אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Summary

ההשפעות של מעכבי migrastatic על הגירה התאים של סרטן glioma בתלת מימדי (3D) הפלישה אומר באמצעות המעכב deacetylase (HDAC) מתאפיין במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה.

Abstract

גילוי ופיתוח של תרופות בחקר הסרטן הוא יותר ויותר מבוסס על מסכי הסמים בפורמט 3D. מעכבי הרומן מיקוד הפוטנציאל הנדידה פולשנית של תאים סרטניים, וכתוצאה מכך התפשטות גרורתית של המחלה, מתגלים ונחשבים טיפולים משלימים סרטן פולשני מאוד כגון gliomas. לכן, יצירת נתונים המאפשרים ניתוחים מפורטים של תאים בסביבה תלת-ממדית לאחר הוספת תרופה נדרשת. המתודולוגיה מתוארת כאן, שילוב של הפלישה ספרואיד מספר עם לכידת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח נתונים על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ (CLSM), מאפשר אפיון מפורט של ההשפעות של מעכבי נגד נדידה הפוטנציאלי MI-192 על תאים glioma. Spheroids נוצרו קווי התא עבור בחני פלישה אומר ב מחסיד נמוך 96-טוב צלחות ולאחר מכן מוכן ניתוח clsm. זרימת העבודה המתוארת הייתה מועדפת על-ידי שימוש נפוץ אחרים ביצירת שיטות הייצור הנפוצות בשל הקלות והתוכסות. זה, בשילוב עם רזולוציית תמונה משופרת מושגת על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד לעומת גישות רגילות שדה רחב, איפשר זיהוי וניתוח של שינויים מורפולוגיים ברורים בתאי נדידה בסביבה תלת-ממדית לאחר טיפול עם התרופה migrastatic MI-192.

Introduction

שלוש טכנולוגיות ספרואיד ממדיות לגילוי תרופות טרום-קליניות ופיתוח תרופות לסרטן פוטנציאליות הן יותר ויותר להיות המועדף על מסכי סמים קונבנציונליים; כך, יש יותר פיתוח של migrastatic-הגירה ומניעת פלישה-סמים. הרציונל מאחורי ההתפתחויות האלה בטיפול בסרטן הם ברורים: 3d ספרואיד בחני מייצגים גישה מציאותית יותר לסינון תרופות נגד סרטן פוטנציאלי כפי שהם מחקים אדריכלות הגידול 3d בנאמנות יותר מאשר התרבויות התא דופלקס, באופן מדויק יותר, ולאפשר אפיון של פעילות התרופות בהגדרה הקשורה לגידול. בנוסף, עליית ההתנגדות לתרופות כימוחלות בסוגים רבים של סרטן ושיעורי מוות גבוה בקרב חולי סרטן בשל הפוטנציאל גרורות על ידי היכולת של תאים סרטניים להגר לאתרי גידול מרחוק תומך הכללה של סוכני כימותרפיות מיקוד הפוטנציאל הנדידה של תאים סרטניים כמו הטיפול שדון בעתיד סרטן קליני ניסויים¹. זה במיוחד המקרה של סרטן פולשני מאוד, כגון glioblastomas בדרגה גבוהה (GBM). ניהול GBM כולל ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה. עם זאת, גם עם טיפול משולב, רוב המטופלים מתדרדרות בתוך שנה 1 של אבחנה ראשונית עם הישרדות חציון של 11-15 חודשים^2,3. התקדמות אדירה בתחום הטכנולוגיה 3D נעשו בשנים האחרונות: מערכות מיקרו, מבנים מפוברק ו 3D פיגומים, ומוסר הפרט השני הם השתפרו ללא הרף כדי לאפשר בדיקות שגרתיות בקנה מידה גדול^{4, 5,6,7}. עם זאת, התוצאות שהתקבלו משיטות אלה חייבות להיות מנותח באופן משמעותי משום שפענוח הנתונים מפריע לעתים קרובות על-ידי ניסיונות לנתח נתונים שנוצרו על-ידי 3D עם מערכות ניתוח תמונה דו-ממדית.

למרות היותו עדיף במונחים של מהירות רכישת תמונה והפחתת רעילות התמונה, רוב מערכות השדה הרחב נשארות מוגבלות על ידי רזולוציה⁸. לפיכך, מלבד מידע לקריאה הקשורות ליעילות הסמים, השפעות מפורטות של פעולת התרופה על מבנים סלולריים תלת-ממדיים של תאים הגירה יאבדו באופן בלתי נמנע אם התמונה באמצעות מערכת שטח רחב. לעומת זאת, מיקרוסקופ לייזר קונפוקלית וקד (clsm) לוכדת באיכות גבוהה, תמונות מנות בצורה אופטית שניתן לשחזור ומעובד ב-3d לאחר הרכישה באמצעות תוכנת מחשב. כך, CLSM ישימה בקלות על הדמיה מורכבים 3D מבנים סלולריים, ובכך מאפשר חקירה של ההשפעות של מעכבי anti-migrastatic על מבנים תלת-ממד וניתוחים מעמיק של מנגנוני הגירה התא. זה ללא ספק ידריך בעתיד migrastatic התפתחות התרופה. כאן, מתוארת זרימת עבודה משולבת של דור כדורי, טיפול בתרופות, כתמים ואפיון על-ידי מיקרוסקופ קונטואיד ברזולוציה גבוהה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הדור של הספרואידים תא

היום הראשון

1. הכן את מדיום התרבות הסטנדרטית כנדרש על-ידי קו התא תחת חקירה.
2. בצע את כל תרבות הרקמה הקשורים שלבים במכסה של תרבות הרקמה באמצעות טכניקות טיפול סטרילי.
3. טריזיסיזציה וספירת תאים סרטניים. השתמש ב-20 מ ל של השעיית תאים לכל צלחת. לשמור את השעיות התא בתווית בבירור צינורות אוניברסלי סטרילי.
4. הוסף מספר מוגדר מראש של תאים לכל באר. הן המספר ההתחלתי של תאים וגודל ספרואיד האולטימטיבי נדרש תלוי בקצב ההתפשטות של קו התא שנחקר.
   הערה: עבור הוקמה קווי התאים glioma כגון U251 ו KNS42^9,10, 5 x 10³ תאים/mL יפיק מאכל עין ספרואיד (200 או 800 μm) לאחר 4 ימים של דגירה.
5. השהה את התאים בצינורות אוניברסליים על ידי היפוך עדין כדי להימנע מקלפינג תאים. פיפטה 200 μL של התא מושעה לכל טוב של צלחת 96-באר. אם כל הבארות אינם נדרשים, רצוי להוסיף 200 μL של 1x PBS לכל הבאר ריקה כדי למנוע אידוי.
6. מודיית את התאים בחממה כרגיל ב 37 ° c.
   הערה: קווי התאים כגון שורות התאים של סרטן glioma יהיה טופס spheroids בתוך 24 h. אפשר ארכיטקטורה תאית 3D כדי ליצור על ידי דגירה של ספרואיד עבור 72 h.

היום השני

7. בדיקת תאים על-ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לאחר 24 שעות. בהתאם לקו התא, ייתכן שתאים יצרו מזהה ספרואיד בתחתית הבאר.
   הערה: הקים glioma סרטן התאים קווי בצורה בקלות spheroids בתוך 24 h. החולה-הנגזר glioma סרטן קווי התאים עשויים להימשך עד 1-2 שבועות.

2. שיטת הפלישה קולגן

היום השלישי

1. המקום קולגן, 5x בינוני התרבות, 1 M NaOH, ו 1 20 mL על קרח.
2. בזהירות ובאיטיות להוסיף 10.4 mL של קולגן קר לתוך צינור תרבות מקורר. להימנע בועות. כמות זו של קולגן מספיק עבור 1 96-בסדר צלחת. ניתן לעשות שינוי קנה מידה אפשרי, אך מומלץ לעשות שפופרת 1 20 mL לכל צלחת מוכנה בכל פעם.
3. הוסיפו בעדינות 1.52 מ ל של בינונית תרבותית 5x הקרה וסטרילית. להימנע בועות.
4. רק לפני השימוש, להוסיף בעדינות 72 μL של קר סטרילי 1 M NaOH. . שמור על הפתרון על הקרח
5. מערבבים בעדינות על ידי ליטוף. להימנע בועות. ערבוב יעיל מוביל לשינוי צבע (מאדום לכתום-אדום (pH 7.4) במדיום. השאירו את התערובת על הקרח עד השימוש.
6. צעד מכריע: הסר 190 μL של סופרנטאנט מצלחת 96-באר המוכן ביום 1. להיזהר מאוד לא להפריע את הספרואידים שנוצרו בחלק התחתון של הבאר. השתמשו בפיפטה בזווית לכיוון הצד, ולא במרכז, בבאר.
7. הוסף בעדינות 100 μL של תערובת הקולגן לכל טוב. , כדי למנוע הפרעה ספרואידית. התערובת מעורבת בצד הבאר להימנע בועות. שמרו כל שילוב קולגן שנותר 20 מ ל בטמפרטורת החדר כדי להעריך את הפלמור.
8. הצלחת דגירה בחממה לפחות 10 דקות כדי לאפשר קולגן כדי פולימייט. כמנחה, אם שאריות הקולגן יש להגדיר, להיות וצק ו ספוג כמו, הspheroids מוכנים להיות מטופלים עם מעכב.
9. הוסיפו את התרופות או המעכבי בריכוז 2x למדיום התרבותי. הוסף את המדיום בעדינות לכל טוב (100 μL לכל טוב). שוב, פיפטה את המדיום במורד הצד של הבאר כדי למנוע הפרעה ספרואיד.
10. להתבונן ולצלם כל ספרואיד על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר לפעמים T = 0 h, 24 h, 48 h, ו 72 h כדי להעריך את פעילות הסמים. . אז תחזיר את הצלחת לחממה
    הערה: בהתאם התנהגות פולשנית של קו התא, הגירה הרחק מן הליבה ספרואיד המקורי ניתן לצפות 24 h ואילך.

3. הכנת מיכלי קולגן מוטבעים ותאי נדידה למיקרוסקופיה קונפוקלית

1. הניחו את הצלחת במכסה של תרבות הרקמה והסירו בעדינות את הסופרנטנט (200 μL). שוב, לדאוג לא להפריע הספרואיד ולהימנע מלגעת קולגן, כמו זה עלול להפריע תקע הקולגן.
2. החלף את הסופרנטאנט עם 100 μL של 1x PBS. חזור על זה שלב 3 x.
3. הסר את השטיפה הסופית והחלף עם 4% פורמלדהיד ב-1x PBS (100 μL לכל טוב).
   זהירות: פורמלדהיד הוא גורם מסרטן פוטנציאלי. טפל בזהירות בהתאם להנחיות הבריאות והבטיחות.
4. מניחים את הצלחת 96-באר על ספסל מעבדה, לכסות עם נייר כסף, ולצאת 24 שעות בטמפרטורת החדר.
5. בזהירות להסיר את פורמלדהיד ולהחליף עם 1x PBS. חזור על זה 1 x PBS כביסה 3x.
6. להכין 0.1% טריטון X-100 ב 1x PBS. להסיר את הכביסה 1x PBS ולהחליף עם 100 μL של הפתרון X-100 טריטון. המשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בינתיים, להכין את הפתרון חסימת עם 1 x PBS ו 0.05% אבקת חלב גנב ומערבבים ביסודיות.
7. להסיר את טריטון X-100 ולשטוף 3x עם 1x PBS. הוסף 100 μL של פתרון חסימת כל טוב ו מודעד 15 דקות.
8. לדלל את הנוגדן העיקרי הנדרש במאגר חסימת בריכוז הקבועה מראש. כאן, השימוש נגד עכבר IgG acetylated טובולין נוגדן (1:100).
9. צנטריפוגה את התערובת העיקרית לחסימת נוגדנים עבור 5 דקות ב 15,682 x g. הסר בזהירות את פתרון החסימה והוסף את הסופרנטנט (25-50 μL) לכל היותר. מודטה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 1 h.
10. הסר את פתרון נוגדן ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
11. דלל את הנוגדן המשני במאגר חסימת הריכוז המומלץ או הקבוע מראש בנוסף לכל כתמי פלורסנט נוספים. כאן, השתמש 1:500 נגד העכבר fluorophore-488 נוגדן מצובן, phalloidin-594 (1:500) עבור כתמי אקטין, ואת כתם DNA (dapi).
12. שוב, צנטריפוגה את הפתרון נוגדן משני עבור 5 דקות ב 13,000 סל ד.
13. הסר את פתרון חסימת מכל באר והוסף 25-50 μL של הנוגדן המשני/phalloidin/DAPI mix. דגירה בחושך עבור 1.5 h בטמפרטורת החדר.
14. להסיר את הפתרון נוגדן משני לצבוע ולשטוף 3x עם 1x PBS (100 μL לכל טוב).
15. הרימו בזהירות את אטמי הקולגן הבודדים באמצעות שאיבה עם פיפטה פלסטי (200 μL) למרכז של שקופית זכוכית פשוטה באיכות גבוהה.
16. הוסיפו טיפה אחת של השוטר המתאים לתקע הקולגן, והקפדה על התקע מכוסה לחלוטין. להימנע בועות.
17. החלת הכיסויים של העובי האופטימלי למטרת המיקרוסקופ שישמשו לדימות ולאפשר את הגדרת הלילה. אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר בחשכה.

4. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

1. לכידת תמונות פלורסנט באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית מתאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טכנולוגיית ספרואיד תלת ממדית מקדמת את ההבנה של אינטראקציות הגידול בסמים, משום שהיא מייצגת יותר את הסביבה הספציפית לסרטן. הדור של הספרואידים יכול להיות מושגת במספר דרכים; הדבקות נמוכה 96-לוחיות הרישוי שימשו בפרוטוקול זה. לאחר בדיקת מספר מוצרים מיצרנים שונים, הצלחות המשמשו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הדרך הרומן ליצור spheroids תאים סרטניים לזיהוי של פעילות סמים migrastatic באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד ברזולוציה גבוהה מתואר. השימוש בלוחות מסוכרנים נמוכים על פני טכניקות אחרות, כגון תליית טיפות¹⁵, הקלה על אמצעי ליצירת הספרואידים ומדים אחידים לשימוש הגירה קולגן הפלישה assays. הנקודות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.