고분해능 공초점 현미경검사법에 의한 3D 종양 스페로이드 침습에 대한 Migrastatic 억제제의 특성화

요약

신경교종 암 세포 이동에 대한 신경교암 억제제의 효과는 히스톤 탈아세틸라제(HDAC) 억제제를 이용한 3차원(3D) 침입 분석에 대한 고해상도 공초점 현미경검사법을 특징으로 한다.

초록

암 연구의 약물 발견 및 개발은 점점 더 3D 형식으로 약물 스크린을 기반으로하고 있습니다. 암세포의 철새 및 침습적 잠재력을 표적으로 하는 새로운 억제제, 그리고 결과적으로 질병의 전이성 퍼짐은, gliomas와 같은 고침성 암에 있는 상보적인 처리로 발견되고 고려되고 있습니다. 따라서, 약물을 첨가한 후 3D 환경에서 세포의 상세한 분석을 가능하게 하는 데이터를 생성하는 것이 요구된다. 여기서 설명한 방법론은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)에 의한 고해상도 이미지 캡처 및 데이터 분석과 스페로이드 침입 분석법을 결합하여 잠재적인 항철 억제제의 효과에 대한 상세한 특성 분석을 가능하게 했습니다. 신경교종 세포에 MI-192. 스페로이드는 낮은 부착 성 96 웰 플레이트에서 침략 분석세포주에서 생성된 다음 CLSM 분석을 위해 제조하였다. 설명된 워크플로우는 용이성과 재현성 모두로 인해 일반적으로 사용되는 다른 스페로이드 생성 기술보다 선호되었습니다. 이는 기존의 광시야 접근법에 비해 공초점 현미경 검사법에 의해 달성된 향상된 이미지 해상도와 결합하여 3D 환경에서 철새 세포의 뚜렷한 형태학적 변화를 식별하고 분석할 수 있었습니다. mi-192 의 제과약물로 치료할 수 있습니다.

서문

전임상 신약 발견 및 잠재적인 항암제 개발을 위한 3차원 스페로이드 기술이 기존의 약물 스크린보다 점점 더 선호되고 있다; 따라서, migrastatic의 더 많은 개발이있다 ―이주 및 침략 방지 - 마약. 암 치료에 있는 이 발달의 뒤에 근거는 분명합니다: 3D spheroid 어설아지는 세포 단층 배양 보다는 더 충실하게 3D 종양 건축을 모방하기 때문에 잠재적인 항암약을 검열을 위한 보다 현실적인 접근을 나타냅니다, 약물-종양 상호 작용(역학)을 보다 정확하게 재구성하고 종양 관련 설정에서 약물 활성의 특성화를 허용한다. 또한, 많은 암 유형에서 화학 독성 약물에 대한 내성의 증가와 암 세포가 먼 종양 부위로 이동하는 능력에 의해 전이에 의한 높은 사망률은 화학 요법 제의 포함을 뒷받침합니다. 향후 임상시험에서 보조치료제로 암세포의 철새전위를 표적으로^1. 이것은 고도로 침략적인 암에 있는, 고급 교모세포종 (GBM)와 같은 경우에 특히 입니다. GBM 관리에는 수술, 방사선 요법 및 화학요법이 포함됩니다. 그러나, 조합 처리로조차, 대부분의 환자는 11-15 달^의중간 생존을 가진 초기 진단의 1 년 안에 재발^2,3. 3D 기술 분야의 거대한 발전은 지난 몇 년 동안 이루어졌다 : 회전 시스템, 미세 제작 구조 및 3D 스캐폴드, 및 기타 개별 실험은 지속적으로 대규모^4에서일상적인 테스트를 허용하기 위해 개선되고있다^{4 , 5,6,7}. 그러나 이러한 분석에서 얻은 결과는 2D 이미지 분석 시스템으로 3D 생성 데이터를 분석하려는 시도로 인해 데이터 해석이 종종 방해되기 때문에 의미 있는 방식으로 분석되어야 합니다.

이미지 수집 속도와 광 독성 감소 측면에서 바람직함에도 불구하고 대부분의 광시야 시스템은 해상도^8에의해 제한됩니다. 따라서, 약물 효능과 관련된 데이터 판독과는 별개로, 광시야 시스템을 사용하여 이미지화하면 이동 세포의 3D 세포 구조에 대한 약물 작용의 상세한 효과는 필연적으로 손실됩니다. 반대로 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 3D 후 수집으로 재구성및 렌더링할 수 있는 고품질의 광학 섹션 이미지를 캡처합니다. 따라서 CLSM은 복잡한 3D 세포 구조에 쉽게 적용가능하여 3D 구조에 대한 항미정 억제제의 영향과 세포 이동 메커니즘의 심층 분석을 가능하게 합니다. 이것은 의심 할 여지없이 미래의 신경질성 약물 개발을 안내 할 것입니다. 여기서, 고분해능 공초점 현미경에 의한 스페로이드 생성, 약물 치료, 염색 프로토콜 및 특성화의 결합된 워크플로우가 설명된다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

1. 세포 스페로이드의 생성

1일차

1. 조사 중인 세포주에서 요구하는 표준 배양 배지를 준비한다.
2. 멸균 처리 기술을 사용하여 조직 배양 후드에서 모든 조직 배양 관련 단계를 수행합니다.
3. 트립시니화 하고 암 세포를 계산합니다. 플레이트당 20 mL의 셀 서스펜션을 사용하십시오. 셀 현탁액을 명확하게 라벨이 부착된 멸균 범용 튜브에 보관하십시오.
4. 각 웰에 미리 정해진 수의 셀을 추가합니다. 필요한 세포의 초기 수와 궁극적인 스페로이드 크기는 조사중인 세포강의 증식 속도에 달려 있습니다.
   참고: U251 및 KNS42^9,10,5 x 10³ 세포/mL과 같은 확립된 신경교종 세포주들의 경우 4일간의 배양 후 현미경으로 보이는 스페로이드(200 또는 800 μm)를 생성합니다.
5. 세포 응집을 피하기 위해 부드러운 반전으로 범용 튜브의 세포를 다시 중단하십시오. 피펫 200 μL의 셀 현탁액을 96웰 플레이트의 각 웰내로. 모든 웰이 필요하지 않은 경우 증발을 피하기 위해 각 빈 우물에 200 μL의 1x PBS를 추가하는 것이 좋습니다.
6. 37 °C에서 정상적으로 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
   참고: 신경교종 암 세포주와 같은 세포주들은 24시간 내에 스페로이드를 형성할 것입니다. 72 시간 동안 스페로이드를 배양하여 3D 세포 아키텍처를 형성할 수 있습니다.

2일차

7. 24 시간 후에 밝은 필드 현미경 검사법에 의하여 세포를 검사하십시오. 세포주에 따라, 세포는 우물의 바닥에 검출 가능한 스페로이드를 형성할 수 있습니다.
   참고: 확립된 신경교종 암 세포주는 24시간 이내의 스페로이드를 쉽게 형성합니다.

2. 콜라겐 침공 분석

3일차

1. 콜라겐, 5x 배양 배지, 1 M NaOH, 얼음 에 20 mL 튜브 1개를 놓습니다.
2. 차갑게 차가운 콜라겐 10.4 mL을 차가운 배양 튜브에 조심스럽게 천천히 넣습니다. 거품을 피하십시오. 이 양의 콜라겐은 96웰 플레이트 한 개에 충분합니다. 업 스케일링은 가능하지만 플레이트 당 20 mL 튜브 1 개를 한 번에 준비하는 것이 좋습니다.
3. 1.52 mL의 차가운 멸균 5x 배양 매체를 부드럽게 첨가하십시오. 거품을 피하십시오.
4. 사용 직전에 72 μL의 차가운 멸균 1 M NaOH를 부드럽게 첨가하십시오. 얼음에 솔루션을 유지합니다.
5. 파이펫팅하여 부드럽게 섞으세요. 거품을 피하십시오. 효율적인 혼합은 배지에서 적색에서 주황색-빨간색(pH 7.4)까지의 색상 변화를 유도합니다. 혼합물을 얼음에 넣고 사용할 때까지 그대로 둡니다.
6. 결정적인 단계: 1일째에 제조된 96웰 플레이트에서 상급190 μL을 제거합니다. 우물의 바닥에 형성 된 스페로이드를 방해하지 않도록 매우주의하십시오. 파이펫을 우물의 중심이 아닌 측면을 향한 각도로 사용하십시오.
7. 콜라겐 혼합물 100 μL을 각 웰에 부드럽게 넣습니다. 어떤 spheroid 방해를 방지하기 위해, 파이펫 우물의 측면 아래로 믹스. 거품을 피하십시오. 남은 콜라겐 혼합물을 20 mL 튜브에 실온에서 보관하여 중합을 평가합니다.
8. 인큐베이터에서 적어도 10분 동안 인큐베이터 플레이트를 배양하여 콜라겐이 중합되도록 하였다. 지침으로, 남은 콜라겐이 설정된 경우, 반고체 및 스폰지 같은되고, 스페로이드는 억제제로 처리 될 준비가되어 있습니다.
9. 배양 배지에 2배 농도로 약물 또는 억제제를 첨가한다. 각 우물에 부드럽게 매체를 추가합니다 (잘 당 100 μL). 다시, 피펫 은 스페로이드 교란을 피하기 위해 우물의 측면 아래로 매체.
10. 관찰 및 시간 T = 0 시간, 24 시간, 48 시간, 및 72 시간에 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 각 스페로이드를 관찰하고 약물 활동을 평가하기 위해. 그런 다음 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.
    참고: 세포주의 침략적 거동에 따라, 원래의 스페로이드 코어로부터의 이동은 24시간 이후부터 관찰될 수 있다.

3. 공초점 현미경 검사법을 위한 콜라겐 내장된 구형 및 철새 세포의 준비

1. 플레이트를 조직 배양 후드에 놓고 상판(200 μL)을 부드럽게 제거한다. 다시 말하지만, 스페로이드를 방해하지 않도록주의하고 콜라겐을 만지지 않도록주의하십시오.
2. 상급체를 1x PBS의 100 μL로 교체하십시오. 이 세척 단계를 3x 반복합니다.
3. 최종 세척을 제거하고 1x PBS (웰 당 100 μL)에서 4 % 포름 알데히드로 교체하십시오.
   주의 사항: 포름알데히드는 잠재적인 발암 물질입니다. 건강 및 안전 지침에 따라 주의하십시오.
4. 실험실 벤치에 96 웰 플레이트를 놓고 호일로 덮고 실온에서 24 시간 동안 둡니다.
5. 조심스럽게 포름알데히드를 제거하고 1x PBS로 교체하십시오. 이 1x PBS 세척을 3배 반복합니다.
6. 1x PBS에서 0.1% 트리톤 X-100을 준비합니다. 1x PBS 세척을 제거하고 트리톤 X-100 용액의 100 μL로 교체하십시오. 실온에서 30 분 동안 배양하십시오. 그 동안, 1x PBS와 0.05 % 탈지 분유로 차단 용액을 준비하고 철저히 혼합하십시오.
7. 트리톤 X-100을 제거하고 1x PBS로 3x를 씻으소서. 각 웰에 100 μL의 차단 용액을 추가하고 15 분 동안 배양하십시오.
8. 소정의 농도에서 완충액 차단에 필요한 1차 항체를 희석한다. 여기서, 항마우스 IgG 아세틸화 투불린 항체(1:100)를 사용한다.
9. 원심분리기 15,682 x g에서5분 동안 1차 항체 차단 완충제 혼합. 조심스럽게 차단 용액을 제거하고 각 우물에 상급 (25−50 μL)을 추가하십시오. 1 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 배양하십시오.
10. 항체 용액을 제거하고 1 x PBS (웰 당 100 μL)로 3 x를 씻으하십시오.
11. 임의의 추가형광 얼룩 이외에 권장 또는 소정의 농도에서 차단 완충액에서 이차 항체를 희석한다. 여기서, 1:500 항마우스 플루오로포어-488 공액항체, 팔로이드-594(1:500) 액틴 염색, 및 DNA 얼룩(DAPI)을 사용한다.
12. 다시, 13,000 rpm에서 5 분 동안 이차 항체 용액을 원심 분리.
13. 각 우물에서 차단 용액을 제거하고 보조 항체 / 판지로이드 / DAPI 혼합물의 25-50 μL을 추가하십시오. 실온에서 1.5 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오.
14. 이차 항체 염료 용액을 제거하고 1 x PBS (잘 당 100 μL)로 3 x씻어.
15. 플라스틱 파이펫(200 μL)으로 흡입하여 개별 콜라겐 플러그를 고품질 일반 유리 슬라이드의 중앙에 조심스럽게 들어 올립니다.
16. 콜라겐 플러그에 적합한 마운트를 한 방울 추가하여 플러그가 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 거품을 피하십시오.
17. 이미징에 사용될 현미경 목표에 대한 최적의 두께의 커버슬립을 적용하고 하룻밤 사이에 설정할 수 있습니다. 슬라이드를 어두운 실내 온도에서 보관하십시오.

4. 형광 현미경 검사법

1. 적절한 공초점 현미경을 사용하여 형광등 이미지를 캡처합니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

3차원 스페로이드 기술은 암 특이적 환경을 보다 대표하기 때문에 약물-종양 상호작용에 대한 이해를 증진시키고 있다. 스페로이드의 생성은 여러 가지 방법으로 달성 될 수있다; 낮은 준수 96 웰 플레이트는이 프로토콜에 사용되었다. 다른 제조업체의 여러 제품을 테스트 한 후, 여기에서 사용되는 플레이트는 성공적인 스페로이드 생산 및 균일성 측면에서 일관되게 최고...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

고분해능 공초점 현미경을 사용하여 경화약 활성을 식별하기 위한 암세포 스페로이드를 만드는 새로운 방법이 기술되어 있다. 매달려 방울^(15)과같은 다른 기술에 낮은 부착 플레이트의 사용은 콜라겐 이동 및 침략 검정에 사용하기 위해 재현 가능하고 균일 한 스페로이드를 생성하는 수단을 용이하게하고있다. 이 프로토콜의 중요한 점은 콜라겐 매트릭스에 세포 스페로이드가 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.