2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

요약

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

초록

인간의 창 자 음식 대사 등 생리 기능을 지 워 하는 박테리아의 수조에 의해 식민지화, 에너지 수확, 그리고 면역 체계의 규칙. 건강한 장내 미생물군유전체의 교란은 다발성 경화증(MS)을 포함한 염증성 질환의 발병에 역할을 하는 것으로 제안되었다. 환경 및 유전 적 요인은 미생물군유전체의 조성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 질병 표현형과 연결된 미생물 군사회의 확인은 건강과 질병에 있는 미생물군유전체의 역할을 정의하는 쪽으로 첫번째 단계가 되었습니다. 세균 성 커뮤니티 프로파일링을 위한 16S rRNA 메타지놈 시퀀싱의 사용은 미생물군유전체 연구를 발전시키는 데 도움이 되었습니다. 그것의 넓은 사용에도 불구하고, 16S rRNA 기지를 둔 분류학 프로파일링 분석을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 한계는 작은 시퀀싱 읽기와 같은 기술적 어려움으로 인한 분류학적 할당의 낮은 해상도뿐만 아니라 역방향(R2) 읽기의 낮은 품질로 인해 최종 분석에서 만 전달(R1)의 사용이 읽힌다. 주어진 생물 표본에서 세균의 다양성을 특성화하기 위해 고해상도로 단순화 된 방법이 필요합니다. 고해상도에서 더 이상 읽기를 순서대로 정렬할 수 있는 시퀀싱 기술의 발전은 이러한 과제를 극복하는 데 도움이 되었습니다. 현재시퀀싱 기술은 R 기반 분열 Amplicon Denoising 알고리즘-2(DADA2)와 같은 공개적으로 이용 가능한 메타지노믹 분석 파이프라인과 결합되어 다다2가 속에서 서열을 할당할 수 있기 때문에 고해상도에서 미생물 프로파일링을 진행하는 데 도움이 되었습니다. 종 수준. 여기서 설명된 것은 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역의 2단계 증폭을 이용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 가이드이며, 이어서 자유롭게 이용 가능한 분석 도구(즉, DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist)를 사용하여 분석한다. 이 간단하고 완전한 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구에 관심이 있는 연구자들을 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

서문

미생물은 특정 환경에 서식하는 미생물(박테리아, 바이러스, 고고학, 박테리오파지 및 곰팡이)의 집합체를 말하며, 미생물군유전체는 상주 미생물의 집단 게놈을 의미한다. 박테리아는 인간과 마우스에 있는 가장 풍부한 세균의 한개이기 때문에, 이 연구 결과는 세균성 프로파일링에만 집중됩니다. 인간의 창 자 박테리아와 세균 균의 수백의 수조에 의해^{식민지화 1.} 정상적인 장내 미생물은 기능 조절(즉, 그대로 장 장벽 유지, 식품 대사, 에너지 항상성, 병원성 유기체에 의한 식민지화 억제) 및 면역 반응의 조절)^2,3,4,5. 창자 미생물의 조성 섭동(gut dysbiosis)은 위장장애^6,비만^7,8,뇌졸중^9,암^10,위장장애 등 다수의 인간 질환과 관련이 있다. 당뇨병^8,11,류마티스 관절염^12,알레르기^13,다발성 경화증 (MS)^14,15 및 알츠하이머병과 같은 중추 신경계 관련 질환 질병 (AD)^8,16. 따라서, 최근에는, 다른 바디 사이트에 세균성 조성물을 확인하기 위한 공구에 대한 관심이 증가하고 있다. 신뢰할 수 있는 방법은 처리량이 높고 사용하기 쉬운 방법, 고분해능으로 세균성 미생물을 분류하는 능력, 저비용 인 것과 같은 특성을 가져야 합니다.

배양 기반 의 미생물 학적 기술은 문화에서 성장하는 여러 장내 박테리아의 실패로 인해 복잡한 창자 미생물군유전체를 식별하고 특성화할 만큼 민감하지 않습니다. 시퀀싱 기반 기술, 특히 16S rRNA 기반 의 metagenomic 시퀀싱의 출현은 이러한 과제 중 일부를 극복하고 미생물군유전체 연구^17을변화시켰다. 고급 16S rRNA 기반 시퀀싱 기술은 인간의 건강에 있는 창자 미생물군유전체에 대한 중요한 역할을 확립하는 데 도움이 되었습니다. 인간 미생물군유전체 프로젝트, 국립 보건원 이니셔티브^18,메타히트 프로젝트(유럽 이니셔티브)^19는 모두 미생물군유전체 분석을 위한 기본 프레임워크를 수립하는 데 도움을 주었습니다. 이러한 이니셔티브는 인간의 건강과 질병에 있는 창자 microbiome의 역할을 결정하기 위하여 다중 연구 결과를 걷어차는 것을 도왔습니다.

많은 그룹이 염증성 질환 환자에서 장 이영양증을^{12,14,15,20,21,22로}나타났습니다. 멀티플렉스 및 저비용으로 인해 분류학적 프로파일링에 널리 사용되고 있음에도 불구하고 16S rRNA 기반 분류학적 프로파일링을 위한 균일한 프로토콜은 없습니다. 또 다른 제한은 작은 시퀀싱 읽기 (150 bp 또는 250 bp)로 인해 분류 학적 할당의 낮은 해상도와 낮은 품질의 역시퀀싱 읽기 (R2)로 인해 정방향 시퀀싱 읽기 (R1)의 사용입니다. 그러나 시퀀싱 기술의 발전은 페어링 된 끝 읽기 (예 : Illumina MiSeq 2x300bp)를 사용하여 더 이상 읽기를 순서를 정하는 기능과 같은 몇 가지 문제를 극복하는 데 도움이되었습니다.

현재의 시퀀싱 기술은 600bp의 양질의 읽기를 시퀀싱할 수 있어 R1및 R2 판독을 병합할 수 있습니다. 이러한 병합 된 더 이상 R1 및 R2 읽기는 특히 오픈 액세스 R 기반 분열 앰플리온 디노이징 알고리즘-2 (DADA2) 플랫폼과 함께, 더 나은 분류학적 할당을 할 수 있습니다. DADA2는 QIIME^23에서사용하는 97%의 유사성을 기반으로 운영 분류 장치(OTU) 할당 대신 앰플리톤 서열 변형(ASV) 기반 할당을 사용합니다. ASV 일치는 속과 종 수준에 할당에 이르게 1-2 뉴클레오티드 내에서 데이터베이스에서 정확한 서열 일치를 초래한다. 따라서, 더 길고, 좋은 품질의 페어링 엔드 읽기와 더 나은 분류학적 할당 도구(예: DADA2)의 조합은 미생물군유전체 연구를 변화시켰습니다.

여기에 제공된 16S rRNA의 V3-V4 영역의 2단계 증폭및 DADA2, Phyloseq 및 METAGENassist 파이프라인을 사용한 데이터 분석을 사용하여 세균 프로파일링을 수행하기 위한 단계별 가이드가 제공됩니다. 본 연구를 위해, 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 형질전환 마우스가 사용되고, 특정 HLA 클래스 II 알레르는 MS^20,24,25와같은 자가면역 질환에 대한 경향과 연결된다. 그러나, 창 자 microbiota의 구성을 조절에 HLA 클래스 II 유전자의 중요성은 알 수 없습니다. HLA 클래스 II 분자는 특정 박테리아를 선택하여 창자 미생물 커뮤니티에 영향을 미칠 것이라고 가설. 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 클래스 II 녹아웃 마우스(AE.KO) 또는 인간 HLA-DQ8 분자(HLA-DQ8)^24,25,26을 발현하는 마우스에서 HLA 클래스 II 분자의 중요성을 이해하기 위해 사용되었다. 창자 미생물 커뮤니티를 형성. R 기반 데이터 분석을 통해 완전하고 간소화된 워크플로우가 미생물군유전체 프로파일링 연구를 수행하는 데 관심이 있는 연구자를 위한 훌륭한 도구가 될 것으로 믿습니다.

내인성 뮤린 MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 및^AE-/-결여된 마우스의 생성. HLA-DQA1*0103, DQB1*0302 (HLA-DQ8) C57BL/6J 배경을 가진 형질전환 마우스는 앞서^26에기재되어 있다. 배설물 샘플은 남녀 모두의 마우스에서 수집됩니다 (8-12 나이의 주). 마우스는 이전에 NIH 및 기관 지침에 따라 아이오와 대학 동물 시설에서 사육 및 유지되었습니다. 층류 캐비닛 내부에 마우스의 이유비, 마우스의 다른 변종 사이 장갑의 변경 및 마우스의 적당한 유지와 같은 오염 통제 전략은 창자 microbiome의 프로파일링을 위한 중요한 단계입니다.

적절한 개인 보호 장비 (PPE)는 전체 절차 중에 적극 권장됩니다. DNA 절연, PCR1 및 PCR2 증폭 및 시퀀싱 단계를 수행할 때 적절한 음성 제어가 포함되어야 합니다. 멸균, DNase 프리, RNase 및 파이로겐이 없는 소모품을 사용하는 것이 좋습니다. 미생물군유전체 작업및 여과된 파이펫 팁을 위한 지정된 피펫터는 프로토콜 전반에 걸쳐 사용해야 합니다. Microbiota 분석은 7단계로 이루어져 있습니다: 1) 대변 샘플 수집 및 처리; 2) DNA의 추출; 3) 16S rRNA 유전자 증폭; 4) 인덱싱된 PCR을 이용한 DNA 라이브러리 구축; 5) 인덱싱된 PCR(라이브러리)의 정리 및 정량화; 6) 미세크 시퀀싱; 및 7) 데이터 처리 및 시퀀스 분석. 모든 프로토콜 단계의 회로도다이어는 그림 1에나와 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 배설물 샘플 수집 및 취급

1. 70% 에탄올로 디바이더 박스(재료 표, 보충 그림 1참조)를 살균합니다.
2. 샘플 ID 및 처리 그룹(해당하는 경우)과 함께 미세원심분리튜브(마우스당 1개)를 사전 라벨을 붙인다.
3. 생쥐를 멸균된 칸막이 상자에 놓고 최대 1시간 동안 정상적으로 배설할 수 있도록 하십시오.
4. 멸균 집게를 사용하여 미리 표지된 1.5mL 미세원심지 튜브에 배설물 펠릿을 모으고 튜브를 단단히 닫습니다. 각 마우스에서 수집 한 후 집게를 살균하십시오.
5. 배설물 펠릿을 함유한 미세원심분리튜브를 추가 처리될 때까지 -80°C 냉동고에 놓습니다.
   참고: 그들은 한 번에 여러 마우스 (최대 12)에서 배설물 샘플의 동시 수집을 허용하기 때문에 디바이더 상자는 유리하다.

2. DNA 추출

1. 냉동고에서 배설물 샘플(마우스 또는 인간)을 제거하고 실온(RT)에서 해동합니다.
   참고: 재고 샘플에서 200 mg 또는 필요한 양을 수집하는 데 필요한 경우 4 °C에서 밤새 인간 대변 샘플을 해동하는 것이 좋습니다.
2. 200 mg의 시작 물질을 사용하고 DNA를 50 μL의 최종 부피에 용출하십시오.
3. 배설물 샘플이 첨가되지 않았지만 모든 DNA 추출 단계를 통해 처리되는 DNA 격리 키트 블랭크를 포함합니다.
   참고: 특정 DNA 절연 키트(재료 표참조)는 인간및 마우스 대변에 존재하는 용해된 적혈구에서 바이오 고형물, 소화되지 않은 식물 재료 및 헴 화합물과 같은 억제 물질을 제거하는 특정 시약을 포함하고 있으므로 사용되었습니다. 샘플.
4. 비드 튜브를 균질화(재료 표참조)에 넣고 RT에서 45s및 4.5m/s의 속도로 샘플을 균질화합니다.
   참고: 모든 제조업체의 비드 박동 균질화제를 사용할 수 있습니다. 그러나 다른 공급 업체의 비드 박동 균질화 기를 사용하는 경우 방법, 특히 균질화의 속도와 기간을 표준화하는 것이 좋습니다.
5. 제조업체의 프로토콜(재료 표참조)에 따라 세균 DNA 격리 키트를 사용하여 개별 마우스 배설물 샘플에서 DNA를 사소한 수정으로 분리합니다. 형질계 또는 고감도 전기 영동 칩에 DNA의 1 μL을 적재하여 분리 된 DNA를 정량화합니다 (재료 표참조).
   참고: DNA의 예상 수율은 배설물 샘플의 200 mg으로 시작할 때 500-2,500 ng에서 배열할 수 있습니다.
6. 용출 버퍼를 사용하여 DNA 농도를 4-20 ng/μL로 조정합니다. PCR1이 같은 날에 수행되지 않는 경우 16S rRNA 유전자 증폭 (PCR1)으로 진행하기 전에 DNA (단계 2.5에서 수행된 것과 같이)를 정량화합니다.

3. 16S rRNA 유전자 증폭 (PCR1)

1. 25 μL 반응 량을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트에 16S rRNA 유전자 증폭(PCR1)을 설정합니다.
2. 멀티 채널 파이펫을 사용하여, dNTPs (재료표참조) 외에 버퍼를 포함한 2x 고충실성 폴리머라제 효소 믹스 12.5 μL을 추가하십시오: 최대 10.5 μL 총 부피에서 DNA 40 ng (PCR 등급물로 총 부피 조정): 1 μL (각) 1 μM 농도에서 역프라이머.
   참고: 프라이머의 시퀀스는 다음과 같습니다:
   앞으로 프라이머 = 5'-TCGTCGGCAGCCA 가트GTGTA가 가트GTGTA가 가TACGGGGCWGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGGGGTGGTA TAGAGACAATATAtAtAtAtCtTAtAtAtCtAtAtC C-3'-GTA PCR 플레이트에 2.3단계(키트 시약 제어)에서 키트 블랭크를 포함합니다.
3. PCR 플레이트 및 원심분리기를 탁상 판 원심분리기에서 1분 동안 20°C에서 1,000 x g에서 밀봉하고(재료 표참조) 프로그래밍된 열 사이클러에서 PCR을 수행합니다: 95°C 에서 3분; 25 사이클 1) 95 °C 에 대 한 30 s, 2) 55 °C 30 s에 대 한, 3) 72°C 에 대 한 30 s; 72 °C에서 5 분 동안 최종 확장; 4°C에서 유지합니다.
   참고: 이 16S rRNA 유전자 증폭 방법은 생물 표본의 다른 모형으로 작동해야 하더라도, 새로운 프로젝트를 시작할 때 증폭 주기의 수를 표준화하는 것이 좋습니다.
4. 고감도 전기 영동 칩에 DNA 1 μL을 적재하여 PCR1 제품의 크기를 확인합니다. 대안적으로, 1.5% 아가로즈 겔에 16S rRNA 증폭 생성물의 5 μL을 실행하여 PCR1 제품의 550 bp를 확인한다.
   참고: 16S rRNA 증폭 제품의 정리는 선택 사항이며 사용 중인 DNA 격리 키트/방법에 따라 다릅니다. 사내 DNA 분리 방법을 사용하는 경우, PCR1 제품은 제조업체의 프로토콜에 따라 미생물군유전체 DNA 정제 키트를 사용하여 세척할 수 있습니다(재료 표참조). 여기에서 사용되는 DNA 절연 키트는 초순수 DNA를 생성하며 PCR1 제품의 세척이 필요하지 않습니다.

4. 인덱싱 된 PCR (PCR2)를 사용하여 DNA 라이브러리 건설

1. 96개의 라이브러리에 대해 인덱스 1과 인덱스 2 바코드 프라이머를 특수 랙에 놓습니다(재료 표 참조).
   1. 열에 인덱스 1 프라이머를 정렬 1-12 및 인덱스 2 프라이머 행 A-H 특수 랙의.
   2. 다중 채널 파이펫을 사용하여 열 1-12에 인덱스 1의 2.5 μL을 추가하고 A-H 행에 인덱스 2 프라이머를 추가합니다. 인덱스 1 및 인덱스 2 채택자 프라이머에 새 캡(재료 표참조)을 놓고 -20°C 냉동고에 보관합니다.
2. 다중 채널 파이펫을 사용하여, dNTPs(재료표 참조)에더하여 완충액을 함유하는 2x 고충실도 폴리머라제 효소 믹스의 12.5 μL을 첨가한다; 5 μL의 PCR 등급 물 및 16S rRNA 증폭 제품의 2.5 μL.
   참고: Kiernan 등^27에설명된 대로 한 번의 실행으로 96개 이상의 라이브러리를 다중화하기 위해 각 샘플에 고유한 인덱스를 추가합니다. 본 프로토콜은 16S 메타지노믹스 시퀀싱 방법(예: Illumina)에서 제공된 제조업체의 지시에 따라 상용 키트(예: Nextera XT 인덱스 키트)의 어댑터를 사용합니다.
3. 인감 및 원심분리기 는 20 °C에서 1,000 x g에서 1 분 동안 1 분 동안 및 프로그래밍 된 열 사이클러에서 PCR을 수행합니다 : 3 분 동안 95 °C; 8 사이클 1) 95 °C 에 대 한 30 s, 2) 55 °C 30 s에 대 한, 3) 72°C 에 대 한 30 s; 최종 연장은 72°C에서 5분 동안.
4. 고감도 전기 영동 칩에 1 μL의 DNA를 적재하여 색인된 PCR 제품의 630기본 크기를 확인합니다. 또는, 제품의 크기와 강도를 확인하기 위해 1.5% 아가로즈 젤에 색인된 PCR 제품의 5 μL을 실행합니다.

5. 인덱싱 된 PCR (PCR2) 및 정량화의 정리

1. 풀 5 μL 의 PCR2 앰플리온은 검출 가능한 DNase, RNase, 인간 DNA 및 피로겐균박테리아가 없는 다중 채널 저장소 트레이에 각각의 멀티채널 파이펫을 사용하여 (재료 표참조).
2. 풀링된 제품을 멀티채널 저장소 트레이에서 미리 라벨이 부착된 1.5mL 미세원원지 튜브와 소용돌이로 옮겨 혼합합니다.
3. 표준 자기 비드 키트(재료 표 참조)를사용하여 PCR2 제품을 정화하십시오. 필요한 경우 추가 사용을 위해 PCR2의 나머지 20 μL을 동일한 플레이트에 -80°C로 밀봉하고 보관하십시오.
4. PCR 등급의 물 1mL에 100% 에탄올 4mL를 추가하여 신선한 80% 에탄올을 준비합니다.
5. 자기 비드를 RT와 소용돌이에 30초 동안 평형화하여 구슬을 고르게 분산시킴.
6. 풀링된 PCR2 앰플리온 샘플을 간단히 소용돌이하고 스핀다운합니다.
7. 80 μL의 자기 비드를 풀링된 PCR 제품 80μL의 사전 라벨이 부착된 멸균 된 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 넣고 소용돌이를 돌리고 잠시 회전하여 자기 비드를 고르게 다시 돌릴 수 있습니다.
8. 15 분 동안 튜브를 방해하지 않고 RT에서 내용물인을 배양하십시오.
9. DNA와 자기 구슬이 있는 튜브를 자기 스탠드에 놓고(재료 표 참조)5분 동안 놓습니다.
10. 조심스럽게 제거하고 상류물의 150 μL을 폐기.
11. 구슬을 방해하지 않고 갓 준비한 80 % 에탄올 200 μL을 추가하고 30 s를 위해 배양하십시오.
12. 조심스럽게 제거하고 모든 상급을 폐기하십시오.
13. 5.11-5.12단계를 반복합니다. P10 파이펫으로 남은 체적을 제거합니다. 인덱스 PCR 튜브가 마그네틱 스탠드에 남아 있는 채로 구슬을 15분 동안 공기 건조시도록 합니다.
14. 마그네틱 스탠드에서 제거합니다. 33 μL의 용출 버퍼를 추가합니다(DNA 키트의 용출 완충제는 허용됩니다). 소용돌이가 잘 되고, 빠른 스핀을 수행하여 측면에 남은 액체를 제거한다. 2 분 동안 배양하고 5 분 동안 자기 스탠드에 놓습니다.
15. 상급 (깨끗한 PCR 제품)의 30 μL을 미리 표지 된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮니다.
16. 시퀀싱 중에 요구되는 바와 같이, 플루오라이미터 또는 고감도 전기 영동 칩에 정제된 풀의 1 μL을 적재하여 정제된 풀을 정량화한다. 아래에 자세히 설명된 대로 MiSeq를 수행합니다.

6. 미세크 시퀀싱

1. Metagenomics 워크플로우 및 MiSeq 계측기에서 다중화에 대한 샘플 별 바코드 정보가 포함된 샘플 시트를만듭니다(재료 표 참조). 이 샘플 시트를 소프트웨어(예: Illumina 실험 관리자)에 업로드합니다.
2. 풀린 라이브러리를 5.15 단계에서 4 nM으로 희석합니다.
3. 1.5 mL 의 미세 원심 분리튜브에서 갓 제조된 0.2 M NaOH의 5 μL과 4 nM 라이브러리 풀의 5 μL을 결합하여 디네이징풀라이브러리. 소용돌이는 짧게 혼합, 원심 분리기 및 주변 RT에서 5 분 동안 배양.
4. 990 μL의 얼음-차가운 혼성화 버퍼(HB 버퍼)를 추가하고 파이펫을 부드럽게 섞어 보냅니다. 이렇게 하면 20pM 라이브러리가 생성됩니다.
5. 10 nM 제어 라이브러리의 2 μL을 EBT 버퍼 3 μL(10 mM Tris-HCl, pH = 8.5, 0.1% 트웬 20)과 결합하여 4 nM 제어 라이브러리를 생성합니다. 갓 준비한 0.2 N NaOH와 소용돌이를 5 μL을 넣고 잠시 섞습니다. RT에서 5 분 동안 배양하십시오.
6. 990 μL 얼음-차가운 혼성화 버퍼(HB 버퍼)를 추가하고 파이펫을 부드럽게 섞어 보냅니다. 이렇게 하면 20개의 pM 컨트롤 라이브러리가 생성됩니다.
   참고: 변성된 20pM 제어 라이브러리는 -20°C에서 최대 4주 동안 저장할 수 있습니다. 4주 후 클러스터 수는 감소하는 경향이 있습니다.
   1. 20 pM 라이브러리의 210 μL과 20 pM 제어 라이브러리의 40 μL(최종 농도 = ~18%)을 결합하고 HB 버퍼의 350 μL을 추가합니다. 라이브러리를 최종 농도 7pM로 로드합니다.
      참고: 입력 세부 정보는 실행 성능에 따라 조정되어야 합니다.
7. 96°C에서 2분 동안 샘플을 배양합니다. 5 분 동안 얼음에 넣어. MiSeq 카트리지의 적절한 우물에 최종 수영장의 600 μL을로드합니다.
   참고: 위의 섹션 6은 게놈 /DNA 핵심 시설에서 수행 할 수 있습니다.

7. 데이터 처리 및 시퀀스 분석

1. DADA2 데이터 처리 및 분석을 위해 R 소프트웨어(버전 3.5)를 사용합니다. 단계 7.1-7.4의 경우,에서 발견 된 이전에 개발 된 DADA2 온라인 자습서에 설명 된 대로 오픈 액세스 소프트웨어를 사용 하십시오.https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html>.
   참고: 쉽게 사용할 수 있는 R 스크립트가 보충 파일 2로첨부되었으며 사용자는 시퀀싱 파일의 이름과 소스를 변경해야 합니다(예: SAMPLENAME_R1_001.fastq 및 SAMPLENAME_R2_001.fastq).
2. plotQualityProfile 명령을 사용하여 순방향 및 역읽기의 품질 프로파일을 시각화합니다.
3. 품질 플롯을 기반으로 앞으로 및 역방향 읽기에서 뉴클레오티드를 트리밍합니다. 이러한 매개 변수는 DADA2의 truncLen 매개 변수에 의해 지정됩니다.
   참고: 여기서 280은 앞으로 읽기가 삭제되는 길이 임계값으로 사용되고 260은 역읽기가 삭제되는 길이 임계값으로 사용됩니다.
4. 온라인 자습서에 설명 된 대로 DADA2 파이프라인에 의해 fastq 파일로 원시 16S 데이터를 처리 (에서 찾을 수 있습니다 )R1 및 R2 읽기 및 양식 앰플리온 시퀀스 변형 (ASV)를 입력 하는 데 사용 됩니다. 실바 참조 데이터베이스²³.
   참고: DADA2 파이프라인에서 생성된 샘플 앰플리온 시퀀스 변형 테이블이 보충 파일 3으로포함됩니다. 이러한 데이터베이스 중 하나를 사용하여 세균 분류의 차이가 발견되지 않았으며 Greengene 또는 Silva 참조 데이터베이스를 사용할 수 있습니다.
5. 각 샘플에 대한 메타데이터(예: 유전자형, 성별, 치료 등)가 포함된 사용자 정의 매핑 파일을 생성합니다. 샘플 메타데이터 파일이 보충 파일 4로포함되었습니다.
6. 알파 다이버시티(섀넌 인덱스) 및 베타 다이버시티를 계산하여 온라인 튜토리얼에서 설명한 대로 Phyloseq^28을 사용하여 희귀 한 OTU 카운트를 기반으로 한 주요 좌표 분석 (PCA)을 사용하여 http://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html>에서 찾을 수 있습니다.
7. 메타게엔시스트^29에서다음 분석을 수행합니다.
   참고: 속 수준에서 Wilcoxon 순위 합계 테스트를 사용하여 차등 풍부도 분석을 수행합니다. 공개적으로 이용 가능한 웹 기반 분석 파이프라인인 METAGENassist^29를사용하여 히트 맵과 차별화된 풍부한 택시가 강조 표시됩니다.
   1. 분류학적 풍부도 표(CSV 형식)를 업로드하고 열에서 샘플을 선택합니다.
   2. 매핑 파일(CSV 형식)을 업로드하고 행에서 샘플을 선택합니다.
   3. 옵션을 선택하여 50% 00을 초과한 변수를 제거하고 할당되지 않은 읽기와 매핑되지 않은 읽기를 제외합니다.
   4. 합계로 행을 정규화하고 정규화 열을 기록하는 옵션을 선택합니다.
   5. 왼쪽 열에서 동일한 열을 클릭하여 화산, PCA 또는 PLSDA 플롯을 만들고 샘플 이름 제거를 클릭하여 그래프를 만듭니다.
   6. t-검정(2단인 경우) 또는 ANOVA(2군 이상인 경우)를 수행하여 그룹간에 다른 특징(박테리아)을 시각화한다. 선택한 피처를 클릭하여 그룹 간에 다른 특정 박테리아를 시각화합니다.
   7. 덴드로그램 또는 히트 맵을 클릭하여 각 플롯을 작성합니다. 그룹별 샘플 시각화 또는 t-test/ANOVA 기반 상위 25개 기능과 같은 추가 분석을 수행할 수 있습니다.
   8. RandomForest를 클릭하여 분류에 사용할 수 있는 기능을 표시하는 그래프를 만듭니다. 상단의 분산 탭을 클릭하여 그룹 간에 서로 다른 상위 피처에 대한 그래프를 만듭니다. 기능 세부 정보를 클릭하여 그룹마다 다른 박테리아 목록을 확인하고 각 박테리아를 클릭하여 동일한 그래픽 요약을 만듭니다.
   9. 위에 있는 이상값 탭을 클릭하여 이상값인 샘플을 시각화합니다.
   10. 마지막으로 다운로드를 클릭하고 1) 수행된 모든 분석이 포함된 zip 파일 또는 2) 다운로드할 원하는 기능을 선택합니다. 이 파일은 고유한 이름으로 저장되어야 하며 사용하기 전에 압축을 풀어야 합니다.

참고: 미생물군유전체 분석 중에 수행된 상세한 통계 적 테스트는 첸 외 및 Hugerth 외^14,30의작품을 참조하십시오.

결과

MHC 클래스 II 분자(인간HLA)는 적응형 면역 반응의 중심적인 플레이어이며 MS^24,25,26에대한 경향과의 강한 연관성을 나타내고, HLA 클래스 II 분자가 있다고 가설하였다. 장 내 미생물 구성에 영향을 미칠 것 이다. 따라서, MHC 클래스 II 유전자(AE.KO) 또는 발현하는 인간 HLA-DQ8 유전자(HLA-DQ8)가 결여된 마우스는 장내 미생물 군을 형성?...

토론

기재된 프로토콜은 많은 수의 생물표본으로부터 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱을 사용하여 미생물군유전체 프로파일링을 수행하기 쉬운 단계로 간단합니다. 차세대 염기서열 분석은 특히 인간 및 전임상 질환 모델^31,32에서미생물 생태학 연구를 변화시켰다. 이 기술의 주요 장점은 높은 처리량 수준과 저렴한 비용^32에서주어진 생물 표본에?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Natural Microcentriguge Tube	USA, Scientific	1615-5500	Fecal collection
3M hand applicator squeegee PA1-G	3M, MN, US	7100038651	Squeeger for proper sealing of PCR Plate
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter, IN, USA	A63880	PCR Purification, NGS Clean-up, PCR clean-up
Agilent DNA 1000 REAGENT	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA quantification and quality control
Bioanalyzer DNA 1000 chip	Agilent Technologies, CA, USA	5067-1504	DNA quantification and quality control
Index Adopter Replacement Caps	Illumina, Inc., CA, USA	15026762	New cap for Index 1 and 2 adopter primer
DNeasy PowerLyzer PowerSoil Kit	MoBio now part of QIAGEN, Valencia, CA, USA	12855-100	DNA isolation
KAPA HiFi HotStart ReadyMiX (2x)	Kapa Biosystem, MA, USA	KK2602	PCR ready mix for Amplicon PCR1 and Indexed PCR2
Lewis Divider Boxes	Lewis Bins, WI, US	ND03080	Fecal collection
Magnetic stand	New England BioLabs, MA, USA	S1509S	For PCR clean-up
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA	4346906	PCR Plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, CA, USA	4311971	PCR Plate Sealer
Microfuge 20 Centrifuge	Beckman Coulter, IN, USA	B30154	Centrifuge used for DNA isolation
MiSeq Reagent Kit (600 cycles)v.3	Illumina, Inc., CA, USA	MS-102-3003	For MiSeq Sequencing
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina, Inc., CA, USA	FC-131-1001	16S rRNA DNA Library Preparation
Reagent Reservoirs Multichannel Trays	ASI, FL,USA	RS71-1	For Pooling of PCR2 Product
Plate Cetrifuge	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	75004393	For PCR reagent mixing and removing air bubble from Plate
PhiX Control	Illumina, Inc., CA, USA	FC-110-3001	For MiSeq Sequencing control
Microbiome DNA Purification Kit	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	A29789	For purification of PCR1 product
PowerLyzer 24 Homogenizer	Omni International, GA, USA	19-001	Bead beater for DNA Isolation
Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) assay kit	Thermo Fisher Scientific, CA, USA	Q32854	DNA quantification
TruSeq Index Plate Fixture	Illumina, Inc., CA, USA	FC-130-1005	For Arranging of the index primers
Vertical Dividers (large)	Lewis Bins, WI, US	DV-2280	Fecal collection
Vertical Dividers (small)	Lewis Bins, WI, US	DV-1780	Fecal collection