JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada açıklanan serbestçe kullanılabilir araçları kullanarak 16S rRNA metagenomik sıralama ve analiz kullanarak mikrobiyom profilleme için basitleştirilmiş bir standart işletim prosedürüdür. Bu protokol mikrobiyom alanında yeni araştırmacılar yanı sıra daha yüksek bir çözünürlükte bakteriyel profilleme elde etmek için yöntemler güncellemeleri gerektiren yardımcı olacaktır.

Özet

İnsan bağırsağı, gıda metabolizması, enerji hasadı ve bağışıklık sisteminin düzenlenmesi gibi fizyolojik işlevleri destekleyen trilyonlarca bakteri tarafından kolonize edilir. Sağlıklı bağırsak mikrobiyomu pertürbasyonu inflamatuar hastalıkların gelişiminde rol oynadığı ileri sürülmüştür, multipl skleroz da dahil olmak üzere (MS). Çevresel ve genetik faktörler mikrobiyomun bileşimini etkileyebilir; bu nedenle, bir hastalık fenotip ile bağlantılı mikrobiyal toplulukların belirlenmesi sağlık ve hastalık mikrobiyom rolünü tanımlama yolunda ilk adım haline gelmiştir. Bakteri topluluğunun profilini çıkarmak için 16S rRNA metagenomik diziliminin kullanılması mikrobiyom araştırmalarının ilerlemesine yardımcı olmuştur. Geniş kullanımına rağmen, 16S rRNA tabanlı taksonomik profilleme analizi için tek tip bir protokol yoktur. Başka bir sınırlama, daha küçük sıralama okumaları gibi teknik güçlükler nedeniyle taksonomik atamanın düşük çözünürlüğü ve ters (R2) okumanın düşük kalitesi nedeniyle son analizde yalnızca ileri (R1) okumaların kullanılmasıdır. Belirli bir biyonumunede bakteri çeşitliliğini karakterize etmek için yüksek çözünürlüğe sahip basitleştirilmiş bir yönteme ihtiyaç vardır. Sıralama teknolojisindeki gelişmeler, daha uzun okumaları yüksek çözünürlükte sıralayabilme özelliği yle bu zorlukların bazılarının üstesinden gelinmeye yardımcı oldu. R tabanlı Bölücü Amplicon Denoising Algoritma-2 (DADA2) gibi kamuya açık metagenomik analiz boru hattı ile birlikte mevcut sıralama teknolojisi, DADA2 cinste sıra atayabilirsiniz gibi, yüksek çözünürlükte mikrobiyal profilleme ilerlemeye yardımcı oldu ve tür düzeyleri. Burada açıklanan 16S rRNA geninin V3-V4 bölgesinin iki aşamalı amplifikasyon kullanarak bakteriyel profilleme gerçekleştirmek için bir rehber, serbestçe kullanılabilir analiz araçları kullanarak analiz takip (yani, DADA2, Phyloseq, ve METAGENassist). Bu basit ve tam iş akışı mikrobiyom profilleme çalışmaları gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar için mükemmel bir araç olarak hizmet olacağına inanılmaktadır.

Giriş

Mikrobiyota belirli bir ortamda yaşayan mikroorganizmaların (bakteri, virüs, arke, bakteriyofaj ve mantarlar) bir koleksiyon anlamına gelir ve mikrobiyom yerleşik mikroorganizmaların kolektif genomu anlamına gelir. Bakteriler insanlarda ve farelerde en bol mikroplardan biri olduğundan, bu çalışma sadece bakteri profilleme üzerinde odaklanmıştır. İnsan bağırsağı trilyonlarca bakteri ve yüzlerce bakteri suşları tarafından kolonize edilir1. Normal bağırsak mikrobiyotası fonksiyonları düzenleyerek konaksağlıklı bir durumun korunmasında hayati bir rol oynar (yani, bozulmamış bir bağırsak bariyerinin bakımı, gıda metabolizması, enerji homeostaz, patojen organizmalar tarafından kolonizasyon inhibisyonu, ve bağışıklık yanıtlarının düzenlenmesi)2,3,4,5. Bağırsak mikrobiyotası (gut disbiyoz) bileşimsel pertürbasyonları gastrointestinal bozukluklar6, obezite7,8, inme9, kanser10dahil olmak üzere insan hastalıkları, bir dizi bağlantılı olmuştur diyabet8,11, romatoid artrit12, alerji13, ve multipl skleroz gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar (MS)14,15 ve Alzheimer hastalık (AD)8,16. Bu nedenle, son yıllarda, farklı vücut sitelerinde bakteri bileşimi tanımlamak için araçlara ilgi artmıştır. Güvenilir bir yöntem, yüksek iş sahibi ve kullanımı kolay olmak, bakteriyel mikrobiyotayı yüksek çözünürlükle sınıflandırma yeteneğine sahip olmak ve düşük maliyetli olmak gibi özelliklere sahip olmalıdır.

Kültür tabanlı mikrobiyolojik teknikler tanımlamak ve kültürde büyümek için çeşitli bağırsak bakterilerin başarısızlığı nedeniyle karmaşık bağırsak mikrobiyom karakterize etmek için yeterince duyarlı değildir. Sıralama tabanlı teknolojinin gelişi, özellikle 16S rRNA tabanlı metagenomik sıralama, bu zorlukların bazılarının üstesinden geldi ve mikrobiyom araştırmadönüştürdü 17. Gelişmiş 16S rRNA tabanlı sıralama teknolojisi insan sağlığında bağırsak mikrobiyomu için kritik bir rol kurulmasında yardımcı oldu. İnsan Mikrobiyom Projesi, Ulusal Sağlık Enstitüleri girişimi18, ve MetaHIT projesi (Bir Avrupa girişimi)19 hem mikrobiyom analizi için temel bir çerçeve kurulmasında yardımcı oldu. Bu girişimler, bağırsak mikrobiyomu'nun insan sağlığı ve hastalığındaki rolünü belirlemek için birden fazla çalışmanın başlatılmasına yardımcı oldu.

Bir dizi grup inflamatuar hastalığı olan hastalarda bağırsak disbiyoz göstermiştir12,14,15,20,21,22. Çok katlı ve düşük maliyetler nedeniyle taksonomik profilleme için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 16S rRNA tabanlı taksonomik profilleme için tek tip protokol bulunmamaktadır. Başka bir sınırlama daha küçük sıralama okuma (150 bp veya 250 bp) ve düşük kaliteli ters sıralama okuma (R2) nedeniyle sadece ileri sıralama okuma (R1) kullanımı nedeniyle taksonomik atama düşük çözünürlüğüdür. Ancak sıralama teknolojisindeki ilerlemeler, eşleştirilmiş uçlu okumaları (örneğin, Illumina MiSeq 2x300bp) kullanarak daha uzun okumaları sıralama yeteneği gibi bu zorlukların bazılarının üstesinden gelinmeye yardımcı oldu.

Mevcut sıralama teknolojisi r1 ve R2 okumabirleştirilmesine olanak sağlayan 600 bp kaliteli okuma, sıralayabilirsiniz. Bu birleştirilmiş daha uzun R1 ve R2 okumaları, özellikle açık erişimli R tabanlı Bölücü Amplicon Paylaştırma Algoritması-2 (DADA2) platformuile daha iyi taksonomik atamalara olanak sağlar. DADA2, QIIME23tarafından kullanılan %97 benzerliğe dayalı operasyonel taksonomik birim (OTU) atamaları yerine amplicon dizi varyantı (ASV) tabanlı atamalar kullanmaktadır. ASV eşleşmeleri, 1-2 nükleotit içinde veritabanında tam bir dizi eşleşmesi ile sonuçlanır ve bu da cins ve tür düzeylerinde atamaya yol açar. Böylece, daha uzun, kaliteli eşleştirilmiş uçlu okumalar ve daha iyi taksonomik atama araçlarının (DADA2 gibi) birleşimi mikrobiyom çalışmalarını dönüştürmüştür.

Burada 16S rRNA V3-V4 bölgenin iki adım amplifikasyon ve DADA2, Phyloseq ve METAGENassist boru hatları kullanarak veri analizi kullanarak bakteriyel profilleme gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuzdur. Bu çalışmada, insan lökosit antijeni (HLA) sınıf II transgenik fareler kullanılır, bazı HLA sınıf II alelleri MS20gibi otoimmün hastalıklara yatkınlık ile bağlantılı olduğu gibi,24,25. Ancak, bağırsak mikrobiyotasının bileşimini düzenleyen HLA sınıf II genlerinin önemi bilinmemektedir. HLA sınıf II molekülünün belirli bakteriler için seçerek bağırsak mikrobiyal topluluğunu etkileyeceği varsayımında dır. Majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf II nakavt fareler (AE.KO) veya insan HLA-DQ8 moleküllerini ifade eden fareler (HLA-DQ8)24,25,26 HLA sınıfı II moleküllerinin önemini anlamak için kullanılmıştır. bağırsak mikrobiyal topluluk şekillendirme. Bu R tabanlı veri analizi ile bu tam ve basitleştirilmiş iş akışı mikrobiyom profilleme çalışmaları gerçekleştirmek isteyen araştırmacılar için mükemmel bir araç olarak hizmet olacağına inanılmaktadır.

Endojen murine MHC sınıfı II genleri (AE.KO) ve AE-/-yoksun farelerin üretimi . HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) C57BL/6J arka planlı transgenik fareler daha önce26tanımlanmıştır. Dışkı örnekleri her iki cinsten (8-12 haftalık) farelerden toplanır. Fareler daha önce NIH ve kurumsal kurallar uyarınca Iowa Üniversitesi hayvan tesisinde yetiştirildi ve bakımını yapıyordu. Laminar akış dolabı içinde farelerin kesilmesi, farklı fare suşları arasında eldiven lerin değiştirilmesi ve farelerin düzgün bakımı gibi kontaminasyon kontrol stratejileri bağırsak mikrobiyomu profilleme için kritik adımlardır.

Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) şiddetle tüm prosedür sırasında tavsiye edilir. DNA izolasyonu, PCR1 ve PCR2 amplifikasyonve sıralama adımları gerçekleştirirken uygun negatif kontroller eklenmelidir. Steril, DNase içermeyen, RNase içermeyen ve pirojen içermeyen malzemelerin kullanılması tavsiye edilir. Protokol boyunca mikrobiyom çalışmaları için belirlenmiş pipettor ve filtrelenmiş pipet uçları kullanılmalıdır. Mikrobiyota analizi yedi adımdan oluşur: 1) dışkı numunetoplama ve işleme; 2) DNA çıkarma; 3) 16S rRNA gen amplifikasyonu; 4) DNA kitaplığı yapı indeksli PCR kullanarak; 5) temizleme ve dizinlenmiş PCR (kütüphane) niceliksel; 6) MiSeq sıralaması; ve 7) veri işleme ve dizi analizi. Tüm protokol adımlarının şematik diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir.

Protokol

Protokol Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Dışkı Numunesi Toplama ve Taşıma

  1. Bölücü kutularını sterilize edin (bkz. Malzemeler Tablosu, Ek Şekil 1) %70 etanol ile.
  2. Numune kimliği ve tedavi grubu (varsa) ile ön etiketli mikrosantrifüj tüpleri (fare başına bir)
  3. Fareleri sterilize edilmiş bölücü kutularına yerleştirin ve normal olarak 1 saate kadar dışkılayabilmelerine izin verin.
  4. Dışkı peletlerini steril forceps kullanarak boş, önceden etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpte toplayın ve tüpü güvenli bir şekilde kapatın. Her fareden topladıktan sonra forceps sterilize.
  5. Dışkı peletleri içeren mikrosentrifüge tüpü -80 °C'lik bir derin dondurucuya ilave işleme ye kadar yerleştirin.
    NOT: Bölücü kutuları avantajlıdır, çünkü aynı anda birden fazla fareden (12'ye kadar) dışkı örneklerinin aynı anda toplanmasına izin verirler.

2. DNA çıkarma

  1. Dışkı örneklerini (fare veya insan) dondurucudan çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) çözülür.
    NOT: 200 mg veya stok numunelerinden gerekli miktarda insan dışkısı numunelerinin bir gecede 4 °C'de çözülmesi tavsiye edilir.
  2. 200 mg başlangıç malzemesi kullanın ve DNA'yı 50 μL'lik son bir hacimde ejekte edin.
  3. Dışkı örneğinin eklenmiş olduğu ancak tüm DNA çıkarma adımlarında işlendiği boş bir DNA izolasyon kiti ekleyin.
    NOT: Biyosolids, sindirilmemiş bitki materyali ve insan ve fare dışkısında bulunan lysed kırmızı kan hücrelerinden heme bileşikleri gibi inhibe edici maddeleri kaldırmak için özel reaktifler içerdiğinden, spesifik bir DNA izolasyon kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)kullanılmıştır. Örnekleri.
  4. Boncuk tüpünü bir homojeneratöre yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu)ve numuneleri RT'de 45 s ve 4,5 m/s hızda homojenize edin.
    NOT: Herhangi bir üreticiden boncuk-dayak homogenizer kullanılabilir. Ancak, başka bir satıcıdan boncuk döven homogenizer kullanırken yöntemi, özellikle de homojenizasyon hızını ve süresini standartlaştırmak önerilir.
  5. Üreticinin protokolünü (Bkz. Malzemeler Tablosu)izleyerek küçük değişikliklerle bir bakteridna izolasyon kiti kullanarak tek tek fare dışkı örneklerinden DNA'yı ayırın. İzole EDILMIŞ DNA'yı florimetreye veya yüksek duyarlılıklı elektroforez yongasına yükleyerek izole edilmiş DNA'yı ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: DıŞKı örneğinin 200 mg ile başlayarak DNA'nın beklenen verimi 500-2.500 ng arasında olabilir.
  6. Elüsyon tamponu kullanarak DNA konsantrasyonu 4-20 ng/μL'ye ayarlayın. PCR1 aynı gün yapılmazsa, 16S rRNA gen amplifikasyonuna (PCR1) geçmeden önce DNA'yı (adım 2.5'te yapıldığı gibi) yeniden ölçün.

3. 16S rRNA Gen Amplifikasyonu (PCR1)

  1. 25 μL reaksiyon hacmi kullanarak 96 iyi pcr plakaiçinde 16S rRNA gen amplifikasyonu (PCR1) ayarlayın.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tampon dahil 12,5 μL 2kat yüksek sadakatpolimeraz enzim karışımı ekleyin, dNTPs'ye ek olarak (bkz. Malzeme Tablosu):10,5 μL'ye kadar toplam hacimde 40 ng DNA (PCR sınıfı su ile toplam hacmi ayarlayın): 1 μL (her biri) ileri ve 1 μM konsantrasyonda ters astarlar.
    NOT: Astardizileri aşağıdaki gibidir:
    ileri astar = 5'-TCGTCGGCAGCGTCA GATGTGTATAAGAGA CAGCCTACGGGNGGNGGCWGCAG-3' ters astar = 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTA TAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC C-3'. PCR plakaya adım 2.3'ten (kit reaktif kontrolü) boş bir kit ekleyin.
  3. PCR plakasını ve santrifüjünü 20 °C'de 1 000 x g'da bir masa üstü plaka santrifüjünde 1 dakika (Malzeme Tablosunabakınız) kapatın ve PCR'yi 3 dk için 95 °C programlanmış bir termal döngüde gerçekleştirin; 25 devir 1) 30 s için 95 °C, 30 s için 2) 55 °C, 30 s için 32 °C; 5 dk için 72 °C'de son uzatma; ve 4 °C'de tutun.
    NOT: Bu 16S rRNA gen amplifikasyon yöntemi farklı biyonumune türleri ile çalışsa da, yeni bir projeye başlarken amplifikasyon döngülerinin sayısını standartlaştırmak tavsiye edilir.
  4. YÜKSEK hassasiyetli elektroforez çipine 1 μL DNA yükleyerek PCR1 ürününün boyutunu doğrulayın. Alternatif olarak, PCR1 ürününün 550 bp'sini onaylamak için %1,5 agarose jel üzerinde 5 μL 16S rRNA amplifiye edilmiş ürün çalıştırın.
    NOT: 16S rRNA amplifiye ürün ünün temizlenmesi isteğe bağlıdır ve kullanılan DNA izolasyon kitine/yöntemine bağlıdır. Şirket içi DNA izolasyon yöntemi kullanılıyorsa, PCR1 ürünü üreticinin protokolüne göre mikrobiyom DNA arıtma kiti kullanılarak temizlenebilir (bkz. Malzemeler Tablosu). Burada kullanılan DNA izolasyon kiti ultra saf bir DNA verir ve PCR1 ürününün temizlenmesini gerektirmez.

4. DNA Kütüphane İnşaat Indeksli PCR (PCR2) kullanarak

  1. 96 kitaplık için Index 1 ve Index 2 barkodlu astarları özel bir rafa yerleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu).
    1. Özel rafın A-H satırlarında 1-12 sütunlarında Index 1 astarını ve Dizin 2 astarını düzenleyin.
    2. Çok kanallı pipetler kullanarak A-H satırlarında 1-12 sütunlarına Dizin 1'in 2,5 l'sini ve Dizin 2 astarını ekleyin. Yeni kapağı (Bkz. Malzemeler Tablosu)Index 1 ve Index 2 benimseyen astarların üzerine yerleştirin ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
  2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 12,5 μL 2x yüksek fidelity polimeraz enzim karışımı içeren bir tampon içeren ekleyin, dNTPs ek olarak(Malzeme Tablosu bakınız); 5 μL PCR sınıfı su ve 2,5 μL 16S rRNA amplifiye ürün.
    NOT: Kiernan ve ark.27'deaçıklandığı gibi, tek bir çalıştırmada 96'dan fazla kitaplık ların çokleksi için her örneğe benzersiz endeksler ekleyin. Bu protokol, 16S metagenomik sıralama yönteminde (örneğin, Illumina) üreticinin talimatına göre ticari bir kitten adaptörler (örneğin, Nextera XT Index Kit) kullanır.
  3. Endeksli PCR plakayı 1 dk için 20 °C'de 1.000 x g'da mühürleyin ve santrifüj edinve PCR'yi 3 dk için 95 °C'lik bir termal döngüde gerçekleştirin; 8 devir 1) 30 s için 95 °C, 30 s için 2) 55 °C, 30 s için 32 °C; ve son uzatma 72 °C için 5 dakika.
  4. İndekslenmiş PCR ürününün 630 baz boyutunu yüksek hassasiyetli elektroforez çipine 1 μL DNA yükleyerek doğrulayın. Alternatif olarak, ürünün boyutunu ve yoğunluğunu doğrulamak için %1,5 agarose jel üzerinde 5 μL indeksli PCR ürünü çalıştırın.

5. Dizinlenmiş PCR (PCR2) ve Nicelemenin Temizlenmesi

  1. Havuz 5 μL PCR2 amplicon her kuyudan çok kanallı pipetler kullanarak bir çok kanallı rezervuar tepsiiçine tespit dNase, RNase, insan DNA'sı ve Pirojenik bakteriler (Malzeme Tablosubakınız).
  2. Havuzlu ürünü çok kanallı rezervuar tepsisinden, karıştırmak için boş, önceden etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüp ve girdap içine aktarın.
  3. PcR2 ürününün üreticinin talimatına göre standart manyetik boncuk kitini(Bkz. Malzeme Tablosu)kullanarak arındırın. Kalan 20 μL PCR2'yi daha fazla kullanım için -80 °C'de aynı plakada saklayın ve saklayın.
  4. 1 mL PCR sınıfı suya %100 etanol 4 mL ekleyerek taze %80 etanol hazırlayın.
  5. Manyetik boncukları RT ve girdap için 30 s eşit olarak dağıtmak için dengeleyin.
  6. Kısaca girdap ve havuzlu PCR2 amplicon örnekleri aşağı spin.
  7. 80 μL havuzlu PCR ürünü ile önceden etiketlenmiş, steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe 80 μL manyetik boncuk ekleyin, ardından girdap ve manyetik boncukları eşit olarak yeniden askıya almak için kısa bir süre aşağı doğru döndürün.
  8. 15 dakika tüpleri rahatsız etmeden RT içeriğini kuluçkaya yatırın.
  9. Tüpü DNA ve manyetik boncuklarla birlikte manyetik bir standa yerleştirin(Bkz. Malzeme Tablosu)5 dakika boyunca.
  10. Supernatant'ın 150 μL'sini dikkatlice çıkarın ve atın.
  11. Boncukları rahatsız etmeden 200 μL taze hazırlanmış %80 etanol ekleyin ve 30 s'lik kuluçkaya yatırın.
  12. Dikkatlice çıkarın ve tüm supernatant atın.
  13. Adımları 5.11-5.12'yi yineleyin. P10 pipetiyle kalan hacmi çıkarın. Dinedik PCR tüpü manyetik standda kalan, 15 dakika boyunca hava-kuru izin verin.
  14. Manyetik standdan çıkarın. 33 μL elüsyon arabelleği ekleyin (DNA kitinin elüsyon tamponu kabul edilebilir). Girdap iyi, ve tarafında kalan sıvı kaldırmak için hızlı bir spin gerçekleştirin. 2 dk ve 5 dk için manyetik stand üzerinde yer için kuluçka.
  15. Süpernatantın (temiz PCR ürünleri) 30 μL'sini önceden etiketlenmiş 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın.
  16. Arındırılmış havuzu, arındırılmış havuzun 1 μL'sini florimetre veya yüksek hassasiyetli elektroforez yongası üzerine yükleyerek ölçün, çünkü sıralama sırasında bu gerekli olacaktır. MiSeq'i aşağıda ayrıntılı olarak gerçekleştirin.

6. MiSeq Sıralama

  1. MiSeq cihazında metagenomik iş akışı ve demultiplexing için örneğe özgü barkod bilgilerini içeren örnek bir sayfa oluşturun(bkz. Bu örnek sayfayı yazılıma yükleyin (örneğin, Illumina Deney Yöneticisi).
  2. Havuzlu kütüphaneleri adım 5,15'ten 4 nM'ye seyreltin.
  3. Dennature, 4 nM kütüphane havuzunun 5 μL'sini, 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpte yeni hazırlanmış 0,2 M NaOH ile birleştirerek kütüphaneleri birleştirerek bir araya getiren kütüphaneleri bir araya getiren kütüphaneleri bir araya getiren kütüphaneler. Girdap kısaca karıştırmak için, kısa bir süre santrifüj ve ortam RT 5 dakika için kuluçka.
  4. Karıştırmak için 990 μL buz gibi hibridizasyon tamponu (HB tamponu) ve pipet ekleyin. Bu 20 pM kitaplık verecektir.
  5. 10 nM kontrol kitaplığından 2 μL'sini 3 μL EBT tamponuyla (10 mM Tris-HCl, pH = %0,1 Ara 20 ile) birleştirerek 4 nM kontrol kitaplığı elde edin. Karıştırmak için 5 μL taze hazırlanmış 0,2 N NaOH ve girdap ekleyin. RT 5 dakika kuluçka.
  6. Karıştırmak için 990 μL buz gibi hibridizasyon tamponu (HB tamponu) ve pipet ekleyin. Bu 20 pM kontrol kitaplıkları verecektir.
    NOT: Denatüre 20 pM kontrol kütüphaneleri -20 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir. 4 hafta sonra küme sayıları azalma eğilimindedir.
    1. 20 pM kitaplığın 210 μL'sini 20 pM kontrol kitaplığıyla 40 μL'lik (son konsantrasyon = ~%18) birleştirin ve 350 μL HB tampon ekleyin. Kütüphaneyi 7 pM'lik son konsantrasyonda yükleyin.
      NOT: Giriş ayrıntıları, çalışma performansına göre ayarlanmalıdır.
  7. 96 °C'de 2 dk kuluçka numunesi. 5 dk. Son havuzun 600 μL'sini MiSeq kartuşlarının uygun kuyularına yükleyin.
    NOT: Yukarıdaki Bölüm 6 genomik/DNA çekirdek tesisinde yapılabilir.

7. Veri İşleme ve Dizi Analizi

  1. DADA2 veri işleme ve analizleri için R yazılımLarını (sürüm 3.5) kullanın. 7.1-7.4 adımları için, daha önce geliştirilmiş DADA2 çevrimiçi öğreticisinde belirtildiği gibi açık erişim yazılımını kullanın .
    NOT: Bir hazır R komut dosyası Ek Dosya 2olarak eklenmiştir ve kullanıcıların adını ve dizileme dosyalarının kaynağını değiştirmeleri gerekir (örneğin, SAMPLENAME_R1_001.fastq ve SAMPLENAME_R2_001.fastq).
  2. PlotQualityProfile komutunu kullanarak ileri ve geri okumaların kalite profillerini görselleştirin.
  3. Kalite çizimine göre ileri ve geri okumalardan nükleotidleri kırpın. Bu parametreler DADA2'deki truncLen parametresi ile belirtilir.
    NOT: Burada, 280, ileri okumaların atılacağı uzunluk eşiği olarak, 260 ise ters okumaların atılacağı uzunluk eşiği olarak kullanılır.
  4. Çevrimiçi öğreticide belirtildiği gibi DADA2 boru hattı tarafından raw 16S verilerini fastq dosyaları olarak işleyin (bulunan ) R1 ve R2 okumalarını birleştirmek ve amplicon dizileri (ASV'ler) oluşturmak için daha sonra atamak için kullanılır Silva referans veritabanı23ile takson .
    NOT: DADA2 ardışık boru hattından oluşturulan örnek amplicon dizi varyant tablosu Ek Dosya 3olarak eklenmiştir. Bu veritabanlarından herhangi biri kullanılarak bakteri sınıflandırmasında herhangi bir farklılık bulunmadığından, Greengene veya Silva referans veritabanı kullanılabilir.
  5. Her örnek için meta verileri (örneğin, genotip, cinsiyet, tedavi, vb.) içeren kullanıcı tanımlı bir eşleme dosyası oluşturun. Örnek bir meta veri dosyası Ek Dosya 4olarak eklenmiştir.
  6. Alfa çeşitliliğini (Shannon indeksi) ve beta çeşitliliğini temel koordinat analizini (PCA) kullanarak hesaplayın, online eğitimde belirtildiği gibi Phyloseq28'i kullanarak nadir bulunan OTU sayılarını temel alınarak, .
  7. METAGENassist29'daaşağıdaki analizleri gerçekleştirin.
    NOT:     Cins düzeyinde Wilcoxon sıralama toplamı testini kullanarak diferansiyel bolluk analizini gerçekleştirin. Isı haritaları ve farklılıkla bol takson METAGENassist29kullanılarak vurgulanır, kamuya açık ve web tabanlı analiz boru hattı.
    1. Taksonomik bolluk tablosunu (CSV biçimi) yükleyin ve sütundaki Örnekleriseçin.
    2. Eşleme dosyasını yükleyin (CSV biçimi) ve örneklerin üst üsteolduğunu seçin.
    3. %50'den fazla sıfıra sahip değişkenleri kaldırmak ve atanmamış ve eşlenmemiş okumaları hariç tutmak için Seçenekler'i seçin.
    4. Satırları toplulaştırmaya göre normalleştirmek ve sütunları normalleştirmek için Seçenekler'i seçin.
    5. Sol sütunda aynı tıklatarak bir Volcano, PCA veya PLSDA arsa olun ve grafik yapmak için örnekleri adı kaldır'ı tıklatın.
    6. Gruplar arasında farklılık gösteren özellikleri (bakterileri) görselleştirmek için bir t-testi (yalnızca iki grup varsa) veya ANOVA (iki gruptan büyükse) gerçekleştirin. Gruplar arasında farklılık gösteren belirli bakterileri görselleştirmek için Seçili özellikleri tıklatın.
    7. İlgili çizimler oluşturmak için Dendrogram veya Isı haritasını tıklatın. Gruplara göre örnek görselleştirme veya t-test/ANOVA tabanlı top 25 özelliği gibi ek analizler yapılabilir.
    8. Sınıflandırma için kullanılabilecek özellikleri gösteren grafikler oluşturmak için RandomForest'ı tıklatın. Gruplar arasında/gruplar arasında farklılık gösteren üst özellikler için grafikler oluşturmak için üstteki Varyans sekmesini tıklatın. Gruplar arasında farklılık gösteren bakterilerin listesini görmek ve aynının grafiksel bir özetini oluşturmak için her bakteriyi tıklatmak için Özellik ayrıntılarını tıklatın.
    9. Aykırı örnekleri görselleştirmek için üstteki Outlier sekmesini tıklatın.
    10. Son olarak, İndir'i tıklatın ve 1) yapılan tüm analizleri veya indirmek için istenen özellikleri içeren bir zip dosyası seçin. Bu dosya benzersiz bir ad olarak kaydedilmelidir ve kullanmadan önce fermuarSız olması gerekir.

NOT: Mikrobiyom analizi sırasında yapılan ayrıntılı istatistiksel testler için Chen ve ark. ve Hugerth ve ark.14,30çalışmalarına bakın.

Sonuçlar

MHC sınıf II molekülleri (insanlarda HLA) adaptif bağışıklık yanıtı merkezi oyuncular ve MS24,25,26bir yatkınlık ile güçlü dernekler göstermek gibi, bu HLA sınıf II molekülü hipotez oldu bağırsak mikrobiyal bileşimini etkiler. Bu nedenle, MHC sınıf II geni (AE.KO) veya insan HLA-DQ8 geni (HLA-DQ8) ifade eksikliği fareler bağırsak mikrobiyal topluluk şekillendirmede HLA sınıf II moleküllerinin öne...

Tartışmalar

Açıklanan protokol basittir ve çok sayıda biyonumuneden 16S rRNA metagenomik sıralama kullanarak mikrobiyom profilleme gerçekleştirmek için kolay takip edilen adımlar vardır. Yeni nesil sıralama mikrobiyal ekoloji çalışmaları dönüştürdü, özellikle insan ve pre-klinik hastalık modelleri31,32. Bu tekniğin en büyük avantajı, belirli bir biyonumunede karmaşık mikrobiyal bileşimleri (culturable ve un-culturable mikroplar) yüksek bir veri ...

Açıklamalar

A. M. Otoimmün hastalıkların tedavisinde Prevotella histicola kullanımı iddia eden bir teknolojinin mucitlerinden biri olarak Mayo Clinic (Evelo Biosciences tarafından ödenen) telif hakkı aldı.

Teşekkürler

Yazarlar NIAID / NIH (1R01AI137075-01), Carver Trust Tıbbi Araştırma Girişimi Hibe ve University of Iowa Çevre Sağlığı Bilimleri Araştırma Merkezi, NIEHS / NIH (P30 ES005605) gelen finansman kabul.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Natural Microcentriguge TubeUSA, Scientific1615-5500Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G3M, MN, US7100038651Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter, IN, USAA63880PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENTAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chipAgilent Technologies, CA, USA5067-1504DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement CapsIllumina, Inc., CA, USA15026762New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil KitMoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA12855-100DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)Kapa Biosystem, MA, USAKK2602PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider BoxesLewis Bins, WI, USND03080Fecal collection
Magnetic standNew England BioLabs, MA, USAS1509SFor PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4346906PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA4311971PCR Plate Sealer
Microfuge 20 CentrifugeBeckman Coulter, IN, USAB30154Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3Illumina, Inc., CA, USAMS-102-3003For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation KitIllumina, Inc., CA, USAFC-131-100116S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel TraysASI, FL,USARS71-1For Pooling of PCR2 Product
Plate CetrifugeThermo Fisher Scientific, CA, USA75004393For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX ControlIllumina, Inc., CA, USAFC-110-3001For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification KitThermo Fisher Scientific, CA, USAA29789For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 HomogenizerOmni International, GA, USA19-001Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kitThermo Fisher Scientific, CA, USAQ32854DNA quantification
TruSeq Index Plate FixtureIllumina, Inc., CA, USAFC-130-1005For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large)Lewis Bins, WI, USDV-2280Fecal collection
Vertical Dividers (small)Lewis Bins, WI, USDV-1780Fecal collection

Referanslar

  1. Lynch, S. V., Pedersen, O. The Human Intestinal Microbiome in Health and Disease. New England Journal of Medicine. 375 (24), 2369-2379 (2016).
  2. Blacher, E., Levy, M., Tatirovsky, E., Elinav, E. Microbiome-Modulated Metabolites at the Interface of Host Immunity. Journal of Immunology. 198 (2), 572-580 (2017).
  3. Jarchum, I., Pamer, E. G. Regulation of innate and adaptive immunity by the commensal microbiota. Current Opinion in Immunology. 23 (3), 353-360 (2011).
  4. Rescigno, M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity. Trends in Immunology. 32 (6), 256-264 (2011).
  5. Zhang, K., Hornef, M. W., Dupont, A. The intestinal epithelium as guardian of gut barrier integrity. Cell Microbiology. 17 (11), 1561-1569 (2015).
  6. Ghoshal, U. C., Park, H., Gwee, K. A. Bugs and irritable bowel syndrome: The good, the bad and the ugly. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 25 (2), 244-251 (2010).
  7. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444 (7122), 1022-1023 (2006).
  8. Naseer, M. I., et al. Role of gut microbiota in obesity, type 2 diabetes and Alzheimer's disease. CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 13 (2), 305-311 (2014).
  9. Yin, J., et al. Dysbiosis of Gut Microbiota With Reduced Trimethylamine-N-Oxide Level in Patients With Large-Artery Atherosclerotic Stroke or Transient Ischemic Attack. Journal of American Heart Association. 4 (11), (2015).
  10. Azcarate-Peril, M. A., Sikes, M., Bruno-Barcena, J. M. The intestinal microbiota, gastrointestinal environment and colorectal cancer: a putative role for probiotics in prevention of colorectal cancer. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 401-424 (2011).
  11. Su, M., et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS ONE. 13 (10), 0205695 (2018).
  12. Horta-Baas, G., et al. Intestinal Dysbiosis and Rheumatoid Arthritis: A Link between Gut Microbiota and the Pathogenesis of Rheumatoid Arthritis. Journal of Immunological Research. , 4835189 (2017).
  13. Panzer, A. R., Lynch, S. V. Influence and effect of the human microbiome in allergy and asthma. Current Opinion in Rheumatology. 27 (4), 373-380 (2015).
  14. Chen, J., et al. Multiple sclerosis patients have a distinct gut microbiota compared to healthy controls. Science Reports. 6, 28484 (2016).
  15. Tremlett, H., et al. Gut microbiota composition and relapse risk in pediatric MS: A pilot study. Journal of Neurological Science. 363, 153-157 (2016).
  16. Pistollato, F., et al. Role of gut microbiota and nutrients in amyloid formation and pathogenesis of Alzheimer disease. Nutritional Reviews. 74 (10), 624-634 (2016).
  17. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 108, 4516-4522 (2011).
  18. Turnbaugh, P. J., et al. The human microbiome project. Nature. 449 (7164), 804-810 (2007).
  19. Dusko Ehrlich, S. Meta, H.I.T.c. Metagenomics of the intestinal microbiota: potential applications. Gastroenterologie Clinique et Biologique. 34, 23-28 (2010).
  20. Jangi, S., et al. Alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. Nature Communications. 7, 12015 (2016).
  21. Miyake, S., et al. Dysbiosis in the Gut Microbiota of Patients with Multiple Sclerosis, with a Striking Depletion of Species Belonging to Clostridia XIVa and IV Clusters. PLoS ONE. 10 (9), 0137429 (2015).
  22. Shahi, S. K., Freedman, S. N., Mangalam, A. K. Gut microbiome in multiple sclerosis: The players involved and the roles they play. Gut Microbes. 8 (6), 607-615 (2017).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. Das, P., et al. Complementation between specific HLA-DR and HLA-DQ genes in transgenic mice determines susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis. Human Immunology. 61 (3), 279-289 (2000).
  25. Mangalam, A. K., Rajagopalan, G., Taneja, V., David, C. S. HLA class II transgenic mice mimic human inflammatory diseases. Advances in Immunology. 97, 65-147 (2008).
  26. Mangalam, A., et al. HLA-DQ8 (DQB1*0302)-restricted Th17 cells exacerbate experimental autoimmune encephalomyelitis in HLA-DR3-transgenic mice. Journal of Immunology. 182 (8), 5131-5139 (2009).
  27. Kiernan, M. G., et al. The Human Mesenteric Lymph Node Microbiome Differentiates Between Crohn's Disease and Ulcerative Colitis. Journal of Crohn's & Colitis. 13 (1), 58-66 (2019).
  28. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: an R package for reproducible interactive analysis and graphics of microbiome census data. PLoS ONE. 8 (4), 61217 (2013).
  29. Arndt, D., et al. METAGENassist: a comprehensive web server for comparative metagenomics. Nucleic Acids Research. 40, 88-95 (2012).
  30. Hugerth, L. W., Andersson, A. F. Analysing Microbial Community Composition through Amplicon Sequencing: From Sampling to Hypothesis Testing. Frontiers in Microbiology. 8, 1561 (2017).
  31. Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PLoS ONE. 10 (2), 0117617 (2015).
  32. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13 (9), 601-612 (2012).
  33. Buermans, H. P., den Dunnen, J. T. Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochimica et Biophysica Acta. 1842 (10), 1932-1941 (2014).
  34. Cai, L., Ye, L., Tong, A. H., Lok, S., Zhang, T. Biased diversity metrics revealed by bacterial 16S pyrotags derived from different primer sets. PLoS ONE. 8 (1), 53649 (2013).
  35. Kuczynski, J., et al. Experimental and analytical tools for studying the human microbiome. Nature Reviews Genetics. 13 (1), 47-58 (2011).
  36. Mangalam, A., et al. Human Gut-Derived Commensal Bacteria Suppress CNS Inflammatory and Demyelinating Disease. Cell Reports. 20 (6), 1269-1277 (2017).
  37. Shahi, S. K., et al. Prevotella histicola, A Human Gut Commensal, Is as Potent as COPAXONE(R) in an Animal Model of Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 462 (2019).
  38. Bliss, D. Z., et al. Comparison of subjective classification of stool consistency and stool water content. Journal of Wound Ostomy & Continence Nursing. 26 (3), 137-141 (1999).
  39. Kim, D., et al. Optimizing methods and dodging pitfalls in microbiome research. Microbiome. 5 (1), 52 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 25 (2), 407-416 (2016).
  41. Salonen, A., et al. Comparative analysis of fecal DNA extraction methods with phylogenetic microarray: effective recovery of bacterial and archaeal DNA using mechanical cell lysis. Journal of Microbiological Methods. 81 (2), 127-134 (2010).
  42. Santiago, A., et al. Processing faecal samples: a step forward for standards in microbial community analysis. BMC Microbiology. 14, 112 (2014).
  43. Glassing, A., Dowd, S. E., Galandiuk, S., Davis, B., Chiodini, R. J. Inherent bacterial DNA contamination of extraction and sequencing reagents may affect interpretation of microbiota in low bacterial biomass samples. Gut Pathogens. 8, 24 (2016).
  44. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  45. Weiss, S., et al. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biology. 15 (12), 564 (2014).
  46. Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: an effective distance metric for microbial community comparison. ISME Journal. 5 (2), 169-172 (2011).
  47. Schloss, P. D. Evaluating different approaches that test whether microbial communities have the same structure. ISME Journal. 2 (3), 265-275 (2008).
  48. Xia, Y., Sun, J. Hypothesis Testing and Statistical Analysis of Microbiome. Genes & Diseases. 4 (3), 138-148 (2017).
  49. Malla, M. A., et al. Exploring the Human Microbiome: The Potential Future Role of Next-Generation Sequencing in Disease Diagnosis and Treatment. Frontiers in Immunology. 9, 2868 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 152D k DNA karmak t phane haz rlama16S de i ken b lge16S rRNA yeni nesil s ralamaba rsak mikrobiyota

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır