Caractérisation des effets des inhibiteurs migrastatiques sur l'invasion sphéroïde de tumeur 3D par microscopie confocale de haute résolution

Résumé

Les effets des inhibiteurs migrastatiques sur la migration de cellules cancéreuses de glioma dans les essais tridimensionnels (3D) d'invasion utilisant un inhibiteur de l'histone deacetylase (HDAC) sont caractérisés par la microscopie confocale à haute résolution.

Résumé

La découverte et le développement de médicaments dans la recherche sur le cancer sont de plus en plus basés sur des écrans de médicaments dans un format 3D. De nouveaux inhibiteurs ciblant le potentiel migratoire et invasif des cellules cancéreuses, et par conséquent la propagation métastatique de la maladie, sont découverts et considérés comme des traitements complémentaires dans les cancers hautement invasifs tels que les gliomes. Ainsi, la génération de données permettant des analyses détaillées des cellules dans un environnement 3D après l'ajout d'un médicament est nécessaire. La méthodologie décrite ici, combinant des essais d'invasion sphéroïde avec la capture d'image à haute résolution et l'analyse des données par microscopie à balayage laser confocal (CLSM), a permis une caractérisation détaillée des effets de l'inhibiteur anti-migratoire potentiel MI-192 sur les cellules de gliome. Des sphéroïdes ont été produits à partir des lignées cellulaires pour des essais d'invasion dans les plaques de 96 puits adhérentes basses et ont ensuite préparé pour l'analyse de CLSM. Le flux de travail décrit a été préféré à d'autres techniques de production sphéroïde couramment utilisées en raison de la facilité et de la reproductibilité. Ceci, combiné à la résolution d'image améliorée obtenue par microscopie confocale par rapport aux approches conventionnelles à large champ, a permis l'identification et l'analyse des changements morphologiques distincts dans les cellules migratrices dans un environnement 3D suivant traitement avec le médicament migrastatique MI-192.

Introduction

Les technologies sphéroïdes tridimensionnelles pour la découverte de médicaments précliniques et le développement de médicaments anticancéreux potentiels sont de plus en plus favorisées par-dessus les écrans de médicaments conventionnels; ainsi, il y a plus de développement des drogues migrastatiques — migration et invasion — . La raison d'être de ces développements dans le traitement du cancer est claire : les essais sphéroïdes 3D représentent une approche plus réaliste pour le dépistage des médicaments anticancéreux potentiels, car ils imitent l'architecture tumorale 3D plus fidèlement que les cultures monocouches cellulaires, récapitulez les interactions médicament-tumeur (cinétique) avec plus de précision, et permettez la caractérisation de l'activité médicamenteuse dans un cadre lié à la tumeur. En outre, l'augmentation de la résistance aux médicaments chimiotoxiques dans de nombreux types de cancer et les taux de mortalité élevés chez les patients atteints de cancer en raison de métastes potentialisées par la capacité des cellules cancéreuses à migrer vers des sites tumoraux éloignés soutient l'inclusion d'agents chimiothérapeutiques ciblant le potentiel migratoire des cellules cancéreuses comme traitement adjuvant dans les futurs essais cliniques sur le cancer¹. C'est particulièrement le cas dans les cancers très invasifs, tels que les glioblastomes à haute teneur (GBM). La gestion de GBM inclut la chirurgie, la radiothérapie, et la chimiothérapie. Cependant, même avec le traitement de combinaison, la plupart des patients rechutent dans un délai de 1 an du diagnostic initial avec une survie médiane de 11-15 mois^2,3. D'énormes progrès dans le domaine de la technologie 3D ont été réalisés au cours des dernières années : systèmes rotatifs, structures microfabriquées et échafaudages 3D, et d'autres essais individuels sont continuellement améliorés pour permettre des essais de routine à grande échelle^{4, 5,6,7}. Cependant, les résultats obtenus à partir de ces essais doivent être analysés de manière significative, car l'interprétation des données est souvent entravée par les tentatives d'analyse des données générées en 3D avec des systèmes d'analyse d'images 2D.

Bien qu'ils soient préférables en termes de vitesse d'acquisition d'images et de réduction de la toxicité de la photo, la plupart des systèmes à champ large restent limités par la résolution⁸. Ainsi, en dehors des données de lecture relatives à l'efficacité des médicaments, les effets détaillés de l'action médicamenteuse sur les structures cellulaires 3D des cellules migrantes sont inévitablement perdus s'ils sont représentés à l'aide d'un système à champ large. Inversement, la microscopie par balayage laser confocal (CLSM) capture des images de haute qualité, sectionnement optique qui peuvent être reconstruites et rendues en 3D après l'acquisition à l'aide d'un logiciel informatique. Ainsi, CLSM est facilement applicable à l'imagerie complexe structures cellulaires 3D, permettant ainsi l'interrogation des effets des inhibiteurs anti-migrastatic sur les structures 3D et des analyses approfondies des mécanismes de migration cellulaire. Cela guidera sans aucun doute le développement futur de médicaments migrastatiques. Ici, un flux de travail combiné de la génération sphéroïde, du traitement de drogue, du protocole de coloration, et de la caractérisation par microscopie confocale à haute résolution est décrit.

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Protocole

1. Génération de sphéroïdes cellulaires

Jour 1

1. Préparer le milieu de culture standard comme l'exige la ligne cellulaire faisant l'objet de l'enquête.
2. Effectuer toutes les étapes associées à la culture tissulaire dans une hotte de culture tissulaire en utilisant des techniques de manipulation stériles.
3. Trypsiniser et compter les cellules cancéreuses. Utiliser 20 ml de suspension cellulaire par assiette. Gardez les suspensions cellulaires dans des tubes universels stériles clairement étiquetés.
4. Ajoutez un nombre prédéterminé de cellules à chaque puits. Le nombre initial de cellules et la taille ultime du sphéroïde requis dépendent du taux de prolifération de la lignée cellulaire à l'étude.
   REMARQUE: Pour les lignées cellulaires de gliomes établies telles que U251 et KNS42^9,10, 5 x 10³ cellules/mL produiront un sphéroïde microscopiquement visible (200 ou 800 m) après 4 jours d'incubation.
5. Resuspendre les cellules dans des tubes universels par inversion douce pour éviter l'agglutination cellulaire. Pipette 200 l de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Si tous les puits ne sont pas nécessaires, il est conseillé d'ajouter 200 L de 1x PBS à chaque puits vide pour éviter l'évaporation.
6. Incuber les cellules dans un incubateur comme d'habitude à 37 oC.
   REMARQUE: Les lignées cellulaires telles que les lignées cellulaires cancéreuses du gliome formeront des sphéroïdes dans les 24 h. Permettre à l'architecture cellulaire 3D de se former en couvant le sphéroïde pendant 72 h.

Jour 2

7. Vérifier les cellules par microscopie de champ lumineux après 24 h. Selon la lignée cellulaire, les cellules peuvent avoir formé un sphéroïde détectable au fond du puits.
   REMARQUE: Les lignées cellulaires cancéreuses établies de gliome forment facilement des sphéroïdes dans un délai de 24 h. Les lignées de cellules cancéreuses du gliome dérivées du patient peuvent prendre jusqu'à 1-2 semaines.

2. Collagen Invasion Assay

Jour 3

1. Placer le collagène, le milieu de culture 5x, 1 M NaOH, et un tube de 20 ml sur la glace.
2. Ajouter soigneusement et lentement 10,4 ml de collagène froid dans un tube de culture réfrigéré. Évitez les bulles. Cette quantité de collagène est suffisante pour une plaque de 96 puits. La mise à l'échelle est possible, mais il est recommandé qu'un tube de 20 ml par plaque soit préparé à la fois.
3. Ajouter délicatement 1,52 ml de milieu de culture stérile froid 5x. Évitez les bulles.
4. Juste avant l'utilisation, ajouter délicatement 72 'L de froid stérile 1 M NaOH. Gardez la solution sur la glace.
5. Mélanger délicatement par pipetting. Évitez les bulles. Un mélange efficace entraîne un changement de couleur (du rouge au rouge orange (pH 7,4) dans le milieu. Laisser le mélange sur la glace jusqu'à l'utilisation.
6. Étape cruciale : Retirez 190 l de supernatant de la plaque de 96 puits préparée le jour 1. Soyez très prudent de ne pas déranger les sphéroïdes qui se sont formés dans le fond du puits. Utilisez la pipette à un angle vers le côté, et non au centre, du puits.
7. Ajouter délicatement 100 l du mélange de collagène à chaque puits. Pour éviter toute perturbation sphéroïde, pipette le mélange sur le côté du puits. Évitez les bulles. Conservez le reste du mélange de collagène dans le tube de 20 ml à température ambiante pour évaluer la polymérisation.
8. Incuber la plaque dans l'incubateur pendant au moins 10 min pour permettre au collagène de polymériser. Comme ligne directrice, si le collagène restant a réglé, devenant semi-solide et éponge-comme, les sphéroïdes sont prêts à être traités avec l'inhibiteur.
9. Ajouter les médicaments ou les inhibiteurs à la concentration 2x au milieu de la culture. Ajouter doucement le milieu à chaque puits (100 l par puits). Encore une fois, pipette le milieu sur le côté du puits pour éviter les perturbations sphéroïdes.
10. Observez et imagez chaque sphéroïde par microscopie de champ lumineux à des moments T - 0 h, 24 h, 48 h, et 72 h pour évaluer l'activité de drogue. Puis remettez la plaque à l'incubateur.
    REMARQUE: Selon le comportement invasif de la lignée cellulaire, la migration loin du noyau sphéroïde d'origine peut être observée à partir de 24 h.

3. Préparation de sphéroïdes incorporés au collagène et de cellules migratrices pour la microscopie confocale

1. Placer la plaque dans une hotte de culture tissulaire et retirer délicatement le supernatant (200 l). Encore une fois, prendre soin de ne pas déranger le sphéroïde et éviter de toucher le collagène, car cela peut interférer avec le bouchon de collagène.
2. Remplacer le supernatant par 100 OL de 1x PBS. Répétez cette étape de lavage 3x.
3. Retirer le lavage final et remplacer par 4 % de formaldéhyde dans 1 x PBS (100 l par puits).
   MISE EN GARDE: Le formaldéhyde est un cancérogène potentiel. Manipuler avec soin conformément aux directives de santé et de sécurité.
4. Placer la plaque de 96 puits sur un banc de laboratoire, couvrir de papier d'aluminium et laisser reposer 24 h à température ambiante.
5. Retirez soigneusement le formaldéhyde et remplacez-le par 1x PBS. Répétez ce lavage 1x PBS 3x.
6. Préparer 0,1% Triton X-100 en 1x PBS. Retirez le lavage 1x PBS et remplacez-le par 100 L de la solution Triton X-100. Incuber 30 min à température ambiante. En attendant, préparer la solution de blocage avec 1x PBS et 0,05% de lait écrémé en poudre et bien mélanger.
7. Retirez Triton X-100 et lavez 3x avec 1x PBS. Ajouter 100 l de solution de blocage à chaque puits et incuber pendant 15 min.
8. Diluer l'anticorps primaire requis pour bloquer le tampon à la concentration prédéterminée. Ici, utilisez l'anticorps anti-souris IgG acétylé tubulin (1:100).
9. Centrifugeuse le mélange tampon principal de blocage d'anticorps pendant 5 min à 15 682 x g. Retirez soigneusement la solution de blocage et ajoutez le supernatant (25 à 50 l) à chaque puits. Incuber dans l'obscurité à température ambiante pendant 1 h.
10. Retirez la solution d'anticorps et lavez 3x avec 1x PBS (100 l par puits).
11. Diluer l'anticorps secondaire dans le tampon de blocage à la concentration recommandée ou prédéterminée en plus de toutes les taches fluorescentes supplémentaires. Ici, utilisez 1:500 anticorps conjugués anti-souris fluorophore-488, phalloidin-594 (1:500) pour la coloration d'actine, et la tache d'ADN (DAPI).
12. Encore une fois, centrifuger la solution d'anticorps secondaire pour 5 min à 13.000 tr/min.
13. Retirez la solution de blocage de chaque puits et ajoutez 25 à 50 L du mélange anticorps/phalloidin/DAPI secondaire. Incuber dans l'obscurité pendant 1,5 h à température ambiante.
14. Enlever la solution secondaire de teinture d'anticorps et laver 3x avec 1x PBS (100 L par puits).
15. Soulevez soigneusement les bouchons individuels de collagène par aspiration avec une pipette en plastique (200 l) sur le centre d'un toboggan en verre ordinaire de haute qualité.
16. Ajouter une goutte d'un mondeur approprié à la prise de collagène, en veillant à ce que la fiche soit complètement recouverte. Évitez les bulles.
17. Appliquer le bordereau de l'épaisseur optimale pour l'objectif du microscope qui sera utilisé pour l'imagerie et permettre de définir pendant la nuit. Conserver les toboggans à température ambiante dans l'obscurité.

4. Microscopie fluorescence

1. Capturez des images fluorescentes à l'aide d'un microscope confocal approprié.

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Résultats

La technologie sphéroïde tridimensionnelle fait progresser la compréhension des interactions médicamenteuses parce qu'elle est plus représentative de l'environnement spécifique au cancer. La génération de sphéroïdes peut être réalisée de plusieurs façons; des plaques de 96 puits à faible adhérence ont été utilisées dans ce protocole. Après avoir testé plusieurs produits de différents fabricants, les plaques utilisées ici ont été choisies parce qu'elles ont toujour...

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Discussion

Une nouvelle manière de créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses pour identifier l'activité migrastatique de drogue utilisant la microscopie confocale de haute résolution est décrite. L'utilisation de plaques adhérentes faibles sur d'autres techniques, telles que les gouttes suspendues¹⁵, a facilité un moyen de générer des sphéroïdes reproductibles et uniformes pour une utilisation dans la migration du collagène et les essais d'invasion. Les points critiques dans ce protocole so...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.