JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan, protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak uygulanabilir olan biotin etiketlerini kullanarak in vitro biyokimyasal kurallara yönelik protokollerdir.

Özet

Protein-nüklemik asit etkileşimleri transkripsiyon, rekombinasyon ve RNA metabolizması gibi biyolojik süreçlerde önemli roller oynar. Protein-nüklik asit etkileşimlerini incelemek için deneysel yöntemler, belirli hedef molekülleri algılamak ve analiz etmek için floresan etiketlerinin, radyoaktif izotopların veya diğer etiketlerin kullanılmasını gerektirir. Radyoaktif olmayan nüklik asit etiketi olan biotin, yaygın olarak elektroforetik hareketlilik vardiyasında (EMSA) kullanılır ancak nükle asit süreçleri sırasında protein aktivitesini izlemek için düzenli olarak kullanılmaz. Bu protokol, in vitro enzimatik reaksiyonlar sırasında etiketleme biotin yardımcı programı göstermektedir, bu etiketin farklı biyokimyasal assays bir dizi ile iyi çalıştığını gösteren. Özellikle, radyoizotop 32P-etiketli substratlar kullanarak önceki bulgularla uyum içinde, bu biotin etiketli emsa ile teyit edilir meiob (özellikle Mayoz bölünmenin rekombinasyon dahil bir protein) bir DNA-bağlayıcı protein olduğunu, bu MOV10 (bir RNA helicase) Biotin etiketli RNA Dubleks yapılarını çözer ve MEIOB, biotin etiketli tek telli DNA 'Yı belirtir. Bu çalışmada, biotin 32P yerine çeşitli nüklik asit ile ilgili biyokimyasal asdaları içinde vitro olarak değiştirebilen olduğunu göstermektedir.

Giriş

Protein-nüklik asit etkileşimleri DNA tamiri, çoğaltma, transkripsiyon, RNA işleme ve çeviri gibi birçok temel hücresel süreçte yer almakta. Kromatin içindeki spesifik DNA dizileri ile protein etkileşimleri transkripsiyonel düzeyinde Gen ifadesinin sıkı kontrolü için gereklidir1. Çok sayıda kodlama ve kodlama gerektirmeyen Rnas 'ın hassas posttranskripsiyonel düzenlenmesi, herhangi bir protein ve RNA2arasında geniş ve karmaşık etkileşimleri gerektirir. Gen ifadesi düzenleyici mekanizmanın bu katmanları, nüklik asit hedefleri ile transkripsiyon/epigenetik faktörlerin veya RNA bağlayıcı proteinlerin etkileşimleri ile koordine edilen dinamik moleküler olayların bir basamaklarını kapsar, hem de protein-protein etkileşimleri. Proteinlerin in vivo ile doğrudan veya dolaylı olarak nüklerik asitler ile ilişkili olup olmadığını ve bu tür derneklerin nasıl ortaya çıktığı ve ne kadar gerçekleşmediğini incelemek için, in vitro biyokimyasal testler, ilgi proteinlerinin bağlayıcı benzeşiminin veya enzimatik aktivitesinin incelenmesi için gerçekleştirilir DNA ve/veya RNA 'nın tasarlanmış substratlar.

Elektroforetik hareketlilik vardiya tahlil (EmSa) da dahil olmak üzere nüklik asit-protein kompleksler algılamak ve karakterize etmek için birçok teknikleri geliştirilmiştir, aynı zamanda jel retardasyon assay veya bant vardiya tahlil olarak adlandırılan3,4,5 . EMSA, proteinlerin nüklik asitlerle doğrudan bağlamasını incelemek için yaygın olarak kullanılan çok yönlü ve hassas bir biyokimyasal yöntemdir. Emsa, Biyokimya etiketlerini tespit etmek için kemilüminesans kullanılarak rutin olarak görselleştirilen, bant içinde jel elektroforetik vardiyasına dayanır6,7, fluorophore etiketlerinin floresans8,9, veya radyoaktif 32P etiket otoradyografi tekniklerinde10,11. Biyokimyasal çalışmaların diğer amaçları, nükleik asit substratlar12' den gelen çekirdeksizlik ürünlerini değerlendirmek için nükleik asit işleme aktivitesinin kimlik ve karakterizasyonu, örneğin nuclease tabanlı reaksiyonlar gibi 13 ' ü , 14 ve DNA/RNA yapısı-helikazı faaliyetlerinin değerlendirilmesi için unwinding analizlerinin15,16,17.

Bu tür enzimatik aktiviteye göre, radyoizotop etiketli veya fluorophore etiketli nüklenik asitler genellikle yüksek hassasiyetleri nedeniyle substratlar olarak kullanılır. 32P etiketli radiotracers içeren enzimatik reaksiyonlar radyografinin analizi hassas ve tekrarlanabilir18olarak bulunmuştur. Ancak, dünyada laboratuvarların artan sayıda, radyoizotopların kullanımı kısıtlı veya hatta potansiyel maruz kalma ile ilgili sağlık riskleri nedeniyle yasaklanmıştır. Biyogüvenlik endişelerine ek olarak, diğer dezavantajları radyoizotoplar, gerekli radyoaktivite lisansı, 32P (yaklaşık 14 gün) kısa yarı ömrü ve prob kalitesi nedeniyle kademeli bozulma ile çalışma yapmak için gerekli ekipman gereklidir radiolysis. Böylece, alternatif izotopik olmayan yöntemler geliştirilmiştir (yani, fluorophores ile prob etiketleme floresan görüntüleme tarafından algılama sağlar19). Ancak, floresan etiketli prob kullanırken yüksek çözünürlüklü görüntüleme sistemi gereklidir. Biotin, sık kullanılan bir etiket, kolayca protein ve nüklemik asitler gibi biyolojik makromoleküllere bağlanır. Biotin-streptavidin sistemi verimli çalışır ve spesifik olmayan arka plan20,21artırmadan algılama hassasiyeti artırır. Emsa yanı sıra, biotin yaygın protein arıtma ve RNA Pull-Down için kullanılır, diğerleri arasında22,23,24.

Bu protokol, biotin yaygın olarak kullanılmadığını enzimatik reaksiyonlar ek olarak, EMSA dahil in vitro biyokimyasal asder için substratlar olarak biotin etiketli nüklenik asitler başarıyla kullanır. Meiob OB etki alanı inşa edilir ve iki mutantlar (kesme ve nokta mutasyon) GST Fusion proteinleri25,26,27, yanı sıra fare MOV10 rekombinant bayrağı Fusion protein16olarak ifade edilir. Bu rapor, çeşitli deneysel amaçlarla protein arıtma ve biotin etiketli özellikler için bu kombine protokolün etkinliğini vurgular.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. protein preparat

  1. MEıOB ve MOV10 ifade yapıları
    1. CDNA ifade yapıları kodlama fare MEıOB-A, C ve E (Şekil 1A) ve MOV10 oluşturun.
      1. Her parça için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) reaksiyonları ayarlayın. Mix 1 μL fare cDNA (C57BL/6 fare testis), 1 μL dNTP, 2 μL 10 μM ileri astar, 2 μL 10 μM ters astar, 1 μL DNA polimeraz, 25 μL 2x PCR tampon ve 18 μL çift damıtılmış H2o (DDH2o) son bir hacmi 50 μL.
        Not: Meiob ve Mov10 gen parçaları amplifikasyon için astar Tablo 1 listelenir.
      2. Aşağıdaki programları kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 95 °C ' de 5 dk, 35 ısıtma döngüsü, 15 s için 95 °C, 15 s için 64 °C ' de tavlama, 20 s için 72 °C ' de uzatma (tam uzunlukta MOV10 uzatmak için 2 dakika) ve 68 °C ' de 7 dakika son uzatma.
        Not: Primer çifti MEIOB-E (F1) ve meiob-e-mut (R1) ve MEIOB-E-mut (F2) ve meiob-E (R2), sırasıyla bir mutant PCR şablonu oluşturmak için 3 ' ve 5 ' sondaki çakışan bir sıra içinde mutant sırasını içeren iki segmentleri yükseltmek için kullanın.
    2. Güçlendirilmiş PCR DNA 'sını jel elektroforezi ile analiz edin, gerekli boyutta olan bandı UV lambası altında hızlı bir şekilde jel ile kesip santrifüjlenmiş bir tüpe yerleştirin.
      Not: meıob-A için agaroz jel üzerinde görülebilir beklenen ürün boyutları 536 BP, meıob-C 296 BP, meıob-E ise 312 BP ve 229 BP, ve MOV10 olduğunu 3015 BP.
    3. Üreticinin protokolünün ardından PCR DNA 'sını jel ekstraksiyon kiti ile arındırın.
      1. Adım 1.1.2 ve Melt jel bir 50-55 °C su banyosunda 5-10 dakika için santrifüjlerin içine boşaltma tampon eşit hacim ekleyin, jel parçaları tamamen eritmek sağlamak. Tüpün duvarından herhangi bir damlacıkları toplamak için kısa bir süre santrifüjler.
        Not: jelin kütle/hacim konsantrasyonu ve çözünme tamponu 1 mg/μL 'dir.
      2. Adsorpsiyon sütununu toplama tüpüne yerleştirin, çözünmüş jel parçasını içeren solüsyonu adsorpsiyon sütununa aktarın ve 12.000 x g 'de santrifüjle 2 dak.
      3. Toplama tüplerinin alt kısmındaki süzyü atın. Sütun için yıkama tampon 600 μL ekleyin, 1 dakika için 12.000 x g Santrifüjü ve filtrat atın.
      4. Adım 1.1.3.3 bir kez yineleyin.
      5. Sütunu geri toplama tüpüne yerleştirin ve kalan tüm yıkama tamponunu kaldırmak için 2 dakika 12.000 x g 'de santrifüjün.
      6. Bir 1,5 ml sterilize santrifüjli tüpte adsorpsiyon sütunu yerleştirin, adsorpsiyon sütun merkezine 50 μL DDH2O ekleyin ve 1 dakika için 12.000 x g Santrifüjü spektrofotometre kullanarak yıkantıdaki DNA konsantrasyonu ölçmek.
    4. Plazmids kısıtlama sindirimi
      1. BamHI ve NotI ile Digest pGEX-4T-1 vektör. Bunu yapmak için 4 μg pGEX-4T-1 vektör, 5 μL 10X Özet arabellek, 1 μL BamHI ve 1 μL NotI ve ddH2O 50 μL son reaksiyon hacmine karıştırın. 37 °C ' de 2 saat boyunca Inküye yapın.
      2. 4 μg pRK5 vektörü, 5 μL 10X Özet arabelleği, 1 μL BamHI ve 1 μL XhoI ve ddH2O 50 μL 'nin son reaksiyon hacmine karıştırılarak Bamhi ve xhoi Ile Digest pRK5 vektörü. 37 °C ' de 2 saat boyunca Inküye yapın.
    5. Jel elektroforezi ile vektör DNA analiz, bir UV lambası altında bir neşter ile hızlı bir şekilde jel istenen boyut bandı kesilmiş ve bir santrifüj tüp içine yerleştirin.
    6. Üretici talimat aşağıdaki 1.1.3 olarak bir jel ekstraksiyon kiti ile vektör DNA arındırmak.
      Not: doğraklanmış plazmids uzunluğu: pGEX-4T-1, 4,4 KB; pRK5, 4,7 KB.
    7. Doğrusal vektör 0,03 pmol, cDNA parçası 0,06 pmol, 2 μL ligaz ve 4 μL 5x ligaz tampon ve ddH2O Ile 10 μL 'nin son reaksiyon hacmine birleştirerek standart rekombinant ligasyon reaksiyonu ayarlayın.
      Not: klonlama MEıOB-A, C ve E pGEX-4T-1 vektör ve MOV10 içine bir pRK5 vektör.
    8. Karışım 37 °C ' de 30 dakika boyunca inküye ve sonra tepkileri hemen 5 dakika buz üzerinde soğutun. BL21 bakteri ve MOV10 rekombinant plazmids içine DH5α bakteri içine MEıOB rekombinant plazmids dönüştürün.
      Not: tüm rekombinant yapıları tarafından Sanger sıralamayı doğrulayın.
    9. Sıvı kültürlere 50% gliserol eşit hacim ekleyerek ve-80 °C ' de depolayarak, doğrulanmış rekombinant plazmids içeren bakteriyel kültürlerin gliserol stoklarını hazırlayın.
      Not: her sonraki deney Için, gliserol stokları taze bir agar plaka üzerine bakteri çizgi ve adım 1,2 açıklandığı gibi genişleme için tek bir koloni kullanın.
  2. Bakterilerden MEıOB protein ekstraları
    1. 100 μg/ml ampisilin içeren 3 ml lb 'de sıralı ve aşılamak ile doğrulanarak, boş veya rekombinant pgex-4T-1 Plasmid ile nakledilmiş her BL21 gerilimin bir kolonisini seçin. 220 RPM 'de sallayarak, 37 °C ' de gece büyüyebilir.
    2. Inoculate 300 mL LB içeren 100 μg/mL ampikilin 3 mL gecede kültürü (adım 1.2.1). 37 ° c 'ye kadar 2 saat boyunca sallama ile kültürler Grow600 , 0.5-1.0 ulaşır.
    3. 0,2 mM son konsantrasyonuna isopropresl Beta-D-thiogalactopyranoside (ıPTG) ekleyerek protein ifadesini teşvik. 180 rpm ve 18 °C ' de sallayarak ek 3 h için kültürlerin inkük.
    4. 3.500 x g ve 4 °c ' de 20 dakika boyunca bakteriyel kültürü santrifüjle
    5. Buz-soğuk Dulbecco fosfat tamponlu tuz (dpbs) tampon 20 ml Pelet resuspend. Kısa 10 s patlamaları (çıkış gücü% 20) 25 döngüleri için buz üzerinde bakteri süspansiyonu sonikat ardından 2-3 s buzda dinleniyor.
    6. Lysate 'yi 12.000 x g ve 4 °c ' de 15 dakika santrifüjün. tüm süpernatant 'i taze bir tüpe aktarın.
    7. Ön yıkama boncukları.
      1. Taze 15 mL tüpüne glutatyon-Sepharose boncuk 300 μL ekleyin ve 10 mL buz soğuk PBS tampon ile boncukları yıkayın.
      2. 750 x g ve 4 °c ' de santrifüjler için 1 dakika Pelet boncuklar ve yıkama solüsyonu atın.
    8. Lysate 'i yıkanmış boncukların içine ekleyin ve 4 °c ' de 2 saat boyunca inküye yapın. 750 x g ve 4 °c ' de santrifüjler, 1 dakika için Pelet boncuklar. 10 mL buz soğuk PBS 8X içinde boncuklar durulayın.
    9. 1 ml elüsyon tampon ile boncuk elute (50 mm Tris-HCL içinde 10 mm glutatyon pH 8,0) 6x, her bir elüsyon adımına 10 dakika önce 4 °c ' de inkükleştirici. 750 x g ve 4 °C ' de santrifüjler için 1 dakika boncuk Pelet. Toplamak ve 6 fraksiyonları havuz.
    10. En az 100-200 μL hacim elde etmek için, eltilmiş proteinlerin santrifüj filtresine aktarılması ve 7.500 x g 'de santrifüjleme ile konsantre olması.
  3. HEK293T hücrelerden MOV10 protein özler
    1. MOV10 proteinleri kültürlü HEK293T hücrelerinde hızlı bir şekilde ifade ederler.
      1. Hazırlamak MOV10-pRK5 Plasmid bir konsantrasyon > 500 ng/μL.
      2. 15 cm yemeklerden tohum HEK293T hücreler. Hücre yoğunluğu ~% 70-90% ulaştığında, hücre kültürü ortamını taze Dulbecco 'nun modifiye kartal medyası (DMEM) ile% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin içeren yerine yerleştirin.
      3. Bir transfeksiyon için, azaltılmış serum ortamının 3 mL 'de MOV10-pRK5 plazmid DNA 'sında seyreltme 60 μg, sonra transfeksiyon arttırıcı reaktif 120 μL ekleyin ve iyi karıştırın.
      4. Ayrı bir tüp seyreltme 90 μL transfeksiyon reaktif 3 mL azaltılmış serum Orta (penisilin-streptomisin olmadan) ve mix iyi.
      5. Seyreltilmiş transfeksiyon reakajının her tüpüne seyreltilmemiş DNA ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye yapın.
      6. Transfeksiyon karışımı hücre kültürünü ekleyin ve kültür hücreleri için ~ 36-48 h.
    2. Sonra 36-48 h, bir 50 mL tüp her plaka hücreleri toplayın. 500 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika Santrifüjü. Her bir peletleri 10 mL buz soğuk PBS ile yıkayın ve 4 °C ' de 5 dakika 500 x g 'de santrifüjleme ile hücreleri toplayın.
    3. Tam ehylenediaminetetraacetic asit (EDTA) içeren 3 mL hücre lizis tamponunun içinde Pelet resuspend-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli. Buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe. Lysate 20.000 x g ve 4 °c ' de 20 dakika Santrifüjü.
    4. 1,5 mL 'Lik bir tüpte hücrelerin tabak başına Anti-FLAG manyetik boncuk 100 μL ekleyin.
    5. Manyetik boncuk 2x K150 tampon ile yıkayın (50 mM HEPES pH 7,5, 150 mM KoAc, 1 mM DTT, 0,1% NP-40).
      1. 1 mL buz soğuk K150 tampon olarak manyetik boncuk resuspend.
      2. Manyetik boncukların 2 dakika boyunca 4 °C ' de nazik rotasyona ve mıknatıslı boncuklar ile mıknatıs yardımıyla kulyatın. Kaldırın ve supernatant atın.
    6. Adım 1.3.3 den hücre lysate süpernatant için manyetik boncuk ekleyin ve 2 h için 4 °c ' de inkük.
    7. K150 içeren 250 mM NaCl, sonra 3x K150 tampon ile 1.3.5 olarak K150 tampon, sonra 2x ile protein bağlı Manyetik boncuk 3x yıkayın.
    8. 300 μL bayrak elüsyon tampon (100 mM NaCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 10% gliserol), 20 mm Tris-HCL içinde boncuk resuspend, son bir konsantrasyon için bayrak peptid ekleyin 0,5 μg/μL, ve 1 h Için 4 °c ' de bir rotator üzerinde boncuk ile inkük , sonra bir mıknatıs yardımıyla manyetik boncuk Pelet.
    9. El MOV10 proteinleri içeren süpernatant toplayın, konsantrasyon belirlemek, ve mağaza-80 °c ileride kullanmak için.

2. nüklik asit hazırlama

  1. Satın DNA ve RNA oligonükleotides (oligos) uygun bir kaynaktan biotin etiketleri ile veya olmadan. RNase-Free ddH2O Ile 20 μM arası her oligo 'yu seyreltmek ve gelecekteki kullanım için-80 °c ' de tutmak.
    Not: Bu çalışmada kullanılan DNA/RNA substratlar oligo dizileri Tablo 2' de listelenmiştir.
  2. MOV10 helikazı aktivite tahlili için çift telli RNA (dsrna) tavlama reaksiyonu için aşağıdaki karışımı hazırlayın: Mix 60 mm N-2-hidroksiokilpiperazin-N-etan-sülfat asit (HEPES) pH 7,5, 6 mm KCL, 0,2 mm MgCl2 ve RNase-Free DDH2 O 20 μl son reaksiyon hacminde.
  3. Anneal RNA oligos, biotin etiketli üst iplikteki (2 μM, son konsantrasyon) bir karışımı ısıtarak RNA Dubleksi oluşturmak ve tavlama tamponunun (adım 2,2), 5 dakika boyunca 95 °C ' de etiketlenmemiş tamamlayıcı alt iplikteki 1,5 kat ve sonra yavaşça odaya soğutmak için sıcaklık (RT).

3. In vitro biyokimyasal asder

  1. EMSA ve enzimatik reaksiyonlar
    1. Meiob emsa tahlil için, mix 50 mm Tris HCl pH 7,5, 2 mm MgCl2, 50 mm NaCl, 10 mm EDTA, 2 mm ditiyotreitol (DTT), 0,01% NP-40, 0,8 mm (veya Şekil 2 ve Şekil 3gösterildiği gibi diğer ilgili konsantrasyonlar) meiob protein, ve 10 Nm 20 μL 'nin son reaksiyon hacminde biotin etiketli oligonükleotidler ve ddH2O. 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın ve reaksiyonu durdurmak için 5x stop tampon (125 mM EDTA,% 50 gliserol) ekleyin.
    2. Adım 3.1.1 ' de açıklandığı gibi meıob nükleaz aktivite reaksiyonları ayarlayın ama 10 mm EDTA ilavesi olmadan.
    3. MOV10 helikazı aktivite tahlil için, mix 50 mm Tris-HCl pH 7,5, 20 mm koac, 2 mm MgCl2, 0,01% NP-40, 1 mm DTT, 2 U/μL RNase inhibitörü, 10 Nm biotin etiketli RNA substrat, 2 mm adenozin trifosfat (ATP), 100 Nm RNA tuzağı ve 20 ng MOV10 protein ve DDH < C6 > 2O 20 μl son reaksiyon hacminde. Reaksiyon karışımını 37 °C ' de 10 dk, 30 dakika ve 60 dk. boyunca inküşün. reaksiyonu durdurmak için 5x stop arabelleği ekleyin.
      Not: RNA tuzağı, dizi ile bir biotin-etiketsiz Oligo, etiketlenmiş oligo için tamamlanmasını, yeniden tavlama unwound dsRNA önler.
  2. Poliakrilamid jeller
    1. Jel plakalarını (16 cm x 16 cm) ve 1,5 mm tarakları yıkayın. Jel Elektroforez ünitelerinin montajı.
    2. % 10 yerli Poliakrilamid jel hazırlamak için, mix 14 mL ddH2O, 1,25 ml 10X Tris-Borik ASIT-EDTA (TBE), 8,3 ml% 30 akrilamid, 1,25 ml% 50 gliserol, 187,5 μL% 10 taze hazırlanmış amonyum Persülfat (APS), ve 12,5 μL tetramethylethylenediamin (TEMED).
    3. Hazırlamak için 20% yerli Poliakrilamid jel, Mix 5,5 mL ddH2O, 1,25 ml 10X tbe, 1,25 ml% 50 gliserol, 16,7 ml% 30 akrilamid, 187,5 μL% 10 APS, ve 12,5 ΜL temed.
    4. Akrilamid solüsyonu hemen jel ile dökün ve tarak takın. Karışım yaklaşık 30 dakika polimerize edelim.
  3. Jel koşma
    1. Tarağı çıkarın, tankları Elektroforez çalışan tampon (0.5 x TBE) ile doldurun.
    2. Numune kuyularını 0.5 x TBE tampon ile durulayın, ardından 100 V 'de jel ile 30 dakika boyunca buzda önceden çalıştırın. çalışan tamponu taze 0.5 x TBE ile değiştirin.
    3. 20-25 μL örneklerini her kuyunda yükleyin.
    4. EMSA tahlili için% 10 yerli akrilamid jel ve enzimatik asder için% 20 yerli akrilamid jel kullanın. Bromophenol mavi Marker jel alt çeyreğine göç edene kadar buz banyosunda 100 V 'de elektroforezi çalıştırın.
  4. Jel plakalarını sökün, yükleme kuyuları ve kullanılmayan şeritleri kaldırarak jeli kırpın. Jel 0.5 x TBE tampon yerleştirin.
  5. Filtre kağıdı ve naylon membran jel boyutuna keser. Temiz filtre kağıdı ve naylon membran ön-ıslak.
  6. Aktarma için yığını birleştirin.
    1. Önceden ıslak membran önceden Islak filtre kağıdı üzerine yerleştirin.
    2. Jeli membran üzerine yerleştirin.
    3. Jel önceden Islak filtre kağıt başka bir tabaka ile kapak.
    4. Tüm hava kabarcıklarını merkezinden kenara temiz bir pipet yuvarlayarak çıkarın.
  7. Jel numuneleri, 20 dakika boyunca 90 mA 'da yarı kuru elektroforetik cihazında membran için membrandan aktarın.
  8. Transferi durdurun ve sonra 1 dakika için yeni bir filtre kağıdı üzerinde membran kurutun.
  9. 120 mJ/cm2 , 45-60 s için 254 nm ampuller (otomatik Crosslink işlevi) ile DONATıLMıŞ bir UV-Light crosslinker membran ışınlayarak örnekleri Crosslink. Hava, 30 dakika boyunca RT 'de membranı kurutur.
  10. Kemiluminesans algılama
    1. Protokol 1: ticari kemilümlü nüklik asit algılama kiti standart hacmi kullanın.
      1. Membranda tampon engelleme 20 mL ekleyin ve 20-25 RPM 'de bir rotator üzerinde nazik sallama ile 15-30 dakika boyunca inkübe.
      2. 66,7 μL stabilize streptavidin-horserp peroksidaz Konjugat, 20 mL engelleyici tampon ekleyerek Konjugat/engelleme tampon çözümünü hazırlayın.
      3. Engelleyici tamponu yavaşça çıkarın ve Konjugat/engelleme tamponu ile değiştirin. 20-25 RPM 'de Rotator üzerinde 15 dakika boyunca inküye yapın.
      4. 5 dakika boyunca 40-45 RPM 'de sallayarak membran 4X yıkayın.
      5. Membran için 30 ml substrat dengelemesinden tampon ekleyin. 20-25 RPM 'de sallama ile membranı 5 dakika boyunca inküd.
      6. 6 mL istikrarlı peroksit çözeltisi için 6 mL luminol/Enhancer solüsyonu ekleyerek substrat çalışma çözümünü hazırlayın. Işık kaçının.
      7. Substrat çalışma çözeltisi ile membranın tüm yüzeyini kapın ve 5 dakika boyunca inküye yapın.
      8. 1-3 s için kemiluminesans görüntüleme sisteminde membranı tarayın.
    2. Protokol 2:2x seyreltilmiş ticari chemiluminesans nüklik asit algılama kiti kullanın ve 3.10.1.1-3.10.1.8 adımlarını izleyin.
    3. Protokol 3: kendi kendine yapılan reaktifler6' ı kullanın.
      1. Engelleme arabelleği hazırlayın: Mix 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 0,1 M NaCl, 2 mM MgCl2ve% 3 Sığır serum albümin kesirli V. AP 7,5 tampon: Mix 0,1 m Tris-hcl pH 7,5, 0,1 m NaCl ve 2 mm MgCl2. AP 9,5 tampon: Mix 0,1 M Tris-HCl pH 9,5, 0,1 M NaCl ve 50 mM MgCl2. TE tampon: Mix 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0.
      2. 1 saat için 30 °C ' de engelleyici tamponda membranı ıslatın.
      3. Ekle 8,5 μL streptavidin alkalin fosfataz 10 mL AP 7,5 tampon. 10 dakika boyunca RT 'de Bu çözelti yavaşça membranı sallayın. Sonra, 10 dk için 15 mL AP 7,5 tampon membran 2x yıkayın.
      4. 10 dakika boyunca 20 mL AP 9,5 tampon olarak membranı bir kez daha yıkayın. reaksiyonu durdurmak için 20 mL TE tampon ekleyin.
      5. Membran üzerine 7,5 mL geliştirme çözeltisi ekleyin ve 1-3 s için bir kemiluminesans görüntüleme sisteminde membranı tarayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MEIOB protein yapısı ve bu çalışmada kullanılan ifade yapıları Şekil 1A'da gösterilmiştir. MEIOB 'deki OB kıvrımları, tek telli nüklik asitlerle tanınabilir ve etkileşimde bulunan kompakt varil benzeri yapılardır. OB etki alanlarından biri (AA 136-307, A inşa) tek telli DNA bağlar (ssDNA), kesilmiş protein (AA 136-178 truncations, C inşa) ve Point mutant formu (R235A mutasyon, E inşa) MEıOB DNA-bağlayıcı etkinliği26yok. G...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protein-nüklik asit etkileşimlerini araştırmak, çeşitli biyolojik süreçlerin temel alan moleküler mekanizmaların anlayışımız için önemlidir. Örneğin, meiob memeliler25,26,27mayoz ve fertilite için önemli bir testis özgü proteindir. Meıob, tek telli DNA 'ya bağlanan ve 3 ' ila 5 ' eksonükleaz aktivitesi26' ya doğrudan meiyotik yeniden kombinasyon sırasında fizyolojik alaka ile a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Hiç bir ilgi çakışması bildirilmedi.

Teşekkürler

Yararlı düzenlemeler ve tartışmalar için P. Jeremy Wang (Pennsylvania Üniversitesi) ' ne teşekkür ederiz. Biz de dil düzenleme için Sigrid ECKARDT teşekkür ederiz. K. Z. Çin Ulusal anahtar R & D programı (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31771653) tarafından destekleniyordu. L. Y. Ulusal Doğal Bilim Vakfı Çin (81471502, 31871503) ve yenilikçi ve girişimcilik programı Jiangsu Eyaleti tarafından desteklenmektedir. J. N. Zhejiang tıp bilimi ve teknoloji projesi (2019KY499) tarafından destekleniyordu. M. L. Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31771588) ve 1000 gençlik yetenek planı hibe tarafından desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
CentrifugeEppendorf, Germany5242R
Chemiluminescent Imaging SystemTanon, China5200
Digital soniferBranson, USABBV12081048A450 Watts; 50/60 HZ
Semi-dry electrophoretic blotterHoefer, USATE77XP
Tube Revolver Crystal, USA3406051
UV-light cross-linkerUVP, USACL-1000
Materials
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Milipore, USAUFC8010964 ml/10 K
Nylon membraneThermo Scientific, USATG263940A
TC-treated Culture DishCorning, USA430167100 mm 
TC-treated Culture DishCorning, USA430597150 mm 
Microtubes tubesAXYGEN, USAMCT-150-C1.5 mL 
TubesCorning, USA43079115 mL
Reagents 
AmpicillinSunShine Bio, China8h288h28
Anti-FLAG M2 magnetic beadsSigma, USAM8823
ATPThermo Scientific, USA591136
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development KitBeyotime, ChinaC3206
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent Sigma, USA107M4071V
ClonExpress II one step cloning kit Vazyme, ChinaC112
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection KitThermo Scientific, USAT1269950
dNTPSigma-Aldrich, USADNTP100-1KT
DMEMGibco, USA10569044
DPBS bufferGibco, USA14190-136
EDTAInvitrogen, USAAM9260G0.5 M
EDTA free protease inhibitor cocktailRoche, USA04693132001
EndoFree Maxi Plasmid Kit Vazyme, China 
DC202
FastPure Gel DNA Extraction Mini KitVazyme, ChinaDC301-01
FBSGibco, USA10437028
FLAG peptideSigma, USAF4799
GlycerolSigma, USASHBK3676
GST Bulk KitGE Healthcare, USA27-4570-01
HEPES bufferSigma, USASLBZ28371 M 
IPTGThermo Scientific, USA34060
KoAcSangon Biotech, China127-08-02
Lipofectamin 3000 Transfection ReagentThermo Scientific, USAL3000001
MgCl2Invitrogen, USAAM9530G1 M
NaClInvitrogen, USAAM9759
 		5 M 
NP-40Amresco, USAM158-500ML
Opti-MEM mediumGibco, USA31985062
PBSGibco, USA10010023PH 7.4
RNase InhibitorPromega, USAN251B
Streptavidin alkaline phosphatasePromega, USAV5591
TBEInvitrogen, USA15581044
Tris-HCI Buffer Invitrogen, USA155670271 M, PH 7.4
Tris-HCI Buffer Invitrogen, USA155680251 M, PH 8.0
Tween-20Sangon Biotech, ChinaA600560

Referanslar

  1. Bai, S., et al. Sox30 initiates transcription of haploid genes during late meiosis and spermiogenesis in mouse testes. Development. 145 (13), (2018).
  2. Watanabe, T., Lin, H. Posttranscriptional regulation of gene expression by Piwi proteins and piRNAs. Molecular Cell. 56 (1), 18-27 (2014).
  3. Alonso, N., Guillen, R., Chambers, J. W., Leng, F. A rapid and sensitive high-throughput screening method to identify compounds targeting protein-nucleic acids interactions. Nucleic Acids Research. 43 (8), 52(2015).
  4. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  5. Gustafsdottir, S. M., et al. In vitro analysis of DNA-protein interactions by proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (9), 3067-3072 (2007).
  6. Li, Y., Jiang, Z., Chen, H., Ma, W. J. A modified quantitative EMSA and its application in the study of RNA--protein interactions. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 60 (2), 85-96 (2004).
  7. Fahrer, J., Kranaster, R., Altmeyer, M., Marx, A., Burkle, A. Quantitative analysis of the binding affinity of poly(ADP-ribose) to specific binding proteins as a function of chain length. Nucleic Acids Research. 35 (21), 143(2007).
  8. Hsieh, Y. W., Alqadah, A., Chuang, C. F. An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  9. Yan, G., et al. Orphan Nuclear Receptor Nur77 Inhibits Cardiac Hypertrophic Response to Beta-Adrenergic Stimulation. Molecular and Cellular Biology. 35 (19), 3312-3323 (2015).
  10. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).
  11. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for the study of RNA-protein interactions: the IRE/IRP example. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  12. Nishida, K. M., et al. Hierarchical roles of mitochondrial Papi and Zucchini in Bombyx germline piRNA biogenesis. Nature. 555 (7695), 260-264 (2018).
  13. Anders, C., Jinek, M. In vitro enzymology of Cas9. Methods in Enzymology. 546, 1-20 (2014).
  14. Zhao, H., Zheng, J., Li, Q. Q. A novel plant in vitro assay system for pre-mRNA cleavage during 3'-end formation. Plant Physiology. 157 (3), 1546-1554 (2011).
  15. Vourekas, A., et al. The RNA helicase MOV10L1 binds piRNA precursors to initiate piRNA processing. Genes & Development. 29 (6), 617-629 (2015).
  16. Gregersen, L. H., et al. MOV10 Is a 5' to 3' RNA helicase contributing to UPF1 mRNA target degradation by translocation along 3' UTRs. Molecular Cell. 54 (4), (2014).
  17. Talwar, T., et al. The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity. The Journal of Biological Chemistry. 292 (25), 10429-10443 (2017).
  18. Nagy, N. M., Konya, J. Study of fast and slow consecutive processes by heterogeneous isotope exchange using P-32 radiotracer. Journal of Radioanalytical And Nuclear Chemistry. 318 (3), 2349-2353 (2018).
  19. Wilson, D. L., Beharry, A. A., Srivastava, A., O'Connor, T. R., Kool, E. T. Fluorescence Probes for ALKBH2 Allow the Measurement of DNA Alkylation Repair and Drug Resistance Responses. Angewandte Chemie. 57 (39), 12896-12900 (2018).
  20. Wilchek, M., Bayer, E. A., Livnah, O. Essentials of biorecognition: the (strept)avidin-biotin system as a model for protein-protein and protein-ligand interaction. Immunology Letters. 103 (1), 27-32 (2006).
  21. Trippier, P. C. Synthetic strategies for the biotinylation of bioactive small molecules. ChemMedChem. 8 (2), 190-203 (2013).
  22. Rodgers, J. T., Patel, P., Hennes, J. L., Bolognia, S. L., Mascotti, D. P. Use of biotin-labeled nucleic acids for protein purification and agarose-based chemiluminescent electromobility shift assays. Analytical Biochemistry. 277 (2), 254-259 (2000).
  23. Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes. Bio-Protocol. 6 (24), (2016).
  24. Bednarek, S., et al. mRNAs biotinylated within the 5' cap and protected against decapping: new tools to capture RNA - protein complexes. Philosophical Transactions Of the Royal Society B-Biological Sciences. 373 (1762), (2018).
  25. Souquet, B., et al. MEIOB Targets Single-Strand DNA and Is Necessary for Meiotic Recombination. Plos Genetics. 9 (9), (2013).
  26. Luo, M., et al. MEIOB exhibits single-stranded DNA-binding and exonuclease activities and is essential for meiotic recombination. Nature Communications. 4, 2788(2013).
  27. Xu, Y., Greenberg, R. A., Schonbrunn, E., Wang, P. J. Meiosis-specific proteins MEIOB and SPATA22 cooperatively associate with the single-stranded DNA-binding replication protein A complex and DNA double-strand breaks. Biology of Reproduction. 96 (5), 1096-1104 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 149in vitrobiyokimyasal tahlilEMSAbiotinprotein ar tmanucleasehelicaseRNA ba lay c proteinn klik asit

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır