Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

Abstract

הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים התומכים בפונקציות פיזיולוגיות כגון מטבוליזם המזון, קצירת האנרגיה והוויסות של המערכת החיסונית. הסתעפות של מיקרובידום המעיים הבריא הוצע לשחק תפקיד בפיתוח מחלות דלקתיות, כולל טרשת נפוצה (MS). גורמים סביבתיים וגנטיים יכולים להשפיע על ההרכב של המיקרובידום; לכן, זיהוי של קהילות מיקרוביאלית המקושרים עם פנוטיפ המחלה הפך לצעד הראשון להגדרת התפקיד של microbiome בריאות ומחלות. השימוש ברצפי המידע של הקהילה החיידקית של 16S, עזר בקידום מחקר מיקרובידום. למרות השימוש הנרחב שלה, אין פרוטוקול אחיד עבור ניתוח מבוססי מיסים של 16 s rRNA בפרופיל. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של הקצאת מיסים עקב קשיים טכניים כגון קריאות ברצף קטן יותר, כמו גם השימוש בלבד (R1) קורא בניתוח הסופי עקב איכות נמוכה של הפוכה (R2) קורא. יש צורך בשיטה פשוטה עם רזולוציה גבוהה לאפיון מגוון חיידקי בביודגימה נתונה. התקדמויות בטכנולוגיית רצף עם היכולת רצף קריאות ארוכות יותר ברזולוציה גבוהה סייעו להתגבר על חלק מהאתגרים אלה. הנוכחי ברצף הטכנולוגיה בשילוב עם צינור ניתוח מטאגנמית זמין לציבור כמו R מבוססי מגדרהמערכות האלגוריתם Denoאיזינג-2 (DADA2) עזר לקדם פרופיל מיקרוביאלית ברזולוציה גבוהה, כמו DADA2 יכול להקצות רצף בסוג ורמות המינים. המתואר כאן הוא מדריך לביצוע פרופילים חיידקיים באמצעות שני הגברה של האזור V3-V4 של הגנים של 16 s rRNA, ואחריו ניתוח באמצעות כלי ניתוח זמין בחופשיות (כלומר, DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל). הוא האמין כי זרימת עבודה פשוטה ומלאה תשמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.

Introduction

Microbiota מתייחס לאוסף של מיקרואורגניזמים (חיידקים, וירוסים, הארכאים, בקטריה, ופטריות) חיים בסביבה מסוימת, ו microbiota מתייחס הגנום הקולקטיבי של מיקרואורגניזמים תושב. כמו חיידקים הם אחד החיידקים הנפוצים ביותר בבני אדם ועכברים, מחקר זה מתמקד רק על פרופיל חיידקי. הבטן האנושית היא הקולוניה של טריליוני חיידקים ומאות זנים חיידקיים1. הבטן הרגילה microbiota משחק תפקיד חיוני בשמירה על מצב בריא במחשב המארח על ידי ויסות פונקציות (כלומר, תחזוקה של מחסום מעיים שלם, מטבוליזם מזון, הומאוסטזיס אנרגיה, עיכוב של הקולוניזציה על ידי אורגניזמים פתוגניים, ו תקנה של תגובות החיסון)2,3,4,5. Compositional של הבטן microbiota (בטן דיסביוזיס) קושרו למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות במערכת העיכול6, השמנת יתר7,8, קו9, סרטן10, סוכרת8,11, דלקת מפרקים שגרונית12, אלרגיות13, מחלות מרכז העצבים הקשורות כגון טרשת נפוצה (MS)14,15 ו אלצהיימר מחלה (AD)8,16. לכן, בשנים האחרונות, יש כבר עניין גדל בכלים לזיהוי הרכב חיידקי באתרי גוף שונים. שיטה אמינה צריכה להיות מאפיינים כגון להיות תפוקה גבוהה וקלה לשימוש, בעל היכולת לסווג microbiota חיידקי ברזולוציה גבוהה, ולהיות בעלות נמוכה.

טכניקות מיקרוביולוגית המבוססות על תרבות אינן רגישות מספיק כדי לזהות ולאפיין את מיקרובידום הבטן המורכבת בשל כישלון של מספר חיידקי הבטן לצמוח בתרבות. הופעתו של הטכנולוגיה המבוססת על רצף, במיוחד rRNA-מבוסס על רצף metagenomic, יש להתגבר על כמה אתגרים אלה והפך מחקר microbiome17. מתקדם 16S rRNA מבוסס רצף הטכנולוגיה סייעה בהקמת תפקיד קריטי עבור המעיים מיקרובידום בבריאות האדם. פרויקט המיקרובידום האנושי, המכון הלאומי ליזמות בריאותית18, ופרויקט המטהיט (יוזמה אירופאית)19 שניהם סייעו בהקמת מסגרת בסיסית לניתוח מיקרובידום. יוזמות אלה סייעו בעיטה-להתחיל מחקרים מרובים כדי לקבוע את התפקיד של מיקרובידום בטן האדם בריאות ומחלות.

מספר קבוצות הראו תחושת בטן בחולים עם מחלות דלקתיות12,14,15,20,21,22. למרות שנעשה שימוש נרחב בפרופיל מסים בשל היכולת ליצור מולטיפלקס ועלויות נמוכות, אין פרוטוקולים אחידים עבור פרופיל מטקמי מבוסס 16S. מגבלה נוספת היא ברזולוציה נמוכה של משימה מטקמיים בשל קריאות ברצף קטן יותר (150 bp או 250 bp) ושימוש ברצף הקדמי רק לקרוא (R1) עקב באיכות נמוכה ברצף הפוכה קריאות (R2). עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיית הרצף סייעה להתגבר על חלק מהאתגרים הללו, כגון היכולת לרצף יותר באמצעות קריאות מזווג-end (למשל, מאייר מיseq 2x300bp).

הטכנולוגיה הנוכחית ברצף יכול לרצף 600 bp באיכות טובה קורא, אשר מאפשר מיזוג של R1 ו R2 קורא. אלה ממוזגים עוד R1 ו-R2 קורא לאפשר משימות מיסוי טוב יותר, במיוחד עם גישה פתוחה R-מבוסס מגדלהעל מתחת מערכת האלגוריתם Denoising הפלטפורמה 2 (DADA2) פלטפורמת. DADA2 מנצל אמפליקון רצף variant (asv) משימות מבוססות במקום יחידת מיסים מבצעית (otu) הקצאות מבוסס על 97% דמיון מנוצל על ידי qiime23. ASV גפרורים התוצאה במשחק רצף מדויק במסד הנתונים בתוך 1-2 נוקלאוטידים, אשר מוביל הקצאה בסוג ורמות מינים. כך, שילוב של זמן רב יותר, באיכות טובה לזווג וכלים הקצאה טובה יותר (כגון DADA2) הפכו לימודי מיקרובידום.

בתנאי זה מדריך צעד אחר צעד לביצוע פרופיל חיידקי באמצעות הגברה של שני השלבים של האזור V3-V4 של 16S rRNA וניתוח נתונים באמצעות DADA2, Phyloseq, ו-Metאגנאסיל לסייע צינורות. עבור מחקר זה, אנטיגן לוקיציט אנושי (hla) בכיתה ii עכברים הטרנסגניים משמשים, כמו hla class ii אללים מקושרים עם נטייה מחלות אוטואימוניות כגון MS20,24,25. עם זאת, החשיבות של הגנים השנייה בכיתה HLA בוויסות הרכב של מיקרוביוטה בטן אינו ידוע. היפותזה היא כי מולקולת HLA class II ישפיע על הקהילה מיקרוביאלית של הבטן על ידי בחירת חיידקים ספציפיים. מורכב היסטוליאני מורכבים (mhc) מחלקה II עכברים (AE. KO) או עכברים המבטא האדם hla-DQ8 מולקולות (hla-DQ8)24,25,26 שימשו כדי להבין את החשיבות של hla class II מולקולות ב עצב את הקהילה הבין-מיקרוביאלית. הוא האמין כי זרימת עבודה זו מלאה ומפושטת עם ניתוח נתונים מבוססי R ישמש ככלי מצוין עבור החוקרים המעוניינים בביצוע מחקרים בפרופיל microbiome.

הדור של עכברים חסר אנדודוגני מורה MHC מחלקה II גנים (AE. KO) ו-AE-/-. HLA-DQA1 * 0103, DQB1 * 0302 (HLA-DQ8) העכברים הטרנסגניים עם רקע C57BL/6J כבר תיאר בעבר26. דגימות צואה נאספו מעכברים של שני המינים (8-12 שבועות של גיל). עכברים התרבו בעבר ונשמרו ב אוניברסיטת איווה מתקן בעלי חיים לפי הנחיות NIH ומוסדיים. זיהום אסטרטגיות שליטה כגון הגמילה של עכברים בתוך הקבינט הזרם למינארי, שינוי של כפפות בין זנים שונים של עכברים, ותחזוקה נאותה של עכברים הם צעדים קריטיים עבור פרופיל של מיקרובידום בטן.

ציוד הגנה אישי מתאים (PPE) מומלץ מאוד במהלך ההליך כולו. יש לכלול פקדים שליליים מתאימים בעת ביצוע בידוד DNA, PCR1 ו-PCR2 הגברה ושלבי הרצף. מומלץ להשתמש בציוד סטרילי, ללא תשלום, RNase-free ו-pyrogen-חינם. מומלץ להשתמש בצנרת המיועדת לעבודה במיקרו-מיקרו ובטיפים מסוננים לאורך כל הפרוטוקול. ניתוח microbiota מורכב משבעה שלבים: 1) לדוגמה בצואה איסוף ועיבוד; 2) הוצאת דנ א; 3) 16S rRNA הגברה הגנים; 4) בניית ספריית דנ א באמצעות PCR באינדקס; 5) ניקוי וכימות של ה-PCR הכלול באינדקס (ספריה); 6) רצף מיseq; ו -7) ניתוח נתונים ועיבוד רצף. דיאגרמה סכמטית של כל שלבי הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה השתמש של אוניברסיטת איווה.

1. איסוף וטיפול בצואה לדוגמה

  1. חטא את תיבות המפריד (ראה טבלת חומרים, איור משלים 1) עם 70% אתנול.
  2. לפני התווית צינורות מיקרוצנטריפוגה (אחד לכל עכבר) עם מזהה לדוגמה וקבוצת הטיפול (אם רלוונטי).
  3. מניחים את העכברים בתיבות מפריד מעוקר ולאפשר להם את הצרכים בדרך כלל עד 1 h.
  4. לאסוף את כדורי צואה ב ריק, מתויג מראש שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL באמצעות מלקחיים סטרילי ולסגור את הצינור באופן מאובטח. לחטא את הלקחיים לאחר איסוף מכל עכבר.
  5. מניחים את צינורית המיקרוצנטריפוגה המכילה כדורי צואה במקפיא של 80 ° c עד לעיבוד נוסף.
    הערה: תיבות ההפרדה הן יתרון מכיוון שהם מאפשרים איסוף סימולטני של דגימות צואה מעכברים מרובים (עד 12) בו.

2. הפקת דנ א

  1. הסר את דגימות צואה (עכבר או אדם) מן המקפיא להפשיר בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: מומלץ להפשיר דגימות של צואה אנושית בלילה ב -4 ° צ' לפי הצורך כדי לאסוף 200 mg או את הסכום הנדרש מדגימות המניה.
  2. השתמש 200 mg של חומרי התחלה ו-DNA elute לנפח הסופי של 50 μL.
  3. כלול ערכת דנ א בידוד ריק שבו לא מוסיפים דגימת צואה, אלא מעובד דרך כל שלבי החילוץ DNA.
    הערה: מסוים בידוד DNA ערכת (ראה טבלת חומרים) שימש, כפי שהוא מכיל ריאגנטים ספציפי להסרת חומרים מעכבים כגון biosolids, חומר צמח לא מתעכל, ותרכובות מוגלובין מתוך כדוריות דם אדומות להיות שרפרף האדם והעכבר דגימות.
  4. מניחים את הצינור חרוז לתוך הומוגניצר (ראה טבלת חומרים) ו המגון את הדגימות עבור 45 s ב RT ו מהירות של 4.5 m.
    הערה: . כל יצרן יכול לשמש עם זאת, מומלץ לתקנן את השיטה, במיוחד את המהירות והמשך של המגון, כאשר משתמשים באמצעות חרוז הולם מספק אחר.
  5. בודד דנ א מתוך דגימות בצואה של עכבר בודד באמצעות ערכת דנ א חיידקי בידוד בעקבות פרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) עם שינויים קלים. לכמת את ה-DNA מבודדים על ידי טעינת 1 μL של ה-DNA על פלוורימטר או על שבב האלקטרופורזה ברגישות גבוהה (ראה טבלת חומרים).
    הערה: התשואה הצפויה של ה-DNA יכול לנוע מ 500-2500 ng כאשר מתחילים עם 200 מ"ג של דגימת צואה.
  6. להתאים את הריכוז של ה-DNA כדי 4 – 20 ng/μL באמצעות מאגר הימנעות. שאילתה חוזרת על ה-DNA (כפי שנעשה בשלב 2.5) לפני המשך 16S הגברה גנים (PCR1), אם PCR1 לא מבוצעת באותו יום.

3.16S הגברה גנטית (PCR1)

  1. הגדרת הגברה של הגנים של 16 s rRNA (PCR1) ב-PCR 96 היטב הצלחת באמצעות כמות 25 μL תגובה.
  2. באמצעות הצנרת רב-ערוצי, להוסיף 12.5 μL של 2x באיכות גבוהה בתמהיל האנזימים פולימראז כולל מאגר, בנוסף dNTPs (ראה טבלת חומרים): 40 NG של דנ א של עד 10.5 μl סה כ נפח (להתאים את הנפח הכולל עם המים בכיתה PCR): 1 μl (כל) של קדימה והפוך התחל ב 1 μM ריכוז.
    הערה: רצפי התחל הם כדלקמן:
    המשך בהילוך קדמי = 5 '-היפוך מתקדם-3 ' הפוך להילוך אחורי = 5 '-GTCTCGCTVACCATCC-3 '-שלוש '-מתוך שלוש שנות המפתח העצמי של הרוח.... כלול ערכה ריקה משלב 2.3 (בקרת הערכה מגיב) בלוחית ה-PCR.
  3. חותם את צלחת ה-PCR ואת הצנטריפוגה ב 1,000 x g ב 20 ° c עבור 1 דקות בצנטריפוגה לוחית שולחן (ראה טבלת חומרים) ולבצע PCR ב ציקלer תרמית מתוכנת: 95 ° צ' עבור 3 דקות; 25 מחזורים של 1) 95 ° c עבור 30 s, 2) 55 ° צ' עבור 30 s, 3) 72 ° צ' עבור 30 s; הארכה סופית ב 72 ° c עבור 5 דקות; ולהחזיק ב -4 ° c.
    הערה: למרות שיטת הגברה הגנים של 16 s rRNA צריכה לעבוד עם סוגים שונים של ביומינים, מומלץ לתקנן את מספר מחזורי הגברה בעת התחלת פרוייקט חדש.
  4. לאשר את הגודל של מוצר PCR1 על ידי טעינת 1 μL של ה-DNA על שבב האלקטרופורזה רגישות גבוהה. לחילופין, לרוץ 5 μL של 16 s rRNA-מוגבר המוצר על 1.5% agarose ג'ל כדי לאשר 550 bp של המוצר PCR1.
    הערה: ניקוי של מוצר מוגבר של 16S rRNA הוא אופציונלי ותלוי בערכת בידוד DNA/שיטת בשימוש. אם באמצעות שיטת בידוד DNA in-house, מוצר PCR1 ניתן לנקות באמצעות ערכת הטיהור מיקרובידום DNA בהתאם לפרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים). ערכת ה-dna בידוד משמש כאן התשואות DNA באלקטרופורזה ואינו דורש ניקוי של המוצר PCR1.

4. בניית ספריית דנ א באמצעות PCR באינדקס (PCR2)

  1. הציבו את המפתח הראשי באינדקס מיוחד (ראו טבלת חומרים) עבור 96 ספריות.
    1. סדר מדד 1 פריימר בטורים 1 – 12 ו-Index 2 בשורות A – H של מדף מיוחד.
    2. הוסף 2.5 μL של אינדקס 1 בעמודות 1 – 12 ו-Index 2 פריימר בשורות A – H באמצעות פיפטות רב-ערוצי. הניחו את הכיפה החדשה (ראו טבלת חומרים) על האינדקס החדש של מדד 1 ו-index 2 ואחסנו אותה במקפיא של 20 ° c.
  2. באמצעות שימוש בצנרת רב-ערוצית, הוסף 12.5 μL של שילוב האנזים של 2x באיכות גבוהה פולימראז המכיל מאגר, בנוסף ל-dNTPs (ראה טבלת חומרים); 5 μL של מים בכיתה PCR ו 2.5 μL של מוצר מוגבר של 16 s rRNA.
    הערה: הוסף מדדים ייחודיים לכל מדגם לצורך ריבוב של יותר מ-96 ספריות בהפעלה אחת, כמתואר בקיבנן ואח '27. הפרוטוקול הנוכחי משתמש במתאמים מערכה מסחרית (לדוגמה, ערכת האינדקס של Nextera XT) לפי הוראת היצרן המסופקת בשיטת הרצף של מטאגנאומטיקה משנות ה -16 (לדוגמה, הארה).
  3. החותם והצנטריפוגה את לוחית ה-PCR הסדורה באינדקס ב-1,000 x g ב-20 ° c במשך 1 דקות ובצע את ה-PCR בציקלנר תרמי מתוכנת: 95 ° צ' למשך 3 דקות; 8 מחזורים של 1) 95 ° c עבור 30 s, 2) 55 ° צ' עבור 30 s, 3) 72 ° צ' עבור 30 s; והארכה סופית ב 72 ° c עבור 5 דקות.
  4. אשר את גודל הבסיס 630 של מוצר ה-PCR הכלול באינדקס באמצעות טעינת μL של דנ א על שבב של אלקטרופורזה ברגישות גבוהה. לחילופין, לרוץ 5 μL של מוצר ה-PCR באינדקס על 1.5% agarose ג'ל כדי לאשר את הגודל והעוצמה של המוצר.

5. ניקוי של ה-PCR הכלול באינדקס (PCR2) והכמת

  1. בריכה 5 μl של PCR2 אמפליקון באמצעות פיפטות רב ערוצית מכל באר לתוך מגש מאגר רב-ערוצי חינם של dnase לזיהוי, rnase, DNA אנושי, וחיידקים פירוגניים (ראה טבלת חומרים).
  2. העבר את המוצר במאגר ממגש מאגר רב-ערוצי לתוך ריק, מראש מתויג מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ומערבולת לערבב.
  3. טיהור מוצר PCR2 באמצעות ערכת חרוזים מגנטיים סטנדרטית (ראה טבלת חומרים) לפי הוראת היצרן. לאטום ולאחסן את שאר 20 μL של PCR2 באותה צלחת ב-80 ° c לשימוש נוסף, במידת הצורך.
  4. הכינו טרי 80% אתנול על ידי הוספת 4 מ ל של 100% אתנול ל 1 mL של מים בכיתה PCR.
  5. המבטטה את החרוז המגנטי כדי RT ו מערבולת עבור 30 s לפזר את החרוזים באופן שווה.
  6. בקצרה מערבולת ו ספין למטה PCR2 אמפליקון במאגר דגימות.
  7. הוסף 80 μL של חרוזים מגנטיים לתוך מתויג מראש, סטרילי 1.5 mL שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם 80 μL של מוצרי PCR במאגר, ואז מערבולת ו ספין למטה לזמן קצר כדי להשעות באופן שווה את החרוזים המגנטיים.
  8. מודיית את התוכן ב-RT בלי להפריע צינורות עבור 15 דקות.
  9. מניחים את השפופרת עם ה-DNA ו חרוזים מגנטיים על דוכן מגנטי (ראה לוח חומרים) עבור 5 דקות.
  10. בזהירות להסיר ולמחוק 150 μL של supernatant.
  11. הוסף 200 μL של המוכן טרי 80% אתנול בלי להפריע את החרוזים ואת הדגירה של 30 s.
  12. הסר בזהירות, והשמט את כל הסופרנטאנט.
  13. חזור על שלבים 5.11 – 5.12. הסר את אמצעי האחסון הנותרים באמצעות מP10. הניחו לחרוזים להתייבש באוויר במשך 15 דקות, כאשר צינור ה-PCR האינדקסיאלי נותר במעמד המגנטי.
  14. . הסר מהעמדה המגנטית הוסף 33 μL של מאגר הימנעות (מאגר הימנעות של ערכת ה-DNA מקובל). ומערבולת היטב, ולבצע ספין מהיר כדי להסיר את כל הנוזלים הנותרים בצד. דגירה עבור 2 דקות ומקום על המעמד המגנטי עבור 5 דקות.
  15. העברה 30 μL של סופרנטנט (מוצרי PCR נקיים) לצינור מיקרוצנטריפוגה מתויג מראש 1.5 mL.
  16. לכמת את הבריכה מטוהרים על ידי טעינת 1 μL של הבריכה מטוהרים על פלואורימטר או שבב האלקטרופורזה רגישות גבוהה, כמו זה יהיה נדרש במהלך הרצף. בצע את MiSeq כמפורט להלן.

6. רצף מיseq

  1. צור גיליון לדוגמה המכיל פרטי ברקוד ספציפיים לדוגמה עבור זרימת עבודה של מחלקה והפחתת ריבוב בכלי MiSeq (ראה טבלת חומרים). העלה את הגיליון לדוגמה לתוכנה (לדוגמה, מנהל ניסוי המאיר).
  2. לדלל את הספריות במאגר משלב 5.15 כדי 4 ננומטר.
  3. הספרות במאגר על ידי שילוב של 5 μL של 4 בריכת הספרייה ננומטר עם 5 μL של טרי מוכן 0.2 M NaOH בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. מערבולת לזמן קצר כדי לערבב, צנטריפוגה בקצרה ו-דגירה עבור 5 דקות ב-RT הסביבה.
  4. הוסף 990 μL של מאגר הכלאה של קרח קר (HB) ופיפטה בעדינות כדי לערבב. הדבר יגרום לספרייה של 20 pM.
  5. לשלב 2 μL של 10 שליטה בספריית nM עם 3 μL של מאגר EBT (10 מ"מ טריס-HCl, pH = 8.5, עם 0.1% רצף 20) כדי להיכנע 4 ספריית בקרה ננומטר. הוסף 5 μL של טרי מוכן 0.2 N NaOH ומערבולת לזמן קצר כדי לערבב. דגירה עבור 5 דקות ב RT.
  6. הוסף 990 μL הכלאה קר הקרח במאגר (HB מאגר) ו פיפטה בעדינות כדי לערבב. פעולה זו תניב 20 pM שליטה בספריות.
    הערה: ניתן לאחסן ב-20 ° c את הספריות השולטות עד למשך 4 שבועות. לאחר 4 שבועות, מספרי האשכולות נוטים להצטמצם.
    1. שלב 210 μL של הספריה 20 pM עם 40 μL של ספריית הבקרה של 20 pM (ריכוז סופי = ~ 18%), והוסף 350 μL של מאגר HB. העמיסו את הספרייה בריכוז סופי של השעה 19:00.
      הערה: יש לכוונן את פרטי הקלט לפי ביצועי הפעלה.
  7. הדגימות של הדגירה עבור 2 דקות ב 96 ° c. לשים קרח עבור 5 דקות. טען 600 μL של המאגר הסופי לתוך הבאר המתאימה של מחסניות MiSeq.
    הערה: סעיף 6 לעיל ניתן לבצע במתקן גנומית/DNA ליבה.

7. עיבוד נתונים וניתוח רצף

  1. השתמש ב-R תוכנה (גירסה 3.5) עבור עיבוד נתונים וניתוחים DADA2. עבור שלבים 7.1 – 7.4, השתמש בתוכנת גישה פתוחה כפי שמתואר במדריך שפותחה בעבר DADA2 online שנמצאו ב < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
    הערה: סקריפט R שמיש בקלות הוצמד כקובץ משלים 2, ומשתמשים חייבים לשנות את השם ואת המקור של קבצים ברצף (למשל, SAMPLENAME_R1_001. FASTQ ו SAMPLENAME_R2_001. fastq).
  2. המחש את הפרופיל האיכותי של הקריאה קדימה והפוכה באמצעות הפקודה plotQualityProfile .
  3. חיתוך נוקלאוטידים מקדימה וקורא הפוך בהתבסס על מזימת האיכות. פרמטרים אלה מצוינים באמצעות הפרמטר truncLen ב-DADA2.
    הערה: כאן, 280 משמש את סף האורך שבו הקריאות קדימה יימחקו, ו-260 משמש כסף אורך שעבורו הקריאות ההפוכה יימחקו.
  4. לעבד את נתוני 16s raw כמו קבצי fastq על ידי צינור DADA2 כפי שמתואר במדריך המקוון (נמצא ב-< https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >) כדי למזג את R1 ו-R2 קורא וטופס אמפליקון משתני רצף (asvs), אשר משמשים לאחר מכן כדי להקצות באמצעות מאגר הסימוכין של סילבה23.
    הערה: מדגם אמפליקון הטבלה משתנה רצף שנוצר מצינור DADA2 נכלל כקובץ משלים 3. ניתן להשתמש במסד נתונים של Greengene או סילבה, מאחר שלא נמצאו הבדלים בסיווג החיידקי באמצעות אחד ממסדי הנתונים האלה.
  5. צור קובץ מיפוי המוגדר על-ידי המשתמש המכיל את המטא-נתונים (כלומר, גנוטיפ, מין, טיפול וכו ') עבור כל דוגמה. קובץ מטא-נתונים לדוגמה נכלל כקובץ משלים 4.
  6. חישוב מגוון אלפא (שאנון index) ומגוון ביתא באמצעות ניתוח קואורדינטות העיקרי (PCA) מבוסס על ספירות OTU העיקריים באמצעות Phyloseq28 כפי שמתואר במדריך המקוון, נמצאו ב < https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html >.
  7. בצע את הניתוח הבא ב-METAGENassist29.
    הערה:     בצע את ניתוח השפע הדיפרנציאלי באמצעות בדיקת סכום הדרגות של Wilcoxon ברמת הסוג. מפות חום ומטקא שופע מודגשות באמצעות METAGENassist29, צינור ניתוח זמין ומבוסס אינטרנט.
    1. העלה את טבלת השפע הטקמיים (תבנית CSV) ובחר דוגמאות בעמודה.
    2. העלה את קובץ המיפוי (תבנית CSV) ובחר דוגמאות ברציפות.
    3. בחר באפשרויות כדי להסיר משתנים עם למעלה מ-50% אפסים, ולא לכלול קריאות שלא הוקצו ולא ממופות.
    4. בחר באפשרות אפשרויות כדי לנרמל שורות לפי סכום ולבצע רישום של עמודות נרמול.
    5. הפוך הר געש, PCA, או PLSDA plot על-ידי לחיצה זהה בעמודה השמאלית ולחץ על הסר שם דגימות כדי להפוך את הגרף.
    6. בצע מבחן t(אם רק שתי קבוצות) או ANOVA (אם גדול משתי קבוצות) כדי להמחיש את התכונות (חיידקים) שנבדלים בין קבוצות. לחץ על תכונות נבחרות כדי להמחיש חיידקים ספציפיים הנבדלים בין קבוצות.
    7. לחץ על גיגיגרמה או מחממים מפה כדי ליצור מגרשים בהתאמה. ניתן לבצע ניתוח נוסף, כגון הדמיה לדוגמה על-ידי קבוצות או מאפייני t-TEST/ANOVA מבוססי-אנובה.
    8. לחץ על יער אקראי כדי ליצור גרפים המציגים תכונות שניתן להשתמש בהן לסיווג. לחצו על הכרטיסייה ' סטיה ' בחלק העליון כדי ליצור גרפים עבור התכונות העליונות המשתנות בין קבוצות. לחץ על פרטי תכונה כדי לראות רשימה של חיידקים הנבדלים בין קבוצות ולחץ על כל אחד מהbacterium כדי ליצור תקציר גרפי של אותו הדבר.
    9. לחץ על הכרטיסיה Outlier בחלק העליון כדי להמחיש דגימות מהערים.
    10. לבסוף, לחץ על הורד ובחר 1. קובץ zip המכיל את כל הניתוח שבוצע או 2) את התכונות הרצויות להורדה. קובץ זה צריך להישמר כשם ייחודי ויהיה צורך להפעיל אותו לפני השימוש.

הערה: לבדיקות סטטיסטיות מפורטות שבוצעו במהלך ניתוח microbiome, התייחס ליצירותיהם של חן ואח ' והואגרט ואח '.14,30.

תוצאות

כמו mhc class ii מולקולות (hla בבני אדם) הם שחקנים מרכזיים בתגובה החיסונית אדפטיבית להראות אסוציאציות חזקות עם נטייה MS24,25,26, זה היה היפותזה כי hla class ii מולקולה ישפיע. על הרכב מחיידקים לכן, עכברים חסרים את הגן השני MHC מחלקה II (AE. KO) או ביטוי האדם HLA-DQ8 גן...

Discussion

הפרוטוקול המתואר הוא פשוט, עם שלבים קל לבצע כדי לבצע פרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית 16S מספר גדול של ביומינים רבים של עניין. רצף הדור הבא השתנה לימודי אקולוגיה, במיוחד אצל מודלים אנושיים וטרום-קליניים של המחלה31,32. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לנתח ...

Disclosures

א. מ. קיבל תמלוגים מ מאיו קליניק (שילם על ידי אוברו ביולוגיה) כאחד הממציאים של טכנולוגיה הטוענת את השימוש Prevotella histicola לטיפול במחלות אוטואימוניות.

Acknowledgements

המחברים להכיר מימון מתוך NIAID/NIH (1R01AI137075-01), המבתר אמון ביוזמת המחקר הרפואי מענק, ואת אוניברסיטת איווה הסביבה מרכז לחקר הבריאות המרכז, ארני/NIH (P30 ES005605).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml Natural Microcentriguge TubeUSA, Scientific1615-5500Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G3M, MN, US7100038651Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chipAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement CapsIllumina, Inc., CA, USA15026762New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA12855-100DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2X)Kapa Biosystem, MA, USAKK2602PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Fecal collection
Magnetic standNew England BioLabs, MA, USAS1509SFor PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4346906PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR Plate Sealer
Microfuge 20 CentrifugeBeckman Coulter, IN, USAB30154Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation KitIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel TraysASI, FL,USARS71-1For Pooling of PCR2 Product
Plate CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification KitThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 HomogenizerOmni International, GA, USA19-001Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kitThermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854DNA quantification
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large)Lewis Bins, WI, USDV-2280Fecal collection
Vertical Dividers (small)Lewis Bins, WI, USDV-1780Fecal collection

References

  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152DNA16S16S rRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved