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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Abbiamo esposto un sistema microfisiologico (MPS) con organoidi intestinali e epatici ad acetaminofene (APAP). Questo articolo descrive i metodi per la produzione di organoidi e le valutazioni della proprietà farmacocinetica e tossicologica APAP nelle MPS. Descrive anche le analisi della funzionalità tissutale necessarie per convalidare i risultati.

Abstract

I sistemi microfisiologici (MPS) recentemente introdotti che coltivano organoidi umani dovrebbero funzionare meglio degli animali nella fase di test preclinici del processo di sviluppo dei farmaci perché sono geneticamente umani e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. In questo studio, la barriera intestinale umana (emulata da una co-coltura di cellule Caco-2 e HT-29) e l'equivalente epatico (emulato da sferoidi fatti di cellule EpaRG differenziate e cellule stellate epatiche umane) sono stati integrati in un dispositivo microfluidico a chip a due organi (2-OC) per valutare alcune proprietà farmacocinetiche (APAP) ad acetaminofene (APAP) e tossicologiche. La MPS aveva tre gruppi: intestino solo 2-OC, fegato solo 2-OC, e intestino / fegato 2-OC con lo stesso supporto che permea entrambi gli organoidi. Per le valutazioni della chiave di piattaforma, abbiamo dosato l'APAP nel supporto a punti di tempo preimpostati dopo averli somministrati sopra la barriera intestinale (emulando la via orale) o nel supporto (emulando la via endovenosa), rispettivamente a 12 μM e 2 μM. I campioni di supporto sono stati analizzati mediante cromatografia liquida ad alta pressione in fase invertita (HPLC). Gli organoidi sono stati analizzati per l'espressione genica, per i valori TEER, per l'espressione e l'attività proteica, e quindi raccolti, fissati e sottoposti a una serie di valutazioni morfologiche. La tecnica MTT ha funzionato bene nel valutare la fattibilità organoide, ma le analisi ad alto contenuto (HCA) sono state in grado di rilevare eventi tossici molto presto in risposta al trattamento APAP. Abbiamo verificato che il flusso del supporto non influisce in modo significativo sull'assorbimento apap, mentre migliora significativamente la funzionalità equivalente al fegato. L'assorbimento intestinale umano APAP e il metabolismo epatico potrebbero essere emulati nelle MPS. L'associazione tra i dati delle MPS e la modellazione in silico ha un grande potenziale per migliorare la prevedibilità dei metodi in vitro e fornire una migliore accuratezza rispetto ai modelli animali negli studi farmacocinetici e tossicologici.

Introduzione

A causa delle differenze genomiche e proteomiche, i modelli animali hanno un valore predittivo limitato per diversi risultati umani. Inoltre, sono dispendiosi in termini di tempo, costosi ed eticamente discutibili1. Mps è una tecnologia relativamente nuova che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test precli clinici. Sono dispositivi microfluidi che coltivano organoidi (unità funzionali mimetiche artificiali di organi) sotto flusso mediatico che promuovono la comunicazione organoide-organoide. Gli organoidi composti da cellule umane aumentano la rilevanzatraslizionale 2,3,4. Ci si aspetta che le MPS funzionino meglio dei test sugli animali perché sono geneticamente umane e ricapitolano l'interazione tra i tessuti. Quando è pienamente funzionante, l'MPS fornirà risultati più significativi, a velocità più elevata e costi e rischiinferiori 4. Molti gruppi stanno sviluppando MPS per diversi scopi, in particolare modelli di malattia per testare l'efficacia del farmaco.

Il livello di esposizione è uno dei parametri più critici per valutare l'efficacia e la tossicità delfarmaco 5,6,7,8,9,10,11,12. La MPS consente un'integrazione organoide che emula l'esposizione sistemica e si prevede che funzioni meglio della tradizionale coltura di tessuti umani 2D. Questa tecnologia può migliorare significativamente la previsione dell'assorbimento intestinale composto e del metabolismoepatico 4.

Una MPS che integra un modello equivalente umano di intestino e fegato è un buon punto di partenza, considerando il ruolo centrale di questi due organi nella biodisponibilità del farmaco e nell'esposizionesistemica 13,14,15. APAP è un farmaco attraente per studiare una MPS senza un equivalente renale perché la sua metabolizzazione è fatta principalmente dal fegato16,17.

Il 2-OC è un dispositivo microfluidico a due camere adatto alla coltura di due diversi tessuti/organoidi equivalenti umani interconnessi da microcanali16. Al fine di emulare una somministrazione orale/endovenosa umana in vitro di un farmaco e valutare gli effetti del colloquio incrociato tra l'intestino e gli equivalenti epatici sulla farmacocinetica APAP, oltre alla funzionalità e alla vitalità degli organoidi, sono stati eseguiti tre diversi gruppi di MPS: (1) una "MPS intestino 2-OC" composta da un equivalente intestinale basato in un inserto di coltura contenente una cocoltura di cellule Caco-2 + HT-29, integrata nel dispositivo 2-OC; (2) una "MPS epatica a 2 OC" composta da sferoidi epatici costituiti da HepaRG + HHSteC (Cellule Stellate Epatiche Umane) integrati nel dispositivo 2-OC; e (3) una "MPS intestino/fegato 2-OC" composta dall'equivalente intestinale in un compartimento del dispositivo che comunica con l'equivalente epatico nell'altro dal flusso del fluido attraverso i canali microfluidici.

Tutti i saggi sono stati eseguiti in condizioni statiche (senza flusso) e dinamiche (con flusso) a causa dell'impatto degli stimoli meccanici (compressione, stiramento e taglio) sulla vitalità cellulare e sullefunzionalità 18,19,20. Il presente articolo descrive il protocollo per l'emulazione della somministrazione orale/endovenosa APAP e le rispettive analisi di assorbimento/metabolismo e tossicologiche nelle MPS a 2-OC contenenti modelli equivalenti all'intestino umano e al fegato.

Protocollo

1. Produzione di equivalenti tissutali per la coltivazione nel 2-OC

  1. Produzione equivalente barriera intestino tenue
    1. Mantenere le cellule Caco-2 e HT-29 usando il mezzo equivalente intestino: DMEM integrato con 10% FBS, 1% penicillina e streptomicina, e 1% amminoacidi non essenziali, che è chiamato come "DMEM S" in questo manoscritto.
    2. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,25% di tripina/EDTA per dissociare le cellule Caco-2 coltivate in contenitori di coltura cellulare (175 cm2). Incubare per 5 minuti a 37 °C e interrompere la reazione aggiungendo almeno il doppio volume di inibitore della tripina. Eseguire la stessa procedura per le celle HT-29, regolando i volumi del reagente poiché è necessaria una quantità minore di queste cellule e vengono mantenute in contenitori più piccoli (75 cm2).
    3. Centrifugare a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il supernatante da entrambi i tubi e rimescolare i pellet cellulari in 10 ml di cellule DMEM S. Count, garantendo una vitalità cellulare superiore all'80%. Integrare aseticamente inserti di coltura cellulare in una piastra a 24 porri precedentemente riempita con 400 μL di DMEM S per pozzo nel lato basolaterale (che rappresenta il flusso sanguigno umano).
    4. Co-coltivare cellule Caco-2 e HT-29 con un rapporto di 9:121. Utilizzare 2,25 x 105 Caco-2 e 2,5 x 104 cellule HT-29 per ogni intestino equivalente in un volume finale di 200 μL di DMEM S. Regolare il numero e il volume delle cellule in base al numero desiderato di organoidi. Mescolare con attenzione.
    5. Pipetta 200 μL di soluzione cellulare nel lato apicale di ogni inserto (che rappresenta il lato lume intestinale umano), seminando 250.000 cellule per inserto. Co-coltivare le cellule negli inserti per tre settimane22. Cambiare il mezzo almeno tre volte a settimana, aspirarlo sia dal lato apicale che basolaterale con una pipetta Pasteur sterile, facendo attenzione a non danneggiare la barriera cellulare intatta.
      NOTA: Procedere con l'aspirazione sul lato apicale, in modo da non toccare la barriera cellulare (aspirare supportando la pipetta Pasteur sul bordo di plastica dell'inserto cellulare).
    6. Controllare la stretta formazione monostrato misurando il TEER (resistenza elettrica transepiteliale) ogni tre giorni utilizzando un voltmetro23, secondo le istruzioni del produttore.
      1. Eseguire un vuoto, misurando la resistenza su un inserto di coltura cellulare senza celle, ma con lo stesso mezzo cellulare e nella stessa piastra cellulare.
      2. Calcolare la resistenza dei tessuti sottraendo la resistenza in bianco dalla resistenza equivalente al tessuto e moltiplicare per l'area superficiale effettiva della membrana filtrante (0,6 cm2). Una buona resistenza alla barriera intestinale è in un intervallo da 150 a 400 Ω-cm2.
        NOTA: Dopo 21 giorni le cellule devono essere completamente differenziate e la barriera intestinale formata, quindi gli equivalenti intestinali sono pronti per essere integrati nelle MPS.
  2. Produzione di equivalenti epatici
    1. Mantenere le cellule HepaRG utilizzando il mezzo equivalente epatico, che è il Medium E di William integrato con il 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, 100 unità / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 5 μg / mL insulina umana e 5 x 10-5 M idrocortisone, ed è chiamato "Williams E S" in questo manoscritto. Rinnovare i supporti HepaRG ogni 2-3 giorni e mantenere la coltura cellulare per due settimane per iniziare la differenziazione in epatociti e conlangiociti.
    2. Dopo le prime due settimane, aggiungere il 2% di DMSO al mezzo heparg per altre due settimane per completare la differenziazionecellulare 24,25. Far crescere HHSTeC in Stellate Cell Media (SteC CM), utilizzando contenitori di coltura cellulare rivestiti in poli-L-lisina, cambiando i supporti ogni due o tre giorni.
    3. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 1x DPBS e aggiungere 8 mL dello 0,05% di tripina/EDTA, per dissociare le cellule HepaRG coltivate in contenitori di coltura cellulare (175 cm2). Incubare per 5-10 min a 37 °C e interrompere la reazione aggiungendo almeno il doppio del volume di inibitore della tripside. Eseguire lo stesso per HHSTeC, adattando il volume del reagente poiché è necessaria una quantità minore di queste cellule e possono essere mantenute in contenitori più piccoli (75 cm2).
    4. Centrifugare entrambi a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il supernatante e rimescolare il pellet cellulare nel mezzo Williams E S. Contare le cellule, assicurando una vitalità cellulare superiore all'80%.
    5. Generare gli sferoidi epatici combinando cellule HepaRG e HHSTeC ad un rapporto di 24:1, rispettivamente, in Williams E S medium16. Aggiungere 4,8 x 104 HepaRG differenziato e 0,2 x10 4 HHSTeC per comporre ogni sferoide epatico di 50.000 cellule, in un volume di 80 μL. Regolare il numero e il volume delle cellule in base al numero desiderato di sferoidi. Mescolare con attenzione.
    6. Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 80 μL del pool di celle combinate in ogni pozzo di 384 micropiatte sferoidi, che ha una geometria rotonda ben inferiore.
      NOTA: Dopo quattro giorni si formano sferoidi di circa 300 μm.
    7. Utilizzando punte a foro largo, trasferire gli sferoidi epatici su piastre di 6 potte ad attacco ultra-basso, il che consente il conteggio "uno per uno" richiesto.

2. Integrazione di equivalenti intestini e epatici in una MPS a 2 OC

  1. Assemblaggio mps intestino 2-OC per test di assorbimento
    1. Pipetta 500 μL di DMEM S nel compartimento più grande di 2-OC e 300 μL in quello più piccolo. Aspirare i mezzi basolaterali e apicali di ogni barriera intestinale equivalente nelle 24 piastre del pozzo. Utilizzando forcep sterili, integrare un inserto per circuito 2-OC, in particolare nel vano più grande. Applicare 200 μL del mezzo intestino sul lato apicale.
      NOTA: Evitare la formazione di bolle quando si integrano gli organoidi nelle MPS.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
  2. Assemblaggio di MPS epatiche a 2-OC per il test del metabolismo
    1. Pipetta 650 μL di Williams E S nel grande compartimento e 350 μL nel compartimento più piccolo, che riceverà gli sferoidi. Nelle piastre a fissaggio ultra-basso 6 pondo, contare gli sferoidi utilizzando punte a foro largo. Ogni equivalente epatico è composto da venti sferoidi26. Integrare venti equivalenti epatici per circuito, utilizzando punte a foro largo, che consentono il trasferimento solo di organoidi, nel compartimento più piccolo di un 2-OC.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
  3. Assemblaggio mps intestino/fegato 2-OC per assorbimento e dosaggio del metabolismo
    1. Unire i due mezzi (intestino e fegato) in proporzione 1:4, il che significa 200 μL di DMEM S nel lato apicale intestinale e 800 μL di Williams E S nel lato basolaterale. Integrare l'intestino e gli equivalenti epatici, contemporaneamente, nel 2-OC.
    2. Collegare l'MPS alla centralina, che deve essere collegata a un alimentatore d'aria pressurizzato. Impostare i parametri: una pressione di circa ±300 bar e una frequenza di pompaggio di 0,3 Hz. Avviare il flusso 24 ore prima della somministrazione della sostanza in esame. Il giorno successivo, eseguire il trattamento APAP.
      NOTA: Per tutti gli esperimenti, eseguire ogni punto di tempo in triplice copia, il che significa tre circuiti 2-OC separati (cioè dispositivi 1 e 1/2 2-OC). Il volume totale di ogni circuiti 2-OC è di 1 mL.

3. Preparazione dell'acetaminofene (APAP)

  1. Preparare la soluzione stock APAP, sciogliendo l'APAP in etanolo assoluto. Il giorno dell'esperimento, diluire l'APAP nel rispettivo mezzo (soluzione APAP), ad una concentrazione di 12 μM per la "somministrazione orale" e 2 μM per la "somministrazione endovenosa".
  2. Assicurarsi che la concentrazione finale di etanolo nella soluzione di controllo e trattamento del veicolo sia dello 0,5% per entrambe le amministrazioni. Per il controllo positivo (APAP da 100 mM), la concentrazione di etanolo è del 2%.

4. Somministrazione di sostanze di prova e campionamento dei supporti

  1. Somministrazione "orale" APAP e campionamento dei supporti
    1. Aspirare il mezzo basolaterale e apicale di ogni barriera intestinale equivalente nella Pipetta 2-OC.
    2. Verificare la presenza di bolle e procedere con il trattamento equivalente barriera intestinale con la sostanza in esame nel lato apicico, emulando la somministrazione orale. Emulare la somministrazione "orale" APAP aggiungendo 200 μL di una soluzione APAP da 12 μM sul lato apicale degli inserti di coltura intestinale, che rappresenta il "lato lume" intestinale (Figura 1B). Collegare l'MPS all'unità di controllo.
    3. Raccogliere il volume totale da lati apicali e da lati basolaterali nei seguenti punti temporali: 0 h, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h e 24 h15,27. Eseguire tutti gli esperimenti in triplice copia, in condizioni statiche e dinamiche, e raccogliere ogni campione, di ogni triplice copia, in un microtubo separato. Analizzare i campioni utilizzando HPLC/UV.
      NOTA: Separare campioni apicali e basolaterali.
  2. Amministrazione "endovenosa" APAP e campionamento dei supporti
    1. Emulare la via "endovenosa" somministrando 2 μM di soluzione APAP direttamente nel compartimento epatico. Aspirare tutto il contenuto medio 2-OC. Pipetta 650 μL di Williams E S contenente la sostanza in esame nel grande compartimento e 350 μL dello stesso supporto nel compartimento più piccolo che contiene i 20 sferoidi. Raccogli tutti i volumi nei seguenti punti di tempo: 0 h, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 6 h, 12 h e 24 h27,28.
    2. Eseguire tutti gli esperimenti in triplice copia, in condizioni statiche e dinamiche. Raccogliere ogni campione, di ogni triplice copia, in un microtubo separato. Analizzare i campioni utilizzando HPLC/UV.

5. Strumentazione e condizioni cromatografiche

  1. Analisi HPLC
    1. Impostare tutti i parametri rilevanti per l'analisi HPLC in base alla tabella 1.
    2. Filtrare la fase mobile attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm sotto vuoto. Filtrare i campioni attraverso un filtro siringa PVDF di dimensioni dei pori da 0,22 μm (diametro 13 mm) e conservarli in un flaconcino. Avviare la misurazione.
  2. Soluzioni stock, standard di calibrazione e campioni di controllo qualità (QC)
    1. Preparare 10 mM di soluzioni stock APAP in tampone di acetato di ammonio (100 mM, pH 6,8) e diluire ulteriormente con i supporti di coltura cellulare DMEM S e Williams E S diluiti con tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) per ottenere le soluzioni di lavoro che vanno da 0,25 a 100,00 μM.
    2. Includere una serie di campioni di calibrazione in triplice copia e campioni di controllo qualità a quattro livelli in triplice copia. Preparare questi standard per diluizione seriale.
    3. Creare curve di calibrazione delle aree di picco APAP rispetto alle concentrazioni standard nominali APAP. Determinare l'adattamento di regressione lineare per ogni curva di calibrazione. Valutare la bontà di adattamento di vari modelli di calibrazione mediante ispezione visiva, coefficiente di correlazione, precisione intra-e tra-run e valori di precisione.
    4. Iniettare campioni vuoti di supporti DMEM S e Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) in sextuplicate. Preparare triplicati di campioni di controllo qualità nei supporti DMEM S e Williams E S diluiti con tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) per le concentrazioni APAP di 0,50 (LOQ), 4,50, 45,00 e 90,00 μM.
    5. Assicurarsi che i campioni di controllo qualità siano preparati da una nuova soluzione stock, diversa da quella utilizzata per generare una curva standard. Utilizzare campioni di controllo qualità per analizzare le variazioni all'interno e all'interno dell'esecuzione.
  3. Procedure di convalida
    1. Eseguire la convalida del metodo bioanalitico seguendo le procedure precedentementeriportate 29,30. Eseguire le esecuzioni cromatografiche in cinque o sei occasioni separate, considerando rispettivamente i supporti di coltura cellulare Williams E S e DMEM S.
    2. Assicurarsi che i punti di calibrazione che vanno da 0,25 a 100,00 μM di APAP, nei supporti di coltura cellulare DMEM S o Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v), siano tracciati in base alle aree di picco dell'APAP (asse y) rispetto alle rispettive concentrazioni nominali (asse x). Confrontare le pendenze di queste curve di taratura standard con i pendii della curva di calibrazione preparati in tampone di acetato di ammonio. Assicurarsi che tutte le curve di calibrazione abbiano un valore di correlazione di almeno 0,998.
    3. Determinare la precisione e la precisione (intra e inter-run) per l'alita nella matrice surrogata utilizzando repliche a quattro diversi livelli LLOQ, controllo basso, medio e di alta qualità in cinque o sei giorni diversi. Eseguire misurazioni di precisione e precisione intra-run lo stesso giorno nei supporti di coltura cellulare DMEM S o Williams E S diluiti in tampone di acetato di ammonio (1:1, v/v) contenente concentrazioni APAP 0,50, 4,50, 45,00 e 90,00 μM (n= 3).
    4. Valutare ogni serie di campioni di controllo qualità contenenti le concentrazioni apap delle curve di calibrazione ottenute di recente. Testare la selettività dei saggi per il grado di separazione del composto di interesse e possibili altri picchi cromatografici causati da componenti interferenti.
  4. Limite inferiore di quantificazione (LLOQ) e limite di rivelazione (LOD)
    1. Determinare il limite inferiore di quantificazione (LLOQ) in base alla deviazione standard della risposta e all'approccio di pendenza. Calcolare utilizzando la formula 10α/S, dove α è la deviazione standard di y-intercept e S è la pendenza della linea retta ottenuta tracciando le curve dicalibrazione 29,30. Stimare il limite di rilevamento (LOD) tenendo conto 3,3 volte la deviazione standard del pezzo grezzo, diviso per la pendenza della curva dicalibrazione 29,30.

6. Vitalità/funzionalità equivalenti dei tessuti

  1. Mtt
    1. Eseguire un test MTT per valutare la fattibilità organoide in tutti i punti di tempo del saggio MPS. Come controllo negativo, usa i supporti cellulari più il veicolo. Come controllo positivo, trattare gli organoidi con APAP da 100 mM e NaOH all'1% diluito in mezzo cellulare.
    2. Trasferire i 20 sferoidi di ogni replica per singoli pozzi in una piastra di 96 pozza, e gli inserti di coltura cellulare, contenenti gli equivalenti intestinali, a 24 piastre ben cellulari, posizionando un intestino equivalente per pozzo. Lavare gli equivalenti tissutali tre volte con 1x DPBS.
    3. Aggiungere 300 μL di una soluzione di MTT da 1 mg/mL, diluita nel rispettivo mezzo cellulare, per pozzo. Incubare le piastre per 3 ore in condizioni standard di coltura cellulare.
    4. Rimuovere la soluzione MTT da ogni pozzo con attenzione tubazione. Estrarre MTT formazan dall'intestino e equivalenti epatici utilizzando 200 μL di isopropanolo per pozzo durante la notte a 4 °C.
      NOTA: Sigillare il coperchio per evitare l'evaporazione.
    5. Trasferire 200 μL di ogni supernatante al rispettivo pozzo pre-identificato in una piastra di prova micro di 96 po' . Utilizzare isopropanolo come vuoto.
    6. Leggi l'assorbanza formazan in un lettore di lastre a 570 nm. Calcolare la capacità relativa delle celle di ridurre l'MTT (%) utilizzando la densità ottica media di ogni punto di tempo, rispetto al controllo negativo, considerato come vitalità cellulare al 100%.
  2. Citochimica/Istologia
    1. Fissare l'intestino e gli equivalenti epatici, per 25 minuti a temperatura ambiente, utilizzando il 4% (w/v) di paraformaldeide in tampone fosfato-salina da 0,1 M, pH 7,4. Lavare gli organoidi 5 volte in tampone PBS per 10 minuti ogni volta. Macchiare gli equivalenti intestinali e epatici con isotiocianato-felloidina tetrametillrodamina o Alexa Fluor 647 phalloidin, 1:50 in PBS31.
    2. Trasferirli sul mezzo di congelamento OCT per alcuni minuti per acclimatarli a RT prima di trasferirli in azoto liquido fino al congelamento completo. Eseguire criosezioni di sferoidi epatici spessi circa 10-12 μm, usando un criostato.
    3. Montare le sezioni dei tessuti in mezzo di montaggio con DAPI. Esaminarli con microscopia a fluorescenza confocale.
    4. Congelare gli organoidi dopo la fissazione per eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina secondo i protocolli stabiliti. Montare le diapositive con il supporto di montaggio dopo aver affettato il tessuto come descritto sopra e scattare immagini istologiche utilizzando un microscopio ottico.
  3. Analisi ad alto contenuto
    1. Colorazione mitocondriale e nucleare delle cellule
      1. Ricostituire la polvere liofilizzata in DMSO per creare una soluzione di brodo di colorazione mitocondriale da 1 mM (ad esempio, MitoTracker Deep Red FM). Conservare la soluzione di magazzino aliquota a -20 °C protetta dalla luce. Diluire la soluzione di 1 mM di materiale di colorazione mitocondriale alla concentrazione finale (200 nM) nel mezzo di coltura tissutale prebellica (37 °C) senza siero.
      2. Rimuovere il supporto delle impostazioni cultura delle celle. Aggiungere la soluzione di colorazione mitocondriale per coprire completamente il campione e incubare le cellule per 15-45 min a 37 °C in atmosfera umidificata con 5% di CO2.
      3. Rimuovere con cura la soluzione di lavoro di colorazione mitocondriale e sostituirla con il 2-4% di paraformaldeide fissante in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente.
      4. Risciacquare delicatamente le cellule fisse con PBS per 5 minuti. Ripetere il processo di lavaggio due volte.
      5. Preparare una soluzione di 10 mg/mL (16,23 M) per la colorazione dell'acido nucleico sciogliendo 100 mg di colorante Hoechst 33342 in 10 mL di acqua ultrapura.
        NOTA: La soluzione stock deve essere aliquota e conservata protetta dalla luce a -20 °C.
      6. Preparare una soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico 0,2-2,0 μg/mL in PBS e incubare le cellule fissazionate con soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico per 10 minuti a temperatura ambiente.
      7. Rimuovere la soluzione di lavoro di colorazione dell'acido nucleico e sciacquare delicatamente le cellule con PBS per 5 minuti tre volte. Le cellule devono essere conservate in PBS a 4 °C, protette dalla luce.
    2. Analisi della colorazione mitocondriale e nucleare
      1. Analizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza con set di filtri appropriati per la macchia di acido nucleico (λEx/ λEm: 361/497 nm) e la macchia mitocondriale (λEx/ λEm: 644/665 nm). Trovare le cellule per colorazione positiva dell'acido nucleico e quantificare il numero di cellule. Quantificare l'intensità della fluorescenza della macchia mitocondriale nei mitocondri.
  4. Misurazioni morfometriche (calcoli di sferoidi) in ImageJ
    1. Esportare immagini HCA (High Content Analysis) come file *.flex dal software Columbus. Importare file flex come scala di grigi in ImageJ utilizzando il plug-in Bio-Formats32: File > Importa > Biosi formati.
    2. Nella finestra Opzioni importazione selezionare Visualizzazione Hyperstack e abilitare Dividi canali in Dividi in finestre separate. Questa opzione consentirà l'accesso a tutti i file in un particolare canale (ad esempio, DAPI, mitotracker, ecc.). Non selezionare Usa stack virtuale in Gestione memoria.
      NOTA: È preferibile utilizzare il canale DAPI come "polvere" nelle immagini poiché il mezzo di coltura è ridotto nella lunghezza d'onda UV (ad esempio, 405 nm).
    3. Regolare la dimensione dei pixel( Analyze > Impostascala ) se non è stata caricata in base ai valori incorporati nel file flex. Applicare un filtro Sfocatura gaussiana per rimuovere l'eccesso di rumore ed evitare irregolarità nel contorno della forma. Processo > Filtri > Sfocatura gaussiana. Un valore elevato di Sigma (raggio) compreso tra 2,0 e 3,0 è ideale per la maggior parte dei casi. Se lo stack ha più immagini, applicatele a tutte (selezionate Sì nella finestra Stack processo).
    4. Generare un'immagine binaria per separare lo sfondo e gli organoidi (oggetti) utilizzando una soglia. Fare clic su Immagine > Regola > Soglia. Utilizzare la maschera rossa per regolare i valori in base all'intensità dell'immagine, per adattarsi alla forma organoide, mantenendo intatta la morfologia. Disabilitare lo sfondo scuro se l'immagine ha uno sfondo bianco. Fare clic su Applica.
    5. Nella finestra Converti stack in binario scegliere il metodo Threshold. Di solito, Default o Triangle sono preferiti in questo tipo di elaborazione delle immagini. Mantenere lo sfondo scuro . Selezionare Calcola soglia per ogni immagine se nello stack sono disponibili più immagini.
    6. Selezionate Processo (Process) > Binario (Binary) > Riempi fori (Fill holes). Facoltativamente, rimuovere i fori dallo sfondo. In Processo (Process) > Binario (Binary) > Opzione (Options), selezionate Sfondo nero (Black background) ed eseguite nuovamente Fill Holes. Disattivare l'opzione Sfondo nero prima di procedere al passaggio successivo.
    7. Oggetti separati. Per gli organoidi, il metodo spartiacque è una buona scelta. Selezionate Processo (Process) > Binario (Binary) > Spartiacque (Watershed). Eseguire l'analisi della forma.
      1. Selezionare Analizza > Imposta misure. Sono disponibili diverse opzioni (dettagli in https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Per gli organoidi, selezionare Area, Valore grigiomedio , Valore grigio minimo e massimo e Descrittori forma. Facoltativamente, selezionare Visualizza etichetta per identificare gli oggetti nell'immagine e Notazione scientifica. Fare clic su OK.
      2. Selezionate Analisi (Analysis) > Analizza particelle (Analyze Particles). Scegliete i limiti Dimensioni e Circolarità. Mantieni rispettivamente 0-infinito e 0,00-1,00 per misurare tutti gli oggetti nell'immagine. In Mostrascegliere Contorni in modo che gli oggetti siano identificati. Abilitare i risultati di visualizzazione per l'output dei risultati; Escludere sui bordi per escludere gli oggetti che toccano i bordi; Includere fori in modo che eventuali fori interni negli oggetti siano considerati parte della forma principale.
    8. Ripetere l'analisi delle forme per ogni stack di immagini e i risultati verranno aggiunti in un'unica tabella. Esportare la tabella dei risultati nel file > Salva con nome... come file .csv(comma separated values).
  5. PCR in tempo reale
    1. Estrarre l'RNA dagli equivalenti tissutali utilizzando una soluzione monofasica di fenolo e isotiocianato di guanidina, seguendo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire la sintesi cDNA per trascrizione inversa di 1 - 2 μg di RNA totale.
    3. Amplificare tutti gli obiettivi utilizzando primer specifici del gene (Tabella 5) per eseguire PCR quantitativi in tempo reale. Ogni qRT-PCR contiene 30 ng di RNA trascritto inversamente e 100 nM di ogni primer.
    4. Seguire le condizioni PCR: 50 °C per 3 minuti (1 ciclo); 95 °C per 5 minuti (1 ciclo); 95 °C per 30 secondi, 59 °C per 45 secondi e 72 °C per 45 secondi (35 - 40 cicli).
  6. Saggio CYP
    1. Seguire la sezione 2.2 per l'assemblaggio epatico 2-OC. I gruppi sperimentali sono il controllo no-cell, i trattamenti APAP 2 μM per 12 h, 24 ore e il controllo del veicolo. Seguire le sezioni 3.3 e 4.2 per la preparazione e il trattamento APAP 2 μM.
      NOTA: Per assicurarsi che tutti i campioni siano pronti contemporaneamente per il test CYP, iniziare il trattamento di 12 ore 12 ore dopo l'inizio del trattamento di 24 ore. Trattare il controllo no-cell dell'attività CYP con una soluzione di etanolo dello 0,5%, nonché il controllo del veicolo.
    2. Scongelare la soluzione di substrato luminogenico da 3 mM a temperatura ambiente e effettuare una diluizione 1:1000 in E S. Protect from light di William.
    3. Raccogli gli sferoidi e trasferisci ogni gruppo sperimentale in un pozzo di una piastra da 96 po '. Rimuovere il mezzo, lavare due volte con 100 μL di 1x DPBS e aggiungere 80 μL di soluzione di substrato 3 μM per pozzo. Mantieni il controllo senza cellule nel mezzo E S di William. Salvare un pozzo senza sferoidi o soluzione di substrato per un controllo dello sfondo. Incubare per 30-60 min a 37 °C con 5% CO2,protetto dalla luce.
    4. Equilibrare il reagente di rilevamento della luciferina liofilizzato (LDR) utilizzando il buffer di ricostituzione con esterase. Mescolare ruotando o invertendo. Conservare il volume appropriato a temperatura ambiente fino al passaggio successivo.
      NOTA: LDR ricostituito può essere conservato a temperatura ambiente per 24 ore o a 4 °C per 1 settimana senza perdita di attività. Per lo stoccaggio a lungo termine, conservare a -20 °C.
    5. Trasferire 25 μL di supernatante intatto degli sferoidi in tre diversi pozzi di una micropiatta bianca opaca da 96 po' , dopo l'incubazione. Aggiungere 25 μL di LDR per pozzo e omogeneizzare.
    6. Incubare la piastra bianca a temperatura ambiente per 20 minuti. Leggi la luminescenza su un luminometro. Non usare un fluorometro.
    7. Calcola i segnali netti sottraendo i valori di luminescenza di fondo (controllo senza cella) dai valori del composto di prova trattato e non trattato (controllo del veicolo). Calcolare la variazione percentuale dell'attività CYP3A4 dividendo i valori netti trattati per i valori netti non trattati e moltiplicando per 100.
  7. Gonfiore occidentale
    1. Trasferire gli sferoidi epatici su un microtubo identificato da 1,5 mL. Rimuovere il mezzo e lavare due volte con 100 μL di 1x DPBS.
    2. Llysate gli sferoidi epatici in 100 μL di tampone RIPA di lysis cellulare a 4 °C per 20 min. Centrifuga per 15 min, 4 °C e 11000 giri/min. Trasferire il supernatante su un altro microtubo identificato da 1,5 mL.
    3. Quantificare la quantità di proteine ottenute attraverso il metodo di Bradford. Caricare tra i 10 e i 50 μg di proteine dal lysato cellulare quantificato per pozzo di un gel di poliacrilammide gradiente 3-15% ed eseguire un SDS-PAGE.
    4. Trasferire la proteina caricata dal gel a una membrana PVDF da 0,22 μm attraverso l'apparecchiatura del sistema semi-secco. Utilizzare una soluzione di transfernza di 50 mM Tris-HCl e 192 mM di glicina. Impostare i parametri dell'apparecchiatura in base al numero di gel da trasferire (da 1 a 2 alla volta).
    5. Blocca le interazioni non specifiche sulla membrana PVDF con una soluzione di latte scremato al 3-5% nel tampone TBS-T: Salina tris-tamponata (50 mM Tris pH 7,6, cloruro di sodio da 150 mM) integrata con lo 0,1% di Tween 20. Mantenere la membrana sotto agitazione delicatamente costante per 1 ora a temperatura ambiente.
    6. Lavare con TBS-T sotto agitazione delicatamente costante per 3-5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
    7. Diluire gli anticorpi primari di albumina e vinculina rispettivamente a 1:1000 e 1:2000 su TBS-T. Incubare la membrana con anticorpi primari durante la notte a 4 °C, sotto tremori delicatamente costanti.
      NOTA: Seguire sempre le istruzioni del produttore per diluire gli anticorpi.
    8. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare la membrana 3 volte (fase 6.7.6). Diluire l'anticorpo secondario IgG anti-topo ECL a 1:5000 su TBS-T. Incubare la membrana con un anticorpo secondario sotto scuotimento delicatamente costante per 2 ore a temperatura ambiente.
    9. Rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la membrana (fase 6.7.6). Eseguire il rilevamento delle proteine utilizzando ECL Western Blotting Substrate. Esporre i film autoradiografici da 30 a 30 minuti. Eseguire il rilevamento dell'immunoblotting in triplice copia.

Risultati

Per eseguire i test PK APAP nelle MPS a 2-OC, il primo passo è produrre l'intestino umano e gli equivalenti epatici (organoidi). Sono integrati nel dispositivo microfluidico 2-OC (Figura 1A) 24 ore prima dell'inizio del test APAP PK. Il giorno successivo, il supporto viene modificato e il modello viene esposto all'APAP. La figura 1 illustra gli equivalenti intestinali e epatici collocati all'interno del dispositivo 2-OC (Figura 1B)...

Discussione

La valutazione accurata e affidabile delle proprietà farmacologiche dei nuovi farmaci investigativi è fondamentale per ridurre il rischio nelle seguenti fasi di sviluppo. L'MPS è una tecnologia relativamente nuova, che mira a migliorare la potenza predittiva e ridurre i costi e il tempo trascorso con i test preclinici. Il nostro gruppo sta avanzando nella valutazione delle proprietà farmacocinetiche e tossicologiche per lo più necessarie per l'ottimizzazione del piombo. Abbiamo lavorato con il dispositivo microfluid...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Grazie alla Dott.ssa Christie Guguen-Guillouzo, al Dott. Philippe Gripon dell'Unità 522 INSERM e al Dott. Christian Trepo dell'Unità 271 INSERM per l'utilizzo del Materiale Biologico (Cellule Hepa RG) e per averci messo a disposizione per svolgere la ricerca accademica.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1x DPBSThermo Fisher Scientific14190235No calcium, no magnesium
2-OCTissUse GmbHTwo-organ chip
384-well Spheroid MicroplateCorning3830Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment
4% ParaformaldehydeUse to fix cell
AcetaminophenSigma AldrichA7085Use to MPS assays
AcetonitrileTediaUsed to perform HPLC
Alexa Fluor 647 phalloidinThermo Fisher Scientificconfocal experiment
Ammonium acetateSigma AldrichUsed to perform HPLC
Caco-2 cellsSigma Aldrich86010202
Cacodylate buffer
Cell culture flasksSarstedt
Confocal Fluorescence microscopeLeicaDMI6000
CryostatLeicaCM1950
DMEM high glucoseThermo Fisher Scientific12800017Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids
DMSOSigma AldrichD4540Add 2% to HepaRG media
EthanolSynth
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific12657029
Freezing medium OCTTissue-TekTissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below.
Hematoxylin & Eosin
HepaRG cellsBiopredic InternationalHPR101Undifferentiated cells
HHSTeCScienCell Research Laboratories5300Cells and all culture supplements
Hoechst 33342HCA experiments
HT-29 cellsSigma Aldrich85061109
Human InsulinInvitrogen - Thermo Fisher Scientific12585014
HydrocortisoneSigma AldrichH0888
IsopropanolMerck278475
Karnovsky’s fixative
L-glutamineThermo Fisher ScientificA2916801
Luna C18 guard column SSPhenomenexUsed to perform HPLC
MicroscopeLeicaDMi4000
MicrotomeLeicaRM2245
Millicell 0.4 µm pore size insertsMerckPIHP01250
Millicell ERS-2 meterMerckMERS00002Used to TEER measurement
MitoTracker Deep RedHCA experiments
MTTThermo Fisher ScientificM6494
MX3000P systemAgilent Technologies
Neubauer chamberCounting cells
Operetta High Content Imaging SystemPerkin ElmerUsed to perform HCA
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPAPromegaCat.# V9001
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific15070063Cell culture
PermountThermo Fisher ScientificHistology
PrimersRT-qPCR
PVDF membraneBioRad
PVDF Syringe filter0.22 μm pore size
Reversed-phase Luna C18 columnPhenomenexUsed to perform HPLC
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax)IKA Works GmbH & Co2819000Used for spheroids to improve MTT assay
Stellate Cell Media (STeC CM)ScienCell5301Add STeC CM supplements
SuperScriptIITM Reverse TranscriptaseThermo Fisher Scientific
SYBR Green PCR Master MixThermo Fisher Scientific
TRizol TM reagentThermo Fisher ScientificTrizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate.
Trypsin/EDTA solutionThermo Fisher ScientificR001100
Ultra-low-attachment platesCorningCLS3471-24EA6 wells
Vectashield plus DAPI mounting media
White Opaque 96-well MicroplatePerkinHelmer
Wide-bore tips
Williams EPan BiotechP04-29510Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin

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