒドロキシチルピペラジン-N-エタンスルホニック酸(HEPES)を混合するOは20μLの最終反応量で。
3. アニールRNAオリゴは、ビオチン標識されたトップストランド(2μM、最終濃度)とアニールバッファー内のその標識されていない相補的な底鎖の1.5倍の混合物を5分間95°Cで加熱し、ゆっくりと部屋に冷却することによってRNA二重を形成する。温度(RT)。

3. インビトロ生化学アッセイ

1. EMSAと酵素反応
   1. MEIOB EMSAアッセイの場合、pH 7.5、2 mM MgCl 2、50mM NaCl、10 mM EDTA、2 mMジチオスレイトール(DTT)、0.01%NP-40、0.8mM(または図2図2図およびMEM3に示すように他の関連濃度)で50mMトリスHClを混合する。20μLの最終反応体積におけるビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびddH2O。RTで30分間インキュベートし、反応を停止するために5xストップバッファ(125 mM EDTA、50%グリセロール)を追加します。
   2. ステップ 3.1.1 に記載されているように MEIOB ヌクレアーゼ活性反応をセットアップしますが、10 mM EDTA を添加せずに設定します。
   3. MOV10ヘリケース活性アッセイの場合は、pH 7.5で50mMトリス-HClを混合し、 20 mM KoAc,2 mM MgCl 2, 0.01% NP-40, 1 mM DTT, 2 U/μL RNase 阻害剤, 10 nM ビオチン標識 RNA 基質, 2 mM アデノシン 三リン酸 (ATP), 100 nM RNA トラップ, MOV10 タンパク質および ddH6 の 20 ng>2Oの最終反応量20μL。反応混合物を37°Cで10分、30分、60分間インキュベートし、5倍のストップバッファーを追加して反応を停止します。
      注:RNAトラップは、ビオチン標識されていないオリゴを配列し、標識されたオリゴに相補性を有し、巻き戻されたdsRNAが再びアニーリングするのを防ぎます。
2. ポリアクリルアミドゲル
   1. ゲルプレート(16 cm x 16 cm)と1.5mmの櫛を洗います。ゲル電気泳動ユニットを組み立てます。
   2. 10%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、 ddH₂Oの14 mL、10xトリスボリン酸EDTA(TBE)の1.25 mL、30%アクリルアミドの8.3mL、グリセロール50%の1.25 mL、10%の187.5 μLの10%の新たに調製されたペルスルフェートアンモニウム(APS)、および12μLを混合するテトラメチルチレンジアミン(TEMED)。
   3. 20%天然ポリアクリルアミドゲルを調製するには、ddH₂Oの5.5mL、10x TBEの1.25 mL、50%グリセロールの1.25 mL、30%アクリルアミドの16.7 mL、10%APSの187.5 μL、およびTEMEDの12.5 μLを混合します。
   4. すぐにゲルにアクリルアミド溶液を注ぎ、櫛を挿入します。混合物を約30分間重合させます。
3. ゲルランニング
   1. 櫛を取り外し、電気泳動実行バッファ(0.5x TBE)でタンクを満たします。
   2. 0.5x TBEバッファーでサンプルウェルをすすいでから、氷の上で100Vでゲルを30分間事前に実行します。
   3. 各ウェルに20~25μLサンプルをロードします。
   4. EMSAアッセイには10%の天然アクリルアミドゲルを使用し、酵素アッセイには20%の天然アクリルアミドゲルを使用します。ブロモフェノールブルーマーカーがゲルの底分に移行するまで、氷浴で100Vで電気泳動を実行します。
4. ゲルプレートを分解し、ローディングウェルと未使用のレーンを除去してゲルをトリミングします。ゲルを 0.5x TBE バッファーに入します。
5. フィルターペーパーとナイロン膜をゲルの大きさに切ります。クリーンフィルターペーパーとナイロン膜をあらかじめ濡らします。
6. 転送用にスタックを組み立てます。
   1. プレウェット膜をウェット前のフィルターペーパーの上に置きます。
   2. ゲルを膜の上に置きます。
   3. ゲルを別のウェルトフィルターペーパーで覆います。
   4. クリーンなピペットを中心から端まで転がして、すべての気泡を取り除きます。
7. 90 mAで半乾燥電気泳動装置でゲルから膜にサンプルを20分間移します。
8. 転写を停止し、新しいフィルターペーパーで膜を1分間乾燥させます。
9. 254 nm電球(自動架リンク機能)を装備したUV光架リンカーで45-60sの120 mJ/cm²で膜を照射することにより、サンプルを架光します。RTで膜を30分間乾燥させます。
10. 化学発光検出
    1. プロトコル1:市販の化学発光核酸検出キットの標準体積を使用する。
       1. 膜に20 mLのブロッキングバッファーを追加し、20-25 rpmで回転子に穏やかな揺れで15〜30分間インキュベートします。
       2. 66.7 μL安定化ストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼコンジュゲートを20mLのブロッキングバッファーに加えてコンジュゲート/ブロッキングバッファー溶液を調製する。
       3. ブロッキング バッファをゆっくりと取り外し、コンジュゲート/ブロッキング バッファに置き換えます。20-25 rpmで回転子で15分間インキュベートします。
       4. 40-45 rpmで5分間振って膜を4倍洗います。
       5. 膜に基板平衡バッファーの30 mLを追加します。20-25 rpmで振って5分間膜をインキュベートします。
       6. 安定な過酸化物溶液の6 mLにルミノール/エンハンサー溶液の6 mLを添加することにより、基板作業溶液を調付します。光を避けてください。
       7. 基板加工液で膜の表面全体を覆い、5分間インキュベートします。
       8. 化学発光イメージングシステムで膜を1-3sでスキャンします。
    2. プロトコル2:2倍希釈市販の化学発光核酸検出キットを使用し、手順3.10.1.1-3.10.1.8に従ってください。
    3. プロトコル 3: 自作試薬⁶を使用します。
       1. ブロッキング バッファーを準備する: pH 7.5、0.1 M NaCl、2 mM MgCl_2、および 3% ウシ血清アルブミンフラクション V. AP 7.5 バッファー: pH 7.5、0.1 M NaCl、および 2 mM MgCl₂で 0.1 M Tris-HCl を混合します。AP 9.5 バッファ: pH 9.5、0.1 M NaCl、および 50 mM MgCl₂で 0.1 M トリス-HCl を混在させます。TE バッファ: pH 8.0 で 10 mM トリス-HCl を混合し、pH 8.0 で 1 mM EDTA を混在かします。
       2. 1時間30°Cでブロッキングバッファーに膜を浸します。
       3. AP 7.5 バッファーの 10 mL にストレプトアビジンアルカリホスファターゼの 8.5 μL を追加します。この溶液中の膜をRTで10分間ゆっくり振ります。次いで、AP 7.5バッファーの15mLで膜2xを10分間洗浄する。
       4. AP 9.5バッファーの20 mLで膜をもう一度10分間洗い、反応を止めるためにTEバッファーの20 mLを追加します。
       5. 7.5 mLの開発溶液を膜上に加え、1-3sの化学発光イメージングシステムで膜をスキャンします。

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結果

MEIOBのタンパク質構造と本研究で用いられる発現構造体を図1Aに示す。MEIOBのOBフォールドは、一本鎖核酸を認識し、相互作用することができるコンパクトなバレルのような構造です。OBドメインの1つ(aa 136-307、構築A)は、一本鎖DNA(ssDNA)、切り捨てられたタンパク質(aa 136-178切り捨て、構築C)およびMEIOBの点変異形態(R235A突然変異、構築E)を結合するDNA結合

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ディスカッション

タンパク質と核酸の相互作用を調べると、多様な生物学的プロセスの基礎となる分子メカニズムを理解するうえで重要です。例えば、MEIOBは、哺乳類25、26、27におけるマイオシスおよび不妊に不可欠な精巣特異的タンパク質である。MEIOBは、一本鎖DNAに結合するOBドメインを含み、3'〜5'エキソヌクレアーゼ^活?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5242R
Chemiluminescent Imaging System	Tanon, China	5200
Digital sonifer	Branson, USA	BBV12081048A	450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotter	Hoefer, USA	TE77XP
Tube Revolver	Crystal, USA	3406051
UV-light cross-linker	UVP, USA	CL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter	Milipore, USA	UFC801096	4 ml/10 K
Nylon membrane	Thermo Scientific, USA	TG263940A
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430167	100 mm
TC-treated Culture Dish	Corning, USA	430597	150 mm
Microtubes tubes	AXYGEN, USA	MCT-150-C	1.5 mL
Tubes	Corning, USA	430791	15 mL
Reagents
Ampicillin	SunShine Bio, China	8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beads	Sigma, USA	M8823
ATP	Thermo Scientific, USA	591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit	Beyotime, China	C3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent	Sigma, USA	107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit	Vazyme, China	C112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit	Thermo Scientific, USA	T1269950
dNTP	Sigma-Aldrich, USA	DNTP100-1KT
DMEM	Gibco, USA	10569044
DPBS buffer	Gibco, USA	14190-136
EDTA	Invitrogen, USA	AM9260G	0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktail	Roche, USA	04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit	Vazyme, China	DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit	Vazyme, China	DC301-01
FBS	Gibco, USA	10437028
FLAG peptide	Sigma, USA	F4799
Glycerol	Sigma, USA	SHBK3676
GST Bulk Kit	GE Healthcare, USA	27-4570-01
HEPES buffer	Sigma, USA	SLBZ2837	1 M
IPTG	Thermo Scientific, USA	34060
KoAc	Sangon Biotech, China	127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent	Thermo Scientific, USA	L3000001
MgCl2	Invitrogen, USA	AM9530G	1 M
NaCl	Invitrogen, USA	AM9759	5 M
NP-40	Amresco, USA	M158-500ML
Opti-MEM medium	Gibco, USA	31985062
PBS	Gibco, USA	10010023	PH 7.4
RNase Inhibitor	Promega, USA	N251B
Streptavidin alkaline phosphatase	Promega, USA	V5591
TBE	Invitrogen, USA	15581044
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15567027	1 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer	Invitrogen, USA	15568025	1 M, PH 8.0
Tween-20	Sangon Biotech, China	A600560