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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir haben ein mikrophysiologisches System (MPS) mit Darm- und Leberorganoiden Acetaminophen (APAP) ausgesetzt. Dieser Artikel beschreibt die Methoden für die Organoidproduktion und APAP pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaftenbewertungen im MPS. Es beschreibt auch die Gewebefunktionsanalysen, die notwendig sind, um die Ergebnisse zu validieren.

Zusammenfassung

Die kürzlich eingeführten mikrophysiologischen Systeme (MPS), die humane Organoide kultivieren, sollen in der präklinischen Testphase des Arzneimittelentwicklungsprozesses besser abschneiden als Tiere, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. In dieser Studie wurden die menschliche Darmbarriere (emuliert durch eine Kokultur von Caco-2- und HT-29-Zellen) und das Leberäquivalent (emuliert durch Sphäroide aus differenzierten HepaRG-Zellen und humanen Hepatic Stellate-Zellen) in einen Zwei-Organ-Chip (2-OC) mikrofluidischen Gerät integriert, um einige Acetaminophen (APAP) pharmakokinetische (PK) und toxische Eigenschaften zu bewerten. Die MPS hatte drei Baugruppen: Darm nur 2-OC, Leber nur 2-OC, und Darm/Leber 2-OC mit dem gleichen Medium durchdringen beide Organoide. Für PK-Bewertungen dosierten wir das APAP in den Medien zu voreingestellten Zeitpunkten, nachdem wir es entweder über die Darmbarriere (Emulierung des oralen Weges) oder in den Medien (Emulierung des intravenösen Weges) verabreicht hatten, auf 12 m bzw. 2 m. Die Medienproben wurden mittels umgekehrter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Organoide wurden auf Genexpression, für TEER-Werte, auf Proteinexpression und -aktivität analysiert und dann gesammelt, fixiert und einer Reihe morphologischer Auswertungen unterzogen. Die MTT-Technik schnitt bei der Beurteilung der Organoid-Lebensfähigkeit gut ab, aber die Hochgehaltsanalysen (HCA) konnten sehr frühe toxische Ereignisse als Reaktion auf die APAP-Behandlung erkennen. Wir haben überprüft, dass der Medienfluss die APAP-Absorption nicht signifikant beeinflusst, während er die Leberäquivalentfunktionalität erheblich verbessert. Die aPAP menschliche Darmabsorption und Leberstoffwechsel könnte im MPS emuliert werden. Die Verbindung zwischen MPS-Daten und der Silico-Modellierung hat ein großes Potenzial, die Vorhersehbarkeit der In-vitro-Methoden zu verbessern und eine bessere Genauigkeit als Tiermodelle in pharmakokinetischen und toxikologischen Studien zu bieten.

Einleitung

Aufgrund genomischer und proteomischer Unterschiede haben Tiermodelle einen begrenzten Vorhersagewert für mehrere menschliche Ergebnisse. Darüber hinaus sind sie zeitaufwändig, teuer und ethisch fragwürdig1. MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und zeitaufwand für präklinische Tests zu reduzieren. Sie sind mikrofluidische Geräte, die Organoide (künstliche Mimetik-Funktionseinheiten von Organen) unter Medienfluss kultivieren, die organoid-organoide Kommunikation fördert. Organoide aus menschlichen Zellen erhöhen die translationale Relevanz2,3,4. Es wird erwartet, dass MPS besser abschneidet als die Tierversuche, da sie genetisch menschlich sind und das Zusammenspiel zwischen Geweben rekapitulieren. Wenn das MPS voll funktionsfähig ist, liefert es aussagekräftigere Ergebnisse bei höherer Geschwindigkeit und niedrigeren Kosten und Risiken4. Viele Gruppen entwickeln MPS für mehrere Zwecke, vor allem Krankheitsmodelle, um die Wirksamkeit des Medikaments zu testen.

Expositionsniveau ist einer der kritischsten Parameter für die Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von Arzneimitteln5,6,7,8,9,10,11,12. MPS ermöglicht eine organoide Integration, die eine systemische Exposition emuliert und eine bessere Leistung als die traditionelle 2D-Gewebekultur erwartet. Diese Technologie kann die Vorhersage der zusammengesetzten Darmabsorption und Desleberstoffwechsel deutlich verbessern4.

Ein MPS, das menschlicheäquivalente Modell von Darm und Leber integriert, ist ein guter Ausgangspunkt, wenn man die zentrale Rolle dieser beiden Organe bei der Bioverfügbarkeit von Medikamenten und der systemischen Exposition13,14,15betrachtet. APAP ist ein attraktives Medikament für das Studium eines MPS ohne Nierenäquivalent, weil seine Metabolisierung vor allem von der Leber16,17erfolgt.

Das 2-OC ist ein zweikammeriges mikrofluidisches Gerät, das für die Kultur von zwei verschiedenen menschlichen Äquivalentgeweben/Organoiden geeignet ist, die durch Mikrokanäle16miteinander verbunden sind. Um eine orale/intravenöse Verabreichung eines Arzneimittels beim Menschen in vitro zu emulieren und die Auswirkungen des Kreuzgesprächs zwischen Darm- und Leberäquivalenten auf die APAP-Pharmakokinetik zu bewerten, wurden neben der Funktionalität und Lebensfähigkeit der Organoide drei verschiedene MPS-Baugruppen durchgeführt: (1) ein "Darm 2-OC MPS", das aus einem Darmäquivalent besteht, das in einem Kultureinsatz basiert, der eine Kokultur von Caco-2 + HT-29-Zellen enthält; (2) ein "Liver 2-OC MPS" bestehend aus Lebersphäroiden aus HepaRG + HHSteC (Human Hepatic Stellate Cells), die in das 2-OC-Gerät integriert sind; und (3) ein "Darm/Leber 2-OC MPS" bestehend aus dem Darmäquivalent in einem Gerätefach, das durch den Medienfluss durch die mikrofluidischen Kanäle mit dem Leberäquivalent im anderen kommuniziert.

Alle Assays wurden unter statischen (keinen Durchfluss) und dynamischen (mit Strömung) Bedingungen aufgrund der Auswirkungen der mechanischen Reize (Kompression, Dehnung und Scherung) auf die Zelllebensfähigkeit und Funktionalitäten18,19,20durchgeführt. Der vorliegende Artikel beschreibt das Protokoll für die APAP-Oral-/Intravenous-Verabreichungsemulation und die jeweiligen Absorptions-/Stoffwechsel- und toxikologischen Analysen in der 2-OC-MPS, die menschliche Darm- und Leberäquivalentmodelle enthält.

Protokoll

1. Herstellung von Gewebeäquivalenten für den Anbau im 2-OC

  1. Dünndarmbarriere äquivalente Produktion
    1. Erhalten Sie Caco-2- und HT-29-Zellen mit dem Darmäquivalentmedium: DMEM ergänzt mit 10% FBS, 1% Penicillin und Streptomycin und 1% nicht essentiellen Aminosäuren, die in diesem Manuskript als "DMEM S" bezeichnet werden.
    2. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie zweimal mit 1x DPBS und fügen Sie 8 ml 0,25% Trypsin/EDTA hinzu, um Caco-2-Zellen, die in Zellkulturkolben angebaut werden, zu dissoziieren (175 cm2). Inkubieren Sie für 5 min bei 37 °C und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie mindestens das doppelte Volumen des Trypsin-Inhibitors hinzufügen. Führen Sie das gleiche Verfahren für HT-29-Zellen durch, indem Sie die Reagenzvolumina anpassen, da eine kleinere Menge dieser Zellen benötigt wird und sie in kleineren Kolben (75 cm2)gehalten werden.
    3. Zentrifugieren Sie bei 250 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand aus beiden Röhrchen und setzen Sie die Zellpellets in 10 ml DMEM S. Count-Zellen wieder auf, wodurch eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80 % erreicht wird. Aseptisch integrieren Zellkultureinsätze in einer 24-Well-Platte, die zuvor mit 400 l DMEM S pro Brunnen in der basolateralen Seite gefüllt war (die den menschlichen Blutkreislauf darstellt).
    4. Kokultivieren Sie Caco-2- und HT-29-Zellen im Verhältnis 9:121. Verwenden Sie 2,25 x 105 Caco-2 und 2,5 x 104 HT-29 Zellen zu jedem Darmäquivalent in einem Endvolumen von 200 l DMEM S. Passen Sie die Zellzahlen und das Volumen an die gewünschte Anzahl von Organoiden an. Mischen Sie sorgfältig.
    5. Pipette 200 l Zelllösung in die apikale Seite jedes Inserts (die die menschliche Darmlumenseite darstellt), sät 250.000 Zellen pro Einsatz. Die Zellen in den Einsätzen drei Wochen lang mitkultivieren22. Wechseln Sie das Medium mindestens dreimal pro Woche, indem Sie es sowohl von der apikalen als auch von der basolateralen Seite mit einer sterilen Pasteur-Pipette ansiedeln und darauf achten, die intakte Zellbarriere nicht zu beschädigen.
      HINWEIS: Fahren Sie mit der Aspiration auf der apikalen Seite fort, um die Zellbarriere nicht zu berühren (Aspirat durch Unterstützung der Pasteur-Pipette am Kunststoffrand des Zelleinsatzes).
    6. Überprüfen Sie die enge Monolayer-Bildung, indem Sie den TEER (transepitheliale elektrischen Widerstand) alle drei Tage mit einem Voltmeter23messen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
      1. Führen Sie einen Rohling aus, indem Sie den Widerstand über einen Zellkultureinsatz ohne Zellen, jedoch mit demselben Zellmedium und an derselben Zellplatte messen.
      2. Berechnen Sie den Gewebewiderstand, indem Sie den Rohlingswiderstand von der gewebeäquivalenten Resistenz subtrahieren, und multiplizieren Sie mit der effektiven Oberfläche der Filtermembran (0,6 cm2). Eine gute Darmbarriereresistenz liegt im Bereich von 150 bis 400 Ω cm2.
        HINWEIS: Nach 21 Tagen müssen die Zellen vollständig differenziert und die Darmbarriere gebildet werden, damit die Darmäquivalente bereit sind, in MPS integriert zu werden.
  2. Leberäquivalente Produktion
    1. Pflegen Sie HepaRG-Zellen mit dem Leberäquivalentmedium, das Williams Medium E ist, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/mL Streptomycin, 5 g/ml Humaninsulin und 5 x 10-5 M Hydrocortison und heißt in diesem Manuskript "Williams E S". Erneuern Sie HepaRG-Medien alle 2-3 Tage und pflegen Sie die Zellkultur für zwei Wochen, um die Differenzierung in Hepatozyten und Cholangiozyten einzuleiten.
    2. Nach den ersten zwei Wochen 2% DMSO für weitere zwei Wochen zu HepaRG hinzufügen, um die Zelldifferenzierung24,25zu vervollständigen. Wachsen Sie HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), mit Poly-L-Lysin-beschichteten Zellkulturkolben, die Medien alle zwei oder drei Tage wechseln.
    3. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie zweimal mit 1x DPBS und fügen Sie 8 ml 0,05% Trypsin/EDTA hinzu, um HepaRG-Zellen zu dissoziieren, die in Zellkulturkolben (175 cm2)angebaut werden. Inkubieren Sie für 5 bis 10 min bei 37 °C und stoppen Sie die Reaktion, indem Sie mindestens das Doppelte des Volumens des Trypsin-Inhibitors hinzufügen. Führen Sie das gleiche für HHSTeC durch, das Reagenzvolumen anzupassen, da eine kleinere Menge dieser Zellen benötigt wird und sie in kleineren Kolben (75 cm2)gehalten werden können.
    4. Zentrifugieren Sie beide bei 250 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellpellets in Williams E S Medium wieder auf. Zählen Sie Zellen, um eine Zelllebensfähigkeit von mehr als 80 % zu gewährleisten.
    5. Generieren Sie die Lebersphäroide, die HepaRG- und HHSTeC-Zellen im Verhältnis 24:1 bzw. in Williams E S medium16kombinieren. Fügen Sie 4,8 x 104 differenzierte HepaRG und 0,2 x 104 HHSTeC hinzu, um jedes Lebersphäroid von 50.000 Zellen in einem Volumen von 80 l zu komponieren. Mischen Sie sorgfältig.
    6. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 80 l des kombinierten Zellpools in jedem Brunnen von 384 Sphäroid-Mikroplatten aus, die eine runde Bodengeometrie aufweisen.
      HINWEIS: Nach vier Tagen bilden sich Sphäroide von ca. 300 m.
    7. Übertragen Sie die Lebersphäroide mit Weitbohrspitzen auf ultra-low-attachment 6 Well-Platten, was die erforderliche "Eins-für-Eins"-Zählung ermöglicht.

2. Integration von Darm- und Leberäquivalenten in ein 2-OC MPS

  1. Darm 2-OC MPS-Baugruppe für Absorptionstest
    1. Pipette 500 l DMEM S in das größere Fach von 2-OC und 300 l im kleineren. Aspirieren Sie die basolateralen und apikalen Medien jedes Darmbarriereäquivalents in den 24 Brunnenplatten. Integrieren Sie mit sterilen Zangen einen Einsatz pro 2-OC-Schaltung speziell in das größere Fach. Tragen Sie 200 l des Darmmediums an der apikalen Seite auf.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von Blasen, wenn Sie die Organoide in das MPS integrieren.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
  2. Leber 2-OC MPS-Baugruppe für Stoffwechsel-Assay
    1. Pipette 650 l von Williams E S in das große Fach und 350 l in das kleinere Fach, das die Sphäroide erhält. In den ultra-low-attachment 6 WellPlatten, zählen Sie die Sphäroide mit Weitbohrspitzen. Jedes Leberäquivalent besteht aus zwanzig Sphäroiden26. Integrieren Sie zwanzig Leberäquivalente pro Kreislauf mit Weitbohrspitzen, die nur den Transfer von Organoiden ermöglichen, in das kleinere Fach eines 2-OC.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
  3. Darm/Leber 2-OC MPS-Baugruppe für Absorptions- und Stoffwechsel-Assay
    1. Kombinieren Sie die beiden Medien (Darm und Leber) in einem Verhältnis von 1:4, was 200 l DMEM S in der darmen apikalen Seite und 800 l von Williams E S in der basolateralen Seite bedeutet. Integrieren Sie Darm- und Leberäquivalente gleichzeitig im 2-OC.
    2. Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an, das an eine Druckluftzufuhr angeschlossen werden muss. Stellen Sie die Parameter ein: einen Druck von ca. ±300 bar und eine Pumpfrequenz von 0,3 Hz. Starten Sie den Durchfluss 24 h vor der Verabreichung der Prüfsubstanz. Führen Sie am nächsten Tag die APAP-Behandlung durch.
      HINWEIS: Führen Sie für alle Experimente jeden Zeitpunkt in Dreifacharbeit durch, d. h. drei getrennte 2-OC-Schaltungen (d. h. 1 und 1/2 2-OC-Geräte). Das Gesamtvolumen jeder 2-OC-Schaltung beträgt 1 ml.

3. Acetaminophen (APAP) Zubereitung

  1. Bereiten Sie die APAP-Lagerlösung vor und lösen Sie APAP in absolutem Ethanol. Am Tag des Experiments aPAP im jeweiligen Medium (APAP-Lösung) verdünnen, auf eine Konzentration von 12 m für die "orale Verabreichung" und 2 m für die "intravenöse Verabreichung".
  2. Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration von Ethanol in der Fahrzeugsteuerungs- und Behandlungslösung für beide Verabreichungen 0,5 % beträgt. Für die Positivkontrolle (100 mM APAP) beträgt die Ethanolkonzentration 2%.

4. Stoffverabreichung und Medienprobenahme testen

  1. APAP "orale" Verabreichung und Medien-Sampling
    1. Aspirieren Sie die basolateralen und apikalen Medien jedes Darmbarriereäquivalents im 2-OC. Pipette 500 l des entsprechenden Kulturmediums in das große Fach an der organoiden basolateralen Seite und 300 l in das kleine Fach.
    2. Prüfen Sie auf Blasen und gehen Sie mit der Darmbarriere gleichwertige Behandlung mit der Testsubstanz in der apikalen Seite, emulieren orale Verabreichung. Emulieren Sie die "orale" Verabreichung von APAP, indem Sie 200 L einer 12-M-APAP-Lösung auf der apikalen Seite der Darmkultureinsätze hinzufügen, die die darme "Lumenseite" darstellt (Abbildung 1B). Schließen Sie das MPS an das Steuergerät an.
    3. Sammeln Sie das Gesamtvolumen von apikalen und von basolateralen Seiten an den folgenden Zeitpunkten: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, und 24 h15,27. Führen Sie alle Experimente in dreifacher, statischer und dynamischer Situation durch und sammeln Sie jede Probe jeder Dreistikalie in einem separaten Mikrorohr. Analysieren Sie die Proben mit HPLC/UV.
      HINWEIS: Separate apikale und basolaterale Proben.
  2. APAP "intravenöse" Verabreichung und Medienproben
    1. Emulieren Sie die "intravenöse" Route, indem Sie 2 M APAP-Lösung direkt in das Leberfach verabreichen. Alle 2-OC-Medium-Inhalte aspirieren. Pipette 650 l von Williams E S, die die Testsubstanz enthält, in das große Fach und 350 l des gleichen Mediums in das kleinere Fach, das die 20 Sphäroide enthält. Sammeln Sie alle Volumina an folgenden Zeitpunkten: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h und 24 h27,28.
    2. Führen Sie alle Experimente in dreifacher, statischer und dynamischer Situation durch. Sammeln Sie jede Probe, von jedem Dreifachen, in einem separaten Mikrorohr. Analysieren Sie die Proben mit HPLC/UV.

5. Instrumentierung und chromatographische Bedingungen

  1. HPLC-Analyse
    1. Stellen Sie alle relevanten Parameter für die HPLC-Analyse gemäß Tabelle 1ein.
    2. Filtern Sie die mobile Phase durch einen 0,45 m Membranfilter unter Vakuum. Filtern Sie die Proben durch einen PVDF-Spritzenfilter der Porengröße (Durchmesser 13 mm) und lagern Sie sie in einer Durchstechflasche. Starten Sie die Messung.
  2. Bestandslösungen, Kalibrierstandards und QC-Proben (Quality Control)
    1. 10 mM APAP-Lagerlösungen im Ammoniumacetatpuffer (100 mM, pH 6,8) vorbereiten und mit DMEM S und Williams E S zellkulturmedien, verdünnt mit Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v), weiter verdünnen, um die Arbeitslösungen von 0,25 bis 100,00 m zu erreichen.
    2. Fügen Sie eine Reihe von Kalibrierproben in dreifacher sowie Qualitätskontrolle Proben auf vier Ebenen in Dreifache. Bereiten Sie diese Standards durch serielle Verdünnung vor.
    3. Erstellen Sie Kalibrierkurven von APAP-Spitzenbereichen im Vergleich zu APAP-Nominal-Standardkonzentrationen. Bestimmen Sie die lineare Regressionsanpassung für jede Kalibrierkurve. Bewerten Sie die Passgenauigkeit verschiedener Kalibriermodelle anhand visueller Inspektion, Korrelationskoeffizient, Intra- und Interrun-Genauigkeit und Präzisionswerten.
    4. Injizieren Sie leere Proben von DMEM S und Williams E S Medien in Ammoniumacetat Puffer (1:1, v/v) in Sextuplikat verdünnt. Bereiten Sie Triplicate von Qualitätskontrollproben in DMEM S- und Williams E S-Medien vor, die mit Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) für die APAP-Konzentrationen von 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 und 90,00 m verdünnt wurden.
    5. Stellen Sie sicher, dass die Qualitätskontrollproben aus einer neuen Lagerlösung hergestellt werden, die sich von der zur Erzeugung einer Standardkurve verwendeten unterscheidet. Verwenden Sie Qualitätskontrollproben, um Intra- und Inter-Run-Variationen zu untersuchen.
  3. Validierungsverfahren
    1. Führen Sie die bioanalytische Methodenvalidierung nach den zuvor gemeldeten Verfahren29,30durch. Führen Sie die chromatographischen Läufe bei fünf oder sechs verschiedenen Gelegenheiten durch, wobei Williams E S bzw. DMEM S Zellkulturmedien berücksichtigt werden.
    2. Stellen Sie sicher, dass Kalibrierpunkte im Bereich von 0,25 bis 100,00 m APAP, in DMEM S oder Williams E S Zellkulturmedien, die im Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) verdünnt sind, basierend auf den Spitzenflächen von APAP (Achse y) gegen die jeweiligen Nennkonzentrationen (Achse x) dargestellt werden. Vergleichen Sie die Steigungen dieser Standardkalibrierungskurven mit Neigungen der Kalibrierkurve, die in Ammoniumacetatpuffern vorbereitet sind. Stellen Sie sicher, dass alle Kalibrierkurven einen Korrelationswert von mindestens 0,998 aufweisen.
    3. Bestimmen Sie die Genauigkeit und Genauigkeit (Intra- und Interrun) für den Analyten in der Ersatzmatrix mithilfe von Replikationen auf vier verschiedenen Ebenen LLOQ, Low, Middle und High-Quality-Kontrolle an fünf oder sechs verschiedenen Tagen. Führen Sie am selben Tag intra-run Präzisions- und Genauigkeitsmessungen in DMEM S- oder Williams E S-Zellkulturmedien durch, die in Ammoniumacetatpuffer (1:1, v/v) verdünnt sind und 0,50, 4,50, 45,00 und 90,00 M APAP-Konzentrationen (n= 3) enthalten.
    4. Bewerten Sie jeden Satz von Qualitätskontrollproben, die die APAP-Konzentrationen aus kürzlich erhaltenen Kalibrierkurven enthalten. Testen Sie die Selektivität der Assays durch den Grad der Trennung der Zinsverbindung und mögliche andere chromatographische Spitzen, die durch störende Komponenten verursacht werden.
  4. Untere Quantifizierungsgrenze (LLOQ) und Nachweisgrenze (LOD)
    1. Bestimmen Sie die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) basierend auf der Standardabweichung der Antwortvariablen und dem Neigungsansatz. Berechnen Sie mit der Formel 10/S, wobei α die Standardabweichung von y-Intercept und S die Steigung der geraden Linie ist, die durch Plotten von Kalibrierkurven29,30erhalten wird. Schätzen Sie die Erkennungsgrenze (LOD) unter Berücksichtigung des 3,3-fachen der Standardabweichung des Rohlings, dividiert durch die Steigung der Kalibrierkurve29,30.

6. Gewebeäquivalente Lebensfähigkeit/Funktionalität

  1. Mtt
    1. Führen Sie einen MTT-Test durch, um die Organoid-Lebensfähigkeit in allen Zeitpunkten des MPS-Assays zu bewerten. Verwenden Sie als Negativkontrolle Zellmedien plus Fahrzeug. Als positiver Schutz, behandeln Sie die Organoide mit 100 mM APAP und 1% NaOH in Zellmedium verdünnt.
    2. Übertragen Sie die 20 Sphäroide jeder Replikation für einzelne Brunnen in einer 96-Well-Platte, und die Zellkultureinsätze, die die Darmäquivalente enthalten, auf 24 Well-Zellplatten, wobei ein Darmäquivalent pro Brunnen platziert wird. Waschen Sie die Gewebeäquivalente dreimal mit 1x DPBS.
    3. Fügen Sie 300 l einer 1 mg/ml MTT-Lösung, verdünnt im jeweiligen Zellmedium, pro Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platten für 3 h bei Standard-Zellkulturbedingungen.
    4. Entfernen Sie die MTT-Lösung aus jedem Brunnen sorgfältig durch Pipettieren. Extrahieren Sie MTT-Formazan aus dem Darm und Leberäquivalente mit 200 l Isopropanol pro Brunnen über Nacht bei 4 °C.
      HINWEIS: Versiegeln Sie den Deckel, um Verdunstung zu verhindern.
    5. Übertragen Sie 200 l jedes Überstands mittels eines Überstandes in einer 96-Well-Mikro-Prüfplatte auf den jeweiligen vordefinierten Brunnen. Verwenden Sie Isopropanol als Leerzeichen.
    6. Lesen Sie die Formazan-Absorption in einem Plattenleser bei 570 nm. Berechnen Sie die relative Fähigkeit der Zellen, MTT zu reduzieren (%) verwendung der durchschnittlichen optischen Dichte jedes Zeitpunktes im Vergleich zur negativen Kontrolle, die als 100% Zelllebensfähigkeit angesehen wird.
  2. Zytochemie/Histologie
    1. Fixieren Sie die Darm- und Leberäquivalente für 25 min bei Raumtemperatur mit 4% (w/v) Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphat-Saline-Puffer, pH 7,4. Waschen Sie die Organoide 5 Mal in PBS Puffer für 10 Minuten jedes Mal. Verflecken Sie das Darm- und leberäquivalente mit Tetramethylrhodamine Isothiocyanat-Phalloidin oder Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Übertragen Sie sie für einige Minuten auf das OCT-Gefriermedium, um sich bei RT zu akklimatisieren, bevor Sie sie bis zum vollständigen Einfrieren in flüssigen Stickstoff übertragen. Führen Sie Lebersphäride Kryosektionen ca. 10-12 m dick, mit einem Kryostat.
    3. Montieren Sie die Gewebeabschnitte im Montagemedium mit DAPI. Untersuchen Sie sie durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie.
    4. Einfrieren der Organoide nach der Fixierung, um Hämatoxylin & Eosin Färbung nach den etablierten Protokollen durchzuführen. Montieren Sie die Dias mit Montagemedium nach dem Schneiden des Gewebes wie oben beschrieben und nehmen Sie histologische Bilder mit einem optischen Mikroskop.
  3. Analyse mit hohem Inhalt
    1. Mitochondriale und nukleare Färbung der Zellen
      1. Rekonstituieren Sie das lyophilisierte Pulver in DMSO, um eine 1 mM mitochondriale Färbung Strumpflösung (z.B. MitoTracker Deep Red FM) herzustellen. Salatierte Lagerlösung bei -20 °C vor Licht schützen. Verdünnen Sie die 1 mM mitochondriale Färbung der Lagerlösung bis zur Endkonzentration (200 nM) in vorgewärmtem (37 °C) Gewebekulturmedium ohne Serum.
      2. Entfernen Sie die Zellkulturmedien. Fügen Sie die mitochondriale Färbung Lösung, um die Probe vollständig zu decken und brüten Zellen für 15-45 min bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%CO2.
      3. Entfernen Sie die mitochondriale Färbung sorgsam und ersetzen Sie sie bei Raumtemperatur 15 Minuten lang durch 2-4% Paraformaldehydfixativ in PBS.
      4. Spülen Sie die festen Zellen 5 Minuten lang vorsichtig mit PBS ab. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal.
      5. Bereiten Sie eine 10 mg/ml (16,23 m) Nukleinsäure-Färbung stäbchen Lösung durch Auflösen von 100 mg Hoechst 33342 Farbstoff in 10 ml Reinstwasser.
        HINWEIS: Die Lagerlösung sollte aliquoted und lichtgeschützt bei -20 °C gelagert werden.
      6. Bereiten Sie eine 0,2-2,0 g/ml Nukleinsäure-Färbungs-Arbeitslösung in PBS vor und inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Nukleinsäure-Färbungsarbeitslösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
      7. Entfernen Sie die Nukleinsäure-Färbung Arbeitslösung und spülen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS für 5 Minuten dreimal. Die Zellen sollten in PBS bei 4 °C aufbewahrt werden, geschützt vor Licht.
    2. Mitochondriale und nukleare Färbeanalyse
      1. Analysieren Sie Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop mit Filtersätzen, die für den Nukleinsäurefleck (Ex/ Em: 361/497 nm) und den mitochondrialen Fleck geeignet sind (Ex/ -Em: 644/665 nm). Finden Sie Zellen durch Nukleinsäure positive Färbung und quantifizieren Zellzahl. Quantifizieren Sie die mitochondriale Fluoreszenzintensität in Mitochondrien.
  4. Morphometrische Messungen (Sphäroidberechnungen) in ImageJ
    1. Exportieren Sie HCA-Images (High Content Analysis) als *.flex-Dateien aus der Columbus-Software. Importieren Sie .flex Dateien als Graustufen in ImageJ mit Bio-Formats Plugin32: Datei > Importieren > Bio-Formate.
    2. Wählen Sie im Fenster Importoptionen Hyperstack-Anzeige aus und aktivieren Sie Kanäle unter Teilen in separate Fenster aufteilen. Diese Option ermöglicht den Zugriff auf alle Dateien in einem bestimmten Kanal (z. B. DAPI, Mitotracker, etc.). Wählen Sie unter Speicherverwaltung nicht virtuellen Stack verwenden aus.
      HINWEIS: Es ist vorzuziehen, DAPI-Kanal als "Staub" in Bildern zu verwenden, da Kulturmedium in UV-Wellenlänge reduziert wird (z. B. 405 nm).
    3. Anpassen der Pixelgröße (Analysieren > Skalierung festlegen), wenn sie nicht gemäß den eingebetteten Werten in der .flex-Datei geladen wurde. Wenden Sie einen Gaussian Blur Filter an, um die Überschreitung von Rauschen zu entfernen und Unregelmäßigkeiten in der Formkontur zu vermeiden. Prozess > Filter > Gaußsche Unschärfe. Ein hoher Sigma-Wert (Radius) zwischen 2,0 und 3,0 ist für die meisten Fälle ideal. Wenn der Stapel über mehrere Bilder verfügt, gelten Sie für alle (wählen Sie Ja im Fenster Prozessstapel).
    4. Generieren Sie ein binäres Bild, um Hintergrund und Organoide (Objekte) mithilfe eines Schwellenwerts zu trennen. Klicken Sie auf Bild > Anpassen > Schwellenwert. Verwenden Sie die rote Maske, um die Werte an die Intensität des Bildes anzupassen, um die Organoidform anzupassen, um die Morphologie intakt zu halten. Deaktivieren Sie den dunklen Hintergrund, wenn das Bild einen weißen Hintergrund hat. Klicken Sie auf Übernehmen.
    5. Wählen Sie im Fenster Stapel in Binär konvertieren die Threshold-Methode aus. Normalerweise werden Standard oder Dreieck bei dieser Art der Bildverarbeitung bevorzugt. Halten Sie den Hintergrund als dunkel. Wählen Sie Schwellenwert für jedes Bild berechnen aus, wenn sich mehrere Bilder im Stapel befinden.
    6. Wählen Sie Prozess > Binär > Löcher füllen. Optional entfernen Sie Bohrungen aus dem Hintergrund. Wählen Sie in Prozess > Binär > Optionen s Schwarze S-Hintergründe aus, und führen Sie Fülllöcher erneut aus. Deaktivieren Sie die Option "Schwarzer Hintergrund", bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
    7. Separate Objekte. Für Organoide ist die Wasserscheidemethode eine gute Wahl. Klicken Sie auf Prozess > Binär > Einzugsgebiet. Führen Sie die Formanalyse aus.
      1. Wählen Sie Analysieren > Messungen festlegen. Es stehen mehrere Optionen zur Verfügung (Details in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Wählen Sie für Organoide Bereich, Mittlerer Grauwert, Min & max Grauwert und Shape-Deskriptoren . Optional wählen Sie Beschriftung anzeigen aus, um Objekte im Bild und in der wissenschaftlichen Notationzu identifizieren. Klicken Sie auf OK.
      2. Wählen Sie Analyse > Partikel analysieren. Wählen Sie die Größen- und Zirkularitätsgrenzen aus. Halten Sie 0-unendlich und 0.00-1.00, um alle Objekte im Bild zu messen. Wählen Sie unter Anzeigen Umrisse aus, damit die Objekte identifiziert werden. Aktivieren Sie die Anzeigeergebnisse, um Ergebnisse auszugeben; An Kanten ausschließen, um Objekte auszuschließen, die Rahmen berühren; Schließen Sie Löcher ein, sodass eventuelle Innenlöcher in den Objekten als Teil der Hauptform betrachtet werden.
    8. Wiederholen Sie die Shape-Analyse für jeden Bildstapel, und die Ergebnisse werden in einer einzelnen Tabelle angehängt. Exportergebnistabelle in Datei > Speichern unter... als .csv-Datei (Comma Separated Values).
  5. Echtzeit-PCR
    1. Extrahieren Sie RNA aus Gewebeäquivalenten unter Verwendung einer monophasischen Lösung von Phenol und Guanidinisothiocyanat, nach den Anweisungen des Herstellers.
    2. Führen Sie die cDNA-Synthese durch reverse Transkription von 1 – 2 g Gesamt-RNA durch.
    3. Verstärken Sie alle Targets mit genspezifischen Primern (Tabelle 5), um quantitative PCR in Echtzeit durchzuführen. Jede qRT-PCR enthält 30 ng reverse-transscribed RNA und 100 nM jedes Primers.
    4. Folgen Sie pcR-Bedingungen: 50 °C für 3 Minuten (1 Zyklus); 95 °C für 5 Minuten (1 Zyklus); 95 °C für 30 Sekunden, 59 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden (35 - 40 Zyklen).
  6. CYP-Assay
    1. Folgen Sie Abschnitt 2.2 für die Leber 2-OC-Montage. Die experimentellen Gruppen sind No-Cell Control, APAP 2'M Behandlungen für 12 h, 24 h und Fahrzeugsteuerung. Folgen Sie den Abschnitten 3.3 und 4.2 für die APAP 2-M-Vorbereitung und -Behandlung.
      HINWEIS: Um sicherzustellen, dass alle Proben gleichzeitig für den CYP-Test bereit sind, beginnen Sie die 12-H-Behandlung 12 Stunden nach Beginn der 24-Stunden-Behandlung. Behandeln Sie die zellfreie Kontrolle der CYP-Aktivität mit 0,5% Ethanollösung sowie die Fahrzeugsteuerung.
    2. 3 mM luminogene Substrat-Lagerlösung bei Raumtemperatur auftauen und eine Verdünnung von 1:1000 in Williams E S. Schutz vor Licht machen.
    3. Sammeln Sie Sphäroide und übertragen Sie jede Versuchsgruppe auf einen Brunnen einer 96-Well-Platte. Entfernen Sie das Medium, waschen Sie es zweimal mit 100 l 1x DPBS und fügen Sie 80 L 3 M Substratlösung pro Bohrgut hinzu. Behalten Sie die no-cell-Kontrolle in Williams E S Medium. Speichern Sie einen Brunnen ohne Sphäroide oder Substratlösung für eine Hintergrundsteuerung. 30-60 min bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten, lichtgeschützt.
    4. Equilibrate lyophilisierte Luciferin Detektion Reagenz (LDR) mit dem Rekonstitutionspuffer mit Esterase. Mischen Sie durch Wirbeln oder Invertieren. Bewahren Sie das angeeignete Volumen bei Raumtemperatur bis zum nächsten Schritt auf.
      HINWEIS: Rekonstituierte LDR kann bei Raumtemperatur für 24 Stunden oder bei 4 °C für 1 Woche ohne Aktivitätsverlust gelagert werden. Für die Langzeitlagerung bei -20 °C lagern.
    5. Übertragen Sie 25 L des überlagerten Überstandes der intakten Sphäriden nach der Inkubation in drei verschiedene Brunnen einer weißen, opaken 96-Well-Mikroplatte. Fügen Sie 25 l LDR pro Brunnen hinzu und homogenisieren.
    6. Inkubieren Sie die weiße Platte bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Lesen Sie die Lumineszenz auf einem Luminometer. Verwenden Sie kein Fluorometer.
    7. Berechnen Sie Nettosignale, indem Sie Hintergrundlumineszenzwerte (No-Cell Control) von den mit Derversuchsmasse behandelten und unbehandelten (Fahrzeugsteuerung) Werten subtrahieren. Berechnen Sie prozentuale Veränderung der CYP3A4-Aktivität, indem Sie die mit dem Netto behandelten Werte durch die unbehandelten Nettowerte dividieren und mit 100 multiplizieren.
  7. Western Blotting
    1. Übertragen Sie die Lebersphäride in ein identifiziertes 1,5 ml Mikrorohr. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie es zweimal mit 100 l 1x DPBS.
    2. Lysatieren Sie die Lebersphäroide in 100 l Zelllyse RIPA Puffer bei 4 °C für 20 min. Zentrifuge für 15 min, 4 °C und 11000 U/min. Übertragen Sie den Überstand auf ein anderes identifiziertes 1,5 ml Mikrorohr.
    3. Quantifizieren Sie die Menge an Protein, die durch die Bradford-Methode gewonnen wird. Laden Sie zwischen 10 und 50 g Protein aus dem quantifizierten Zelllysat pro Bohrung eines Gradienten Polyacrylamid-Gels 3-15% und führen Sie eine SDS-PAGE durch.
    4. Übertragen Sie das geladene Protein aus dem Gel über die halbtrockene Anlageanlage auf eine 0,22 m PVDF-Membran. Verwenden Sie eine Übertragungslösung von 50 mM Tris-HCl und 192 mM Glycin. Stellen Sie die Geräteparameter entsprechend der Anzahl der zu übertragenden Gele ein (1 bis 2 gleichzeitig).
    5. Block unspezifische Wechselwirkungen auf PVDF-Membran mit einer 3-5% Magermilchlösung im TBS-T Puffer: Tris-Buffered Saline (50 mM Tris pH 7.6, 150 mM Natriumchlorid) ergänzt mit 0,1% Tween 20. Halten Sie die Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter sanft konstantem Schütteln.
    6. Mit TBS-T unter sanftem konstantem Schütteln 3-5 min bei Raumtemperatur waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal.
    7. Verdünnen Sie Albumin und Vinculin primäre Antikörper auf 1:1000 bzw. 1:2000 auf TBS-T. Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C unter sanft konstantem Schütteln.
      HINWEIS: Befolgen Sie immer die Anweisungen des Herstellers, um Antikörper zu verdünnen.
    8. Entfernen Sie den primären Antikörper und waschen Sie die Membran 3 Mal (Schritt 6.7.6). ECL Anti-Maus IgG Sekundärantikörper auf 1:5000 auf TBS-T verdünnen. Inkubieren Sie die Membran mit einem sekundären Antikörper unter sanft konstantem Schütteln für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
    9. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Membran (Schritt 6.7.6). Führen Sie den Proteinnachweis mit ECL Western Blotting Substrate durch. Stellen Sie die autoradiografischen Filme für 30 s bis 30 min zur Unterlegen. Führen Sie die Immunoblotting-Erkennung in Dreifacharbeit durch.

Ergebnisse

Um die PK APAP-Tests im 2-OC MPS durchzuführen, besteht der erste Schritt darin, den menschlichen Darm und Leberäquivalente (Organoide) herzustellen. Sie sind in das 2-OC mikrofluidische Gerät(Abbildung 1A) 24 h vor Beginn des PK APAP-Assays integriert. Am nächsten Tag wird das Medium geändert, und das Modell wird APAP ausgesetzt. Abbildung 1 zeigt die Darm- und Leberäquivalente, die sich innerhalb des 2-OC-Geräts (Abbildung 1B

Diskussion

Die genaue und zuverlässige Bewertung der pharmakologischen Eigenschaften von investigativen neuen Arzneimitteln ist entscheidend für die Verringerung des Risikos in den folgenden Entwicklungsschritten. Die MPS ist eine relativ neue Technologie, die darauf abzielt, die Vorhersageleistung zu verbessern und die Kosten und Zeit zu reduzieren, die mit präklinischen Tests verbracht werden. Unsere Gruppe schreitet bei der Bewertung pharmakokinetischer und toxikologischer Eigenschaften voran, die hauptsächlich für die Blei...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Dr. Christie Guguen-Guillouzo, Dr. Philippe Gripon am Referat 522 INSERM und Dr. Christian Trepo am Referat 271 INSERM für den Einsatz des Biologischen Materials (Hepa RG Zellen) und für die bereitstellung für uns, um die akademische Forschung durchzuführen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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