JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חשפנו מערכת מיקרופיזיולוגית (MPS) עם אורגנואידים במעי וכבד פרצטמול (APAP). מאמר זה מתאר את השיטות לייצור אורגנואידים והערכות רכוש פרמקוקינטי וטוקסיקולוגי APAP ב MPS. הוא גם מתאר את ניתוחי פונקציונליות הרקמה הדרושים כדי לאמת את התוצאות.

Abstract

מערכות מיקרופיזיולוגיות שהוצגו לאחרונה (MPS) טיפוח אורגנואידים אנושיים צפויים לבצע טוב יותר מאשר בעלי חיים בשלב בדיקות פרה-לקלינליות של תהליך פיתוח תרופות כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. במחקר זה, מחסום המעי האנושי (חיקוי על ידי תרבות שיתופית של תאי Caco-2 ו HT-29) ואת המקבילה בכבד (חיקוי על ידי spheroids עשוי תאי HepaRG מובחן ו תאי סטלה כבד אנושיים) שולבו בשבב שני איברים (2-OC) מכשיר מיקרו-נוזלים כדי להעריך כמה פרצטמול (APAP) פרמקוקינטיקה (PK) ומאפיינים טוקסיקולוגיים. MPS היו שלוש הרכבות: המעי רק 2-OC, כבד רק 2-OC, ו מעיים / כבד 2-OC עם אותה מדיה תפרוק שני אורגנואידים. להערכות PK, אנחנו מינון APAP בתקשורת בנקודות זמן מוגדרות מראש לאחר ניהולו או מעל מחסום המעיים (לחקות את המסלול אוראלי) או במדיה (לחקות את המסלול תוך וריד), ב 12 μM ו 2 μM בהתאמה. דגימות המדיה נותחו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה הפוכה (HPLC). אורגנואידים נותחו לביטוי גנים, לערכי TEER, לביטוי ולפעילות של חלבונים, ולאחר מכן נאספו, תוקנו ונשלחו לערכה של הערכות מורפולוגיות. טכניקת MTT ביצעה היטב בהערכת הכדאיות אורגנואיד, אבל ניתוחי תוכן גבוה (HCA) הצליחו לזהות אירועים רעילים מוקדמים מאוד בתגובה לטיפול APAP. אימתנו כי זרימת המדיה אינה משפיעה באופן משמעותי על ספיגת APAP ואילו זה משפר באופן משמעותי את הפונקציונליות המקבילה לכבד. ספיגת המעיים האנושית APAP וחילוף החומרים של hepatic יכול להיות חיקוי MPS. הקשר בין נתוני MPS ומידול silico יש פוטנציאל גדול כדי לשפר את יכולת החיזוי של שיטות מבחנה ולספק דיוק טוב יותר מאשר מודלים של בעלי חיים במחקרים פרמקוקינטיים וטוקסיקולוגיים.

Introduction

בשל הבדלים גנומיים ופרוטונומיים, למודלים של בעלי חיים יש ערך חזוי מוגבל למספר תוצאות אנושיות. יתר על כן, הם גוזלים זמן, יקרים ומנוייםמבחינה אתית 1. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית שמטרתה לשפר את העוצמה החזויה ולהפחית את העלויות והזמן שהושקעו בבדיקות פרה-קליניות. הם מכשירים מיקרו-נוזלים המטפחים אורגנואידים (יחידות פונקציונליות של פנטומימטיקה מלאכותית של איברים) תחת זרימת מדיה המקדמת תקשורת אורגנואיד-אורגנואיד. אורגנואידים עשויים תאים אנושיים להגדיל את הרלוונטיותתרגום 2,3,4. MPS צפוי לבצע טוב יותר מאשר ניסויים בבעלי חיים כי הם אנושיים גנטית ולסיכום יחסי הגומלין בין רקמות. כאשר פונקציונלי באופן מלא, MPS יספק תוצאות משמעותיות יותר, במהירות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר וסיכונים4. קבוצות רבות מפתחות MPS למספר מטרות, במיוחד מודלים מחלה כדי בדיקות היעילות של התרופה.

רמת החשיפה היא אחד הפרמטרים הקריטיים ביותר להערכת יעילות התרופהורעילות 5, 6,7,8,9,10,11,12. MPS מאפשר שילוב אורגנואידים המחקם חשיפה מערכתית וצפוי לבצע טוב יותר מאשר תרבות הרקמה האנושית הדו-מיומסורתית. טכנולוגיה זו יכולה לשפר באופן משמעותי את החיזוי של ספיגת מעיים מורכבת וחילוף חומרים בכבד4.

MPS שילוב מודל המקבילה האנושית של המעי והכבד היא נקודת התחלה טובה, בהתחשב בתפקיד המרכזי של שני איברים אלה זמינות ביולוגית סמיםוחשיפה מערכתית 13,14,15. APAP היא תרופה אטרקטיבית לחקר MPS ללא שווה ערך לכליות כי חילוף החומרים שלה נעשה בעיקר עלידי הכבד 16,17.

2-OC הוא מכשיר מיקרו-נוזל דו-קאמרי המתאים לתרבות של שתי רקמות/אורגנואידים מקבילים אנושיים שונים המחוברים על ידימיקרו-צינורות 16. על מנת לחקות בינה אנושית אוראלית / תוך ורדי ניהול של תרופה ולהעריך את ההשפעות של שיחה צולבת בין המעי וכבד שווה ערך על פרמקוקינטיקה APAP, מלבד פונקציונליות organoids וכדאיות, שלושה הרכבות MPS שונות בוצעו: (1) "מעיים 2-OC MPS" מורכב שווה ערך מעיים המבוסס על הוספת תרבות המכילה Caco-2 + HT-29 תאים coculture, משולב בהתקן 2-OC; (2) "כבד 2-OC MPS" המורכב מספרואידים כבד עשוי HepaRG + HHSteC (תאי סטלה הכבד האנושי) משולב בהתקן 2-OC; ו(3) "מעיים / כבד 2-OC MPS" מורכב המקבילה המעי בתא התקן אחד תקשורת עם המקבילה הכבד בשנייה על ידי זרימת התקשורת דרך ערוצים microfluidic.

כל ההתמרמרות בוצעו בתנאים סטטיים (ללא זרימה) ודינמיים (עם זרימה) בשל ההשפעה של הגירויים המכניים (דחיסה, מתיחה וגייה) על הכדאיותוהפונקציונליות של התא 18,19,20. המאמר הנוכחי מתאר את הפרוטוקול עבור הדמיית ניהול אוראלי /תוך ורדי APAP ואת הספיגה / חילוף החומרים בהתאמה וניתוחים טוקסיקולוגיים ב 2-OC MPS המכילים מודלים מקבילים המעי האנושי והכבד.

Protocol

1. ייצור רקמות שוות ערך לטיפוח ב 2-OC

  1. ייצור שווה ערך למחסום מעיים קטן
    1. לשמור על תאי Caco-2 ו- HT-29 באמצעות המדיום המקביל למעי: DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין וסטרפטומיצין, ו 1% חומצות אמינו לא חיוניות, אשר נקרא "DMEM S" בכתב יד זה.
    2. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם DPBS 1x ולהוסיף 8 מ"ל של 0.25% Trypsin / EDTA כדי לנתק Caco-2 תאים גדל במבחנות תרבות התא (175 ס"מ2). דגירה במשך 5 דקות ב 37 ° C ולעצור את התגובה על ידי הוספת לפחות את הנפח הכפול של מעכב שלושה. בצע את אותו הליך עבור תאי HT-29, התאמת אמצעי האחסון של היריגנט מאז כמות קטנה יותר של תאים אלה נדרשת והם נשמרים במבחנות קטנות יותר (75ס"מ 2).
    3. צנטריפוגה ב 250 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant משני הצינורות, ולענג מחדש את כדורי התא ב 10 מ"ל של DMEM S. לספור תאים, להבטיח כדאיות תא גבוה יותר מ 80%. באופן מבחינה אפטית לשלב את תרבית התא מוסיף בצלחת 24-באר מלא בעבר עם 400 μL של DMEM S לכל באר בצד basolateral (אשר מייצג את מחזור הדם האנושי).
    4. שיתוף לטפח תאים Caco-2 ו HT-29 ביחס של 9:121. השתמש 2.25 x 105 Caco-2 ו 2.5 x 104 HT-29 תאים לכל מקבילה במעי בנפח סופי של 200 μL של DMEM S. להתאים מספרי תאים ונפח בהתאם למספר הרצוי של אורגנואידים. מערבבים היטב.
    5. פיפטה 200 μL של תמיסת תא לתוך הצד apical של כל תוסף (המייצג את הצד האנושי לומן מעיים), זריעת 250,000 תאים לכל הוספה. לטפח את התאים במוסיף במשך שלושה שבועות22. לשנות את המדיום לפחות שלוש פעמים בשבוע, שואפים אותו משני הצדדים apical ו basolateral עם פיפטה פסטר סטרילי, דואג לא לפגוע במחסום התא שלם.
      הערה: המשך עם השאיפה בצד האפאלי, כדי לא לגעת במחסום התא (שאף על-ידי תמיכה בפיפטה פסטר על שפת הפלסטיק של תא הכנס).
    6. בדוק את היווצרות חד שכבתית הדוקה על ידי מדידת TEER (התנגדות חשמלית transepithelial) כל שלושה ימים באמצעות מד מתח23, על פי הוראות היצרן.
      1. בצע ריק, מדידת ההתנגדות על פני תרבות תא להוסיף ללא תאים, אבל עם אותו תא בינוני באותו לוח תא.
      2. לחשב את עמידות הרקמות על ידי חיסור ההתנגדות הריקה מן ההתנגדות שווה רקמות, ולהכפיל על ידי שטח הפנים יעיל של קרום המסנן (0.6ס"מ 2). עמידות טובה במחסום המעיים היא בטווח של 150 עד 400 מטרים Ω∙"מ2.
        הערה: לאחר 21 ימים יש להבדיל את התאים באופן מלא ואת מחסום המעיים נוצר, כך המקבילות המעי מוכנים להיות משולבים MPS.
  2. ייצור שווה ערך לכבד
    1. לשמור על תאי HepaRG באמצעות המדיום המקביל לכבד, שהוא E בינוני של ויליאם בתוספת עם 10% סרום פר עוברי, 2 mM L-גלוטמין, 100 יחידות / mL פניצילין, 100 μg / מ"ל סטרפטומיצין, 5 μg / מ"ל אינסולין אנושי ו 5 x 10-5 M הידרוקורטיזון, והוא נקרא "וויליאמס E S" בכתב יד זה. לחדש את מדיה HepaRG כל 2-3 ימים ולשמור על תרבות התא במשך שבועיים כדי ליזום את ההבידול hepatocytes ו cholangiocytes.
    2. לאחר השבועיים הראשונים, להוסיף 2% DMSO למדיום של HepaRG לשבועיים נוספים כדי להשלים את בידול התא24,25. לגדול HHSTeC במדיה תא Stellate (SteC CM), באמצעות מבחנות תרבות תא מצופה פולי-L-לינזין, שינוי מדיה כל יומיים או שלושה.
    3. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם DPBS 1x ולהוסיף 8 מ"ל של 0.05% Trypsin/EDTA, כדי לנתק תאי HepaRG גדל במבחנות תרבות התא (175 ס"מ2). דגירה במשך 5 עד 10 דקות ב 37 ° C ולעצור את התגובה על ידי הוספת לפחות כפול נפח של מעכב שלושה. בצע את אותו הדבר עבור HHSTeC, התאמת נפח היריגנט מאז כמות קטנה יותר של תאים אלה נדרשים והם יכולים להישמר במבחנות קטנות יותר (75ס"מ 2).
    4. צנטריפוגה הן ב 250 x g עבור 5 דקות, להסיר את supernatant ולתחות מחדש את כדורי התא במדיום וויליאמס E S. לספור תאים, להבטיח את הכדאיות של התא גבוה יותר מ- 80%.
    5. צור את כדורי הכבד המשלבים תאי HepaRG ו- HHSTeC ביחס של 24:1, בהתאמה, ב וויליאמס E S בינוני16. הוסף 4.8 x10 4 HepaRG מובדיל ו 0.2 x10 4 HHSTeC כדי לחבר כל ספרואיד כבד של 50,000 תאים, בנפח של 80 μL. להתאים מספרי תאים ונפח בהתאם למספר הרצוי של spheroids. מערבבים היטב.
    6. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לחלק 80 μL של מאגר התא המשולב בכל באר של 384 מיקרו-לוחיות דם spheroid, אשר יש גיאומטריה עגולה היטב התחתון.
      הערה: לאחר ארבעה ימים, spheroids של כ 300 μm נוצרים.
    7. באמצעות טיפים רחבים, להעביר את כדורי הכבד לחיבור אולטרה נמוך 6 צלחות גם, המאפשר את הספירה הנדרשת "אחד אחרי השני".

2. שילוב של מעי וכבד שווה ערך ב MPS 2-OC

  1. מכלול 2-OC MPS מעיים לקליטת
    1. פיפט 500 μL של DMEM S לתוך התא הגדול יותר של 2-OC ו 300 μL בקטן יותר. לשאוף את התקשורת basolateral ו apical של כל מחסום מעיים שווה ערך ב 24 צלחות באר. באמצעות מגרסה סטרילית, לשלב הוספה אחת לכל מעגל 2-OC, במיוחד לתוך התא הגדול יותר. למרוח 200 μL של מדיום המעי בצד apical.
      הערה: הימנע היווצרות בועות בעת שילוב organoids לתוך MPS.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
  2. כבד 2-OC MPS הרכבה עבור חילוף חומרים
    1. פיפטה 650 μL של וויליאמס E S לתוך התא הגדול ו 350 μL לתוך התא הקטן יותר, אשר יקבל את spheroids. ב-6 לוחות הבאר עם ההחזקה הנמוכה במיוחד, ספרו את הספרואידים בעזרת טיפים רחבים. כל כבד שווה ערך מורכב מעשרים כדוריות26. שלב עשרים שווה ערך לכבד לכל מעגל, באמצעות טיפים רחבים, המאפשרים העברת אורגנואידים בלבד, לתא הקטן יותר של 2-OC.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
  3. מכלול מעי/כבד 2-OC MPS לספיגה וחילוף חומרים
    1. שלב את שני המדיה (המעי והכבד) בפרופורציה 1:4, מה שאומר 200 μL של DMEM S בצד apical מעיים ו 800 μL של וויליאמס E S בצד basolateral. שלב את המקבילות של המעי והכבד, בו זמנית, ב-2-OC.
    2. חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה, שחייבת להיות מחוברת לאספקת אוויר בלחץ. הגדר את הפרמטרים: לחץ של, כ±300 פס ותדירות שאיבה של 0.3 הרץ. התחל את הזרימה 24 שעות לפני ניהול חומר הבדיקה. למחרת, לבצע את הטיפול APAP.
      הערה: עבור כל הניסויים, בצע כל נקודת זמן בשלושה רישיות, כלומר שלושה מעגלים נפרדים של 2-OC (כלומר, 1 ו-1/2 התקני 2-OC). הנפח הכולל של כל מעגלי 2-OC הוא 1 מ"ל.

3. הכנת פרצטמול (APAP)

  1. הכן את פתרון המניות APAP, המסת APAP באתנול מוחלט. ביום הניסוי, לדלל APAP במדיום בהתאמה (פתרון APAP), לריכוז של 12 μM עבור "ניהול אוראלי" ו 2 μM עבור "ניהול תוך ורדי".
  2. ודא כי הריכוז הסופי של אתנול בפיקוח על הרכב ופתרון טיפול הוא 0.5% עבור שני הממשלים. עבור השליטה החיובית (100 mM APAP), ריכוז האתנול הוא 2%.

4. בדיקת ניהול חומרים ותו לא

  1. APAP "אוראלי" ניהול ומדיה דגימה
    1. לשאוף את התקשורת basolateral ו apical של כל מחסום מעיים שווה ערך 2-OC. פיפטה 500 μL של אמצעי התרבות המתאימה לתוך התא הגדול בצד basolateral אורגנואיד ו 300 μL לתוך התא הקטן.
    2. בדוק בועות ולהמשיך עם מחסום המעיים שווה טיפול שווה ערך עם חומר הבדיקה בצד apical, לחקות ניהול אוראלי. לחקות APAP "אוראלי" ממשל על ידי הוספת 200 μL של פתרון APAP 12 μM בצד apical של תוספות תרבות המעיים, אשר מייצג את המעי "צד לומן"(איור 1B). חבר את ה-MPS ליחידת הבקרה.
    3. אסוף את הנפח הכולל מצדדים apical ומהצדדים basolateral בנקודות הזמן הבאות: 0 שעות, 5 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 1 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות15,27. בצע את כל הניסויים בשלושה ניסויים, בתנאים סטטיים ודינמיים, ולאסוף כל מדגם, של כל שלושה, במיקרו-tube נפרד. נתח את הדגימות באמצעות HPLC/UV.
      הערה: דוגמאות אפיות ובסולטרליות נפרדות.
  2. APAP "תוך ורדי" ניהול ומדיה דגימה
    1. לחקות את המסלול "תוך ורדי" על ידי מתן 2 μM APAP פתרון ישירות לתוך תא הכבד. שאף את כל התוכן הבינוני 2-OC. פיפטה 650 μL של וויליאמס E S המכיל את חומר הבדיקה לתוך התא הגדול ו 350 μL של אותה מדיה לתוך התא הקטן המכיל את 20 spheroids. אסוף את כל אמצעי האחסון בנקודות הזמן הבאות: 0 שעות, 30 דקות, שעה אחת, 2 שעות, 3 שעות, 6 שעות, 12 שעות ו- 24 שעות27,28.
    2. בצע את כל הניסויים בטריפוליאט, בתנאים סטטיים ודינמיים. לאסוף כל דגימה, של כל שלושה שלושה, במיקרו-tube נפרד. נתח את הדגימות באמצעות HPLC/UV.

5. מכשור ותנאים כרומטוגרפיים

  1. ניתוח HPLC
    1. הגדר את כל הפרמטרים הרלוונטיים לניתוח HPLC בהתאם לטבלה 1.
    2. לסנן את שלב הנייד דרך מסנן קרום 0.45 μm תחת ואקום. לסנן את הדגימות דרך מסנן מזרק PVDF גודל נקבוביות 0.22 μm (קוטר 13 מ"מ) ולאחסן אותם במבערית. התחל את המדידה.
  2. פתרונות מלאי, תקני כיול ודוגמאות בקרת איכות (QC)
    1. הכן 10 mM של פתרונות מלאי APAP במאגר אמוניום אצטט (100 mM, pH 6.8) ודילול נוסף עם DMEM S ו וויליאמס E S תא תרבות מדיה מדולל עם מאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v) כדי להשיג את פתרונות העבודה החל 0.25 כדי 100.00 μM.
    2. כלול קבוצה של דגימות כיול בשלושה רישיות, כמו גם דגימות בקרת איכות בארבע רמות בשלושה. הכן סטנדרטים אלה על-ידי דילול סדרתי.
    3. צור עקומות כיול של אזורי שיא APAP לעומת ריכוזים סטנדרטיים נומינליים APAP. קבע את הרגרסיה ליניארית המתאימה לכל עקומת כיול. העריך את טוב-ההתאים של מודלים שונים של כיול על-ידי בדיקה חזותית, מקדם מתאם, דיוק פנים-ו-הפעלה וערכי דיוק.
    4. להזריק דגימות ריקות של DMEM S ו וויליאמס E S מדיה מדוללת במאגר אמוניום אצטט (1:1, v /v) בsstuplicate. הכן triplicates של דגימות בקרת איכות במדיה DMEM S ו- Williams E S מדולל עם מאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v) עבור ריכוזי APAP של 0.50 (LOQ), 4.50, 45.00 ו- 90.00 μM.
    5. ודא שדגימות בקרת האיכות מוכנות מפתרון מניות חדש, שונה מזה המשמש ליצירת עקומה סטנדרטית. השתמש בדגימות בקרת איכות כדי לחקור וריאציות פנים-והפעלה בין-הפעל.
  3. הליכי אימות
    1. בצע את אימות השיטה הביואנליטית לאחר ההליכים שדווחוקודם לכן 29,30. לבצע את הריצות הכרומטוגרפיות בחמש או שש הזדמנויות שונות, בהתחשב וויליאמס E S ו DMEM S תא תרבות מדיה, בהתאמה.
    2. ודא כי נקודות כיול החל 0.25 כדי 100.00 μM של APAP, ב DMEM S או וויליאמס E S תא תרבות מדיה מדוללת במאגר אמוניום אצטט (1:1, v/v), התוויה בהתבסס על אזורי השיא של APAP (ציר y) נגד ריכוזים נומינליים בהתאמה (ציר x). השווה את המדרונות של עקומות כיול סטנדרטיות אלה עם מדרונות של עקומת כיול שהוכנו במאגר אמוניום אצטט. ודא שלכל עקומות הכיול יש ערך מתאם של 0.998 לפחות.
    3. קבע את הדיוק והדיוק (פנים והפעלה בין-הפעלה) עבור האנליטיט במטריצה הפונדקאית באמצעות שכפולים בארבע רמות שונות LLOQ, בקרת Low, Middle ו- high-quality בחמישה או שישה ימים שונים. בצע מדידות דיוק ודיוק פנים-ריצה באותו יום במדיה של תרבות התאים DMEM S או Williams E S המדוללת במאגר אצטט אמוניום (1:1, v/v) המכיל 0.50, 4.50, 45.00 ו- 90.00 μM APAP ריכוזים (n = 3).
    4. הערך כל קבוצה של דגימות בקרת איכות המכילות את ריכוזי APAP מתקיות כיול שהושגו לאחרונה. בדוק את הבחירה של האסות על ידי מידת ההפרדה של המתחם של עניין ופסגות כרומטוגרפיות אחרות אפשריות הנגרמות על ידי רכיבים מפריעים.
  4. גבול תחתון של כימות (LLOQ) ומגבלת זיהוי (LOD)
    1. קבע את הגבול התחתון של כימות (LLOQ) בהתבסס על סטיית התקן של התגובה ועל גישת המדרון. חשב באמצעות הנוסחה 10α /S, כאשר α היא סטיית התקן של y-intercept ו- S הוא השיפוע של קו ישר שהושג על-ידי התוויית עקומות כיול29,30. הערכת מגבלת הזיהוי (LOD) תוך התחשבות פי 3.3 סטיית התקן של הריק, המחולקת לפי המדרון שלעקומת הכיול 29,30.

6. רקמה שווה ערך לכדאיות/פונקציונליות

  1. MTT (1000
    1. לבצע תסריט MTT כדי להעריך את הכדאיות אורגנואיד בכל נקודות הזמן של תסכולת MPS. כשליטה שלילית, השתמש במדיה סלולרית בתוספת רכב. כשליטה חיובית, לטפל באורבנואידים עם APAP 100 mM ו 1% NaOH מדולל במדיום התא.
    2. להעביר את 20 spheroids של כל שכפול עבור בארות בודדות בצלחת 96 באר, ואת תרבות התא מוסיף, המכיל את המקבילות מעיים, כדי 24 לוחות תא גם, הצבת אחד שווה ערך מעיים לכל באר. לשטוף את הרקמה שווה שלוש פעמים עם DPBS 1x.
    3. להוסיף 300 μL של 1 פתרון MTT מ"ג/מ"ל, מדולל במדיום התא המתאים, לכל באר. דגירה את הצלחות במשך 3 שעות בתנאי תרבות תא סטנדרטיים.
    4. הסר את פתרון MTT מכל באר בזהירות על-ידי pipetting. לחלץ formazan MTT מן המעי והכבד שווה ערך באמצעות 200 μL של isopropanol לכל לילה ב 4 ° C.
      הערה: אטמו את המכסה כדי למנוע אידוי.
    5. להעביר 200 μL של כל supernatant לבאר המזוהה מראש בהתאמה בצלחת בדיקה מיקרו 96 גם. השתמש isopropanol כריק.
    6. קרא את ספיגת formazan לקורא צלחת ב 570 נמיר. חישוב היכולת היחסית של התאים להפחית MTT (%) שימוש בצפיפות האופטית הממוצעת של כל נקודת זמן, בהשוואה לבקרה השלילית, הנחשבת לכדאיות של 100% תאים.
  2. ציטוכימיה/היסטולוגיה
    1. לתקן את המקבילות המעי והכבד, במשך 25 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות 4% (w / v) paraformaldehyde ב 0.1 M פוספט תמיסת מלח, pH 7.4. לשטוף את האורבנואידים 5 פעמים במאגר PBS במשך 10 דקות בכל פעם. כתם את המעי ואת המקבילות בכבד עם tetramethylrhodamine isothiocyanate-phalloidin או אלקסה פלור 647 פאלודין, 1:50 ב PBS31.
    2. מעבירים אותם למדיום הקפאה OCT במשך כמה דקות כדי להסתגל ב RT לפני העברתם חנקן נוזלי עד להקפאה מלאה. לבצע קריוסקטים כדורי כבד על 10-12 μm עבה, באמצעות cryostat.
    3. הר את מקטעי הרקמות במדיום הרכבה עם DAPI. בדוק אותם על ידי מיקרוסקופ פלואורסץ confocal.
    4. להקפיא את organoids לאחר קיבעון לבצע המטוקסילין & כתמים אאוסין על פי הפרוטוקולים שנקבעו. הר השקופיות עם הרכבה בינונית לאחר חיתוך הרקמה כמתואר לעיל ולקחת תמונות היסטולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.
  3. ניתוח תוכן גבוה
    1. המיטוכונדריה והכתמים הגרעיניים של התאים
      1. לשחזר את האבקה lyophilized ב DMSO כדי להפוך 1 mm מיטוכונדריאלי תמיסת מניות (למשל, MitoTracker עמוק אדום FM). אחסן פתרון מניות aliquoted ב -20 °C מוגן מפני אור. לדלל את 1 mM מיטוכונדריאלי תמיסת מניות כתמים לריכוז הסופי (200 מילימ') בטרום חחום (37 ° C) תרבות רקמות בינוני ללא סרום.
      2. הסר את מדיה תרבות התא. הוסף את פתרון הכתמים המיטוכונדריאלי כדי לכסות לחלוטין את הדגימה ודגירה תאים במשך 15-45 דקות ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
      3. מסירים בזהירות את פתרון העבודה של הכתמת המיטוכונדריה ומחליף אותו ב-2-4% קיבעון paraformaldehyde ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. יש לשטוף את התאים הקבועים בעדינות באמצעות PBS למשך 5 דקות. חזור על תהליך הכביסה פעמיים.
      5. להכין 10 מ"ג /מ"ל (16.23 M) חומצה גרעין מכתים תמיסת מלאי על ידי המסת 100 מ"ג של Hoechst 33342 צבע ב 10 מ"ל של מים אולטרה פורים.
        הערה: יש לצטט את פתרון המלאי ולאחסן אותו מוגן מפני אור ב-20°C.
      6. להכין 0.2-2.0 μg / מ"ל חומצה גרעין מכתים פתרון עבודה PBS דגירה את התאים מקובעים עם חומצה גרעין מכתים פתרון עבודה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
      7. הסר את תמיסת ההכתמה של חומצת הגרעין ושטוף את התאים בעדינות עם PBS במשך 5 דקות שלוש פעמים. יש לשמור על תאים ב-PBS ב-4°C, מוגנים מפני אור.
    2. ניתוח כתמים מיטוכונדריאליים וגרעיניים
      1. לנתח תאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנס עם ערכות מסנן המתאים כתם חומצה גרעין (ρEx / ρEm: 361/497 ננ"מ) ואת הכתם המיטוכונדריאלי (ωEx / ρEm: 644/665 ננ"מ). מצא תאים על ידי חומצה גרעין כתמים חיוביים לכמת את מספר התא. לכמת את עוצמת הפלואורסצנטיות של כתם מיטוכונדריאלי במיטוכונדריה.
  4. מדידות מורפומטריות (חישובי ספרואידים) ב- ImageJ
    1. יצא תמונות ניתוח תוכן גבוה (HCA) כקבצי *.flex מהתוכנה Columbus. יבא קבצי .flex כגווני אפור ב- ImageJ באמצעותתוסף ביו-פורמטים 32: קובץ > ייבוא > פורמטים ביולוגיים.
    2. בחלון אפשרויות ייבוא, בחר הצגה Hyperstack והפוך ערוצי פיצול לזמינים תחת פיצול לחלונות נפרדים. אפשרות זו תאפשר גישה של כל הקבצים בערוץ מסוים (למשל, DAPI, מיטוטרטר וכו'). אל תבחר באפשרות השתמש מחסנית וירטואלית תחת ניהול זיכרון.
      הערה: עדיף להשתמש בערוץ DAPI כ"אבק" בתמונות כמדיום תרבות מופחת באורך גל UV (למשל, 405 נה"מ).
    3. כוונן את גודלהפיקסל ( ניתוח > קבע קנהמידה) אם הוא לא נטען בהתאם לערכים מוטבעים בקובץ ה- .flex. החל מסנן טשטוש גאוסיאני כדי להסיר את עודף הרעש ולהימנע מחריגות בקווי המתאר של הצורה. תהליך > מסננים > טשטוש גאוס . ערך גבוה של סיגמא (רדיוס) בין 2.0 ל- 3.0 הוא אידיאלי עבור רוב המקרים. אם המחסנית כוללת מספר תמונות, החל על כולן (בחר כן בחלון מחסנית תהליך).
    4. צור תמונה בינארית כדי להפריד בין רקע לבין אורגנואידים (אובייקטים) באמצעות סף. לחץ על תמונה > כוונן > סף. השתמש במסכה האדומה כדי להתאים את הערכים בהתאם לעוצמת התמונה, כדי להתאים את צורת האורגן, תוך שמירה על המורפולוגיה ללא שינוי. הפוך רקע כהה ללא זמין אם לתמונה יש רקע לבן. לחץ על החל.
    5. בחלון המרת מחסנית לחלון בינארי, בחר בשיטת הסף. בדרך כלל, ברירת מחדל או משולש מועדפים בעיבוד תמונה מסוג זה. שמור על הרקע כהה . בחר חשב סף עבור כל תמונה אם קיימות מספר תמונות בערימה.
    6. בחר תהליך > בינארי > מילוי חורים. לחלופין, הסר חורים מהרקע. בתהליך > בינארי > אפשרותs, בחר רקע שחור ובצע חורי מילוי שוב. הפוך את האפשרות 'רקע שחור ללא זמין' לפני שתמשיך לשלב הבא.
    7. הפרד אובייקטים. עבור אורגנואידים, שיטת קו פרשת המים היא בחירה טובה. לחץ על תהליך > בינארי > קו פרשת המים. בצע את ניתוח הצורה.
      1. בחר 'נתח' > 'קבע מידות'. מספר אפשרויות זמינות (פרטים https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). עבור אורגנואידים, בחר אזור, ערך אפור ממוצע, ערך אפור מרבי ומתארי צורה. לחלופין, בחר הצג תווית כדי לזהות אובייקטים בתמונה ובסימון מדעי. לחץ על אישור.
      2. בחר ניתוח > נתח חלקיקים. בחר את מגבלות הגודל והמעגליות. שמור 0 אינסוף ו- 0.00-1.00, בהתאמה כדי למדוד את כל האובייקטים בתמונה. ב'הצג', בחרו 'קווי מתאר' כך שהאובייקטים יזוהו. אפשר תוצאות תצוגה לתוצאות פלט; אל תכלול בקצוות כדי לא לכלול אובייקטים נוגעים בגבולות; כלול חורים כך חורים פנימיים בסופו של דבר באובייקטים נחשבים כחלק מהצורה הראשית.
    8. חזור על ניתוח צורה עבור כל מחסנית תמונות והתוצאות יצורפו בטבלה אחת. יצא טבלת תוצאות בקובץ > שמירה .csv בשם...
  5. PCR בזמן אמת
    1. לחלץ RNA מן המקבילות רקמות באמצעות פתרון monophasic של פנול ו guanidine isothiocyanate, בעקבות הוראות היצרן.
    2. לבצע את סינתזה cDNA על ידי שעתוק הפוך של 1 – 2 μg של RNA הכולל.
    3. הגביר את כל המטרות באמצעות פריימרים ספציפיים לגן (טבלה 5) כדי לבצע PCR כמותי בזמן אמת. כל qRT-PCR מכיל 30 ng של RNA מתעתק לאחור ו- 100 nM של כל פריימר.
    4. בצע את תנאי PCR: 50 °C במשך 3 דקות (מחזור אחד); 95 °C למשך 5 דקות (מחזור אחד); 95°C למשך 30 שניות, 59°C למשך 45 שניות ו-72°C למשך 45 שניות (35 - 40 מחזורים).
  6. סיסאי CYP
    1. בצע את סעיף 2.2 להרכבת כבד 2-OC. הקבוצות הניסיוניות הן ללא תא שליטה, APAP 2 μM טיפולים עבור 12 שעות, 24 שעות, ובקרה ברכב. בצע את הסעיפים 3.3 ו 4.2 עבור APAP 2 μM הכנה וטיפול.
      הערה: כדי להבטיח שכל הדגימות יהיו מוכנות בו-זמנית עבור CYP assay, התחל את הטיפול 12 שעות 12 שעות לאחר תחילת הטיפול 24 שעות. טפל בשליטה ללא תאים של פעילות CYP עם פתרון אתנול 0.5%, כמו גם בקרת הרכב.
    2. להפשיר 3 mM פתרון מלאי שלמצע luminogenic בטמפרטורת החדר ו לעשות דילול 1:1000 ב E S של ויליאם להגן מפני אור.
    3. לאסוף spheroids ולהעביר כל קבוצה ניסיונית לבאר של צלחת 96-באר. הסר את המדיום, לשטוף פעמיים עם 100 μL של 1x DPBS ולהוסיף 80 μL של 3 μM פתרון המצע לכל טוב. שמור את השליטה ללא תאים במדיום E S של ויליאם. שמור באר ללא spheroids או פתרון ההחתמה עבור בקרת רקע. דגור במשך 30-60 דקות ב- 37 °C עם 5% CO2, מוגן מפני אור.
    4. שיווי משקל ליופיליה לוציפרין זיהוי רייגנט (LDR) באמצעות מאגר Reconstitution עם esterase. מערבבים על-ידי מערבול או היפוך. אחסן את אמצעי האחסון המתאים בטמפרטורת החדר עד לשלב הבא.
      הערה: ניתן לאחסן את LDR מחדש בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות או ב- 4 °C למשך שבוע אחד ללא אובדן פעילות. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב- -20°C.
    5. להעביר 25 μL של סופרנטנט של ספרואידים שלמים בשלוש בארות שונות של לבן אטום 96-באר microplate, לאחר הדגירה. להוסיף 25 μL של LDR לכל באר הומוגניזציה.
    6. מנטרים את הצלחת הלבנה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות. קרא את הזוהר על מד לומינומטר. אל תשתמש בפלואורומטר.
    7. חשב אותות נטו על-ידי חיסור ערכי זוהר רקע (פקד ללא תאים) מהערכים שטופלו בבדיקה ולא טופלו (בקרת רכב). חשב אחוז שינוי של פעילות CYP3A4 על-ידי חלוקת הערכים נטו שטופלו על-ידי הערכים נטו לא מטופלים והכפלה ב- 100.
  7. כתמים מערביים
    1. להעביר את כדורי הכבד למיקרו-טיוב שזוהה ב-1.5 מ"ל. הסר את המדיום ושטוף פעמיים עם 100 μL של DPBS אחד.
    2. לזלות את כדורי הכבד ב 100 μL של תא lysis RIPA מאגר ב 4 ° C במשך 20 דקות. צנטריפוגה למשך 15 דקות, 4°C ו-11,000 סל"ד. להעביר את supernatant למיקרוTube 1.5 מ"ל מזוהה אחר.
    3. לכמת את כמות החלבון המתקבל באמצעות שיטת ברדפורד. לטעון בין 10 ל 50 μg של חלבון מהתא מכמת lysate לכל באר של ג'ל פוליקרילאמיד הדרגתי 3-15% ולבצע SDS-PAGE.
    4. מעבירים את החלבון הטעון מהז'ל לממברנה PVDF של 0.22 μm באמצעות ציוד המערכת היבש למחצה. השתמש בפתרון העברה של 50 מ"מ Tris-HCl ו 192 mM גלצין. הגדר פרמטרים של ציוד בהתאם למספר הג'לים להעברה (1 עד 2 בכל פעם).
    5. לחסום אינטראקציות לא ספציפיות על קרום PVDF עם תמיסת חלב 3-5% חלב דל שומן במאגר TBS-T: Tris-Buffered תמיסת מלח (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM נתרן כלוריד) בתוספת 0.1% של Tween 20. שמרו על הממברנה תחת רעד מתמשך בעדינות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
    6. יש לשטוף עם TBS-T תחת רעידות קבועות בעדינות במשך 3-5 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
    7. דילו אלבומין ונוגדנים ראשיים vinculin ל 1:1000 ו 1:2000 בהתאמה על TBS-T. דגירה קרום עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס, תחת רעידות קבועות בעדינות.
      הערה: פעל תמיד לפי הוראות היצרן כדי לדלל נוגדנים.
    8. הסר את הנוגדן הראשי ושטוף את הממברנה 3 פעמים (שלב 6.7.6). דיללו את הנוגדן המשני IgG נגד עכברים ECL ל- 1:5000 ב-TBS-T. דגירה את הממברנה עם נוגדן משני תחת טלטול קבוע בעדינות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
    9. הסר את הנוגדן המשני ושטוף את הממברנה (שלב 6.7.6). בצע זיהוי חלבונים באמצעות ECL המערבי Blotting סאבסט. לחשוף את הסרטים האוטודיוגרפיים במשך 30-30 דקות. בצע את זיהוי immunoblotting בטרישת 3.

תוצאות

כדי לבצע את בדיקות APAP PK ב 2-OC MPS, הצעד הראשון הוא לייצר את המעי האנושי וכבד שווה ערך (אורגנואידים). הם משולבים בהתקן מיקרו-נוזל 2-OC (איור 1A) 24 שעות לפני תחילת תוואי APAP PK. למחרת, המדיום משתנה, והמודל נחשף APAP. איור 1 ממחיש את המקבילות של המעי והכבד הממוקמות בתוך התקן 2-...

Discussion

ההערכה המדויקת והאמינה של המאפיינים הפרמקולוגיים של תרופות חדשות חוקרות היא קריטית להפחתת הסיכון בשלבי הפיתוח הבאים. MPS היא טכנולוגיה חדשה יחסית, שמטרתה לשפר את הכוח החזוי ולהפחית את העלויות והזמן בילה עם בדיקות פרה-קלינליות. הקבוצה שלנו מתקדמת בהערכת תכונות פרמקוקינטיות וטוקסיקולוגיות...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים לד"ר כריסטי Guguen-Guillouzo, ד"ר פיליפ גריפון ביחידה 522 INSERM וד"ר כריסטיאן Trepo ביחידה 271 INSERM לשימוש בחומר הביולוגי (Hepa RG תאים) ועל הפיכתו לאחר מכן זמין עבורנו על מנת לבצע את המחקר האקדמי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

References

  1. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
  2. Hynds, R. E., Giangreco, A. The relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
  3. Sivaraman, A., et al. A Microscale In vitro Physiological Model of the Liver: Predictive Screens for Drug Metabolism and Enzyme Induction. Current Drug Metabolism. 6 (6), 569-591 (2005).
  4. Dehne, E. M., Hasenberg, T., Marx, U. The ascendance of microphysiological systems to solve the drug testing dilemma. Future Science OA. 3 (2), 185 (2017).
  5. Oleaga, C., et al. Multi-Organ toxicity demonstration in a functional human in vitro system composed of four organs. Scientific Reports. 6, 20030 (2016).
  6. Maschmeyer, I., et al. A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents. Lab Chip. 15 (12), 2688-2699 (2015).
  7. Esch, M. B., Mahler, G. J., Stokol, T., Shuler, M. L. Body-on-a-chip simulation with gastrointestinal tract and liver tissues suggests that ingested nanoparticles have the potential to cause liver injury. Lab Chip. 14 (16), 3081-3092 (2014).
  8. Materne, E. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. Journal of Visualized Experiments. , e52526 (2015).
  9. Esch, M. B., Ueno, H., Applegate, D. R., Shuler, M. L. Modular, pumpless body-on-a-chip platform for the co-culture of GI tract epithelium and 3D primary liver tissue. Lab Chip. 16 (14), 2719-2729 (2016).
  10. Sung, J. H., Kam, C., Shuler, M. L. A microfluidic device for a pharmacokinetic–pharmacodynamic (PK-PD) model on a chip. Lab on a Chip. 10 (4), 446-455 (2010).
  11. Viravaidya, K., Sin, A., Shuler, M. L. Development of a Microscale Cell Culture Analog to Probe Naphthalene Toxicity. Biotechnology Progress. 20 (1), 316-323 (2004).
  12. Sin, A., Chin, K. C., Jamil, M. F., Kostov, Y., Rao, G., Shuler, M. L. The Design and Fabrication of Three-Chamber Microscale Cell Culture Analog Devices with Integrated Dissolved Oxygen Sensors. Biotechnology Progress. 20 (1), 338-345 (2004).
  13. Tsamandouras, N., et al. Integrated Gut and Liver Microphysiological Systems for Quantitative In vitro Pharmacokinetic Studies. The AAPS Journal. 19 (5), 1499-1512 (2017).
  14. Graham, G. G., Davies, M. J., Day, R. O., Mohamudally, A., Scott, K. F. The modern pharmacology of paracetamol: Therapeutic actions, mechanism of action, metabolism, toxicity and recent pharmacological findings. Inflammopharmacology. 21 (3), 201-232 (2013).
  15. Hodgman, M. J., Garrard, A. R. A Review of Acetaminophen Poisoning. Critical Care Clinics. 28 (4), 499-516 (2012).
  16. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 95, 77-87 (2015).
  17. Bessems, J. G. M., Vermeulen, N. P. E. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: Molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches. Critical Reviews in Toxicology. 31 (1), 55-138 (2001).
  18. Hirt, M. N., et al. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: A new in vitro model. Basic Research in Cardiology. 107 (6), 307 (2012).
  19. Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 14 (5), 669-679 (2000).
  20. Zhang, B., Peticone, C., Murthy, S. K., Radisic, M. A standalone perfusion platform for drug testing and target validation in micro-vessel networks. Biomicrofluidics. 7 (4), 044125 (2013).
  21. Araújo, F., Sarmento, B. Towards the characterization of an in vitro triple co-culture intestine cell model for permeability studies. International Journal of Pharmaceutics. 458 (1), 128-134 (2013).
  22. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnology Reports. 7, 9-16 (2015).
  23. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  24. Guillouzo, A., et al. The human hepatoma HepaRG cells: A highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-Biological Interactions. 168 (1), 66-73 (2007).
  25. Wagner, I., et al. A dynamic multi-organ-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture. Lab on a Chip. 13 (18), 3538-3547 (2013).
  26. Forrest, J. A. H., Clements, J. A., Prescott, L. F. Clinical Pharmacokinetics of Paracetamol. Clinical Pharmacokinetics. 7 (2), 93-107 (1982).
  27. Dollery, C. . Therapeutic Drugs. , (1999).
  28. Shah, V. P., et al. Bioanalytical method validation-a revisit with a decade of progress. Pharmaceutical research. 17 (12), 1551-1557 (2000).
  29. Marin, T. M., et al. Shp2 negatively regulates growth in cardiomyocytes by controlling focal adhesion kinase/src and mTOR pathways. Circulation Research. 103 (8), 813-824 (2008).
  30. Linkert, M., et al. Metadata matters: Access to image data in the real world. Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  31. OECD. OECD TG 491 - Short Time Exposure In vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage. OECD. 14, (2018).
  32. Fernandes, M. B., Gonçalves, J. E., Tavares, L. C., Storpirtis, S. Caco-2 cells permeability evaluation of nifuroxazide derivatives with potential activity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Drug Development and Industrial Pharmacy. 41 (7), 1066-1072 (2015).
  33. OECD. OECD TG 492 - Reconstructed human Cornea-like Epithelium (RhCE) test method for identifying chemicals not requiring classification and labelling for eye irritation or serious eye damage. OECD. 35, (2018).
  34. OECD, O. E. C. D. OECD TG 431 - In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RHE) test method. OECD. 8, (2016).
  35. OECD. OECD TG 439 - In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method. OECD. 21, (2015).
  36. Marin, T. M., et al. Acetaminophen absorption and metabolism in an intestine/liver microphysiological system. Chemico-Biological Interactions. 299, 59-76 (2019).
  37. Maass, C., Stokes, C. L., Griffith, L. G., Cirit, M. Multi-functional scaling methodology for translational pharmacokinetic and pharmacodynamic applications using integrated microphysiological systems (MPS). Integrative Biology (United Kingdom). 9 (4), 290-302 (2017).
  38. Sung, J. H., Wang, Y., Shuler, M. L. Strategies for using mathematical modeling approaches to design and interpret multi-organ microphysiological systems (MPS). APL Bioengineering. 3 (2), 021501 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

166ADMETox

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved