Charakterisierung der Auswirkungen von Migrastatischen Inhibitoren auf die 3D-Tumorsphäroid-Invasion durch hochauflösende Konfokalmikroskopie

Zusammenfassung

Die Auswirkungen von migrastatischen Inhibitoren auf die Gliom-Krebszellmigration in dreidimensionalen (3D) Invasions-Assays mit einem Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDAC) sind durch eine hochauflösende konfokale Mikroskopie gekennzeichnet.

Zusammenfassung

Die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln in der Krebsforschung basiert zunehmend auf Medikamentenscreens im 3D-Format. Neuartige Inhibitoren, die auf das wandernde und invasive Potenzial von Krebszellen und damit auf die metastasierende Ausbreitung von Krankheiten abzielen, werden entdeckt und als ergänzende Behandlungen bei hochinvasiven Krebsarten wie Gliomen betrachtet. Daher ist die Generierung von Daten erforderlich, die die detaillierte Analyse von Zellen in einer 3D-Umgebung nach Zugabe eines Medikaments ermöglichen. Die hier beschriebene Methodik, die Sphäroid-Invasions-Assays mit hochauflösender Bilderfassung und Datenanalyse mittels konfokaler Laserscanmikroskopie (CLSM) kombiniert, ermöglichte eine detaillierte Charakterisierung der Auswirkungen des potenziellen Anti-Migrations-Inhibitors. MI-192 über Gliomzellen. Sphäroide wurden aus Zelllinien für Invasionstests in niedrig haftenden 96-Well-Platten erzeugt und dann für die CLSM-Analyse vorbereitet. Der beschriebene Workflow wurde aufgrund der Einfachheit und Reproduzierbarkeit gegenüber anderen häufig verwendeten Sphäroid-Erzeugungstechniken bevorzugt. In Kombination mit der verbesserten Bildauflösung, die durch konfokale Mikroskopie im Vergleich zu herkömmlichen Weitfeldansätzen erreicht wurde, ermöglichte dies die Identifizierung und Analyse unterschiedlicher morphologischer Veränderungen in Wanderzellen in einer 3D-Umgebung, Behandlung mit dem migrastatischen Medikament MI-192.

Einleitung

Dreidimensionale Sphäroid-Technologien für die präklinische Arzneimittelentdeckung und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente werden zunehmend gegenüber herkömmlichen Arzneimittelscreens bevorzugt; daher gibt es mehr Entwicklung von migrastatischen — Migration und Invasionsprävention — Drogen. Die Gründe für diese Entwicklungen in der Krebsbehandlung sind klar: 3D-Sphäroid-Assays stellen einen realistischeren Ansatz für das Screening potenzieller Krebsmedikamente dar, da sie die 3D-Tumorarchitektur getreuer imitieren als Zellmonolayer-Kulturen, Wirkstoff-Tumor-Wechselwirkungen (Kinetik) genauer rekapitulieren und die Charakterisierung der Arzneimittelaktivität in einer tumorbedingten Umgebung ermöglichen. Darüber hinaus unterstützt der Anstieg der Resistenz gegen chemotoxische Medikamente bei vielen Krebsarten und die hohe Sterblichkeitsrate bei Krebspatienten aufgrund von Metastasen, die durch die Fähigkeit von Krebszellen potenziert werden, an entfernte Tumorstellen zu wandern, die Einbeziehung von Chemotherapeutika Ausrichtung auf das Migrationspotenzial von Krebszellen als adjuvante Behandlung in zukünftigen klinischen Krebsstudien¹. Dies gilt insbesondere für hochinvasive Krebsarten wie hochgradige Glioblastome (GBM). GBM-Management umfasst Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie. Doch selbst bei einer Kombinationsbehandlung fallen die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach der Erstdiagnose mit einem medianen Überleben von 11-15 Monaten^2,3zurück. In den letzten Jahren wurden enorme Fortschritte auf dem Gebiet der 3D-Technologie erzielt: Rotationssysteme, mikrofabrizierte Strukturen und 3D-Gerüste sowie andere Einzelprüfungen werden kontinuierlich verbessert, um Routinetests im großen Maßstab zu ermöglichen^{4, 5,6,7}. Die ergebnisseweisen aus diesen Assays müssen jedoch sinnvoll analysiert werden, da die Dateninterpretation oft durch Versuche behindert wird, 3D-generierte Daten mit 2D-Bildanalysesystemen zu analysieren.

Obwohl die Bildaufnahmegeschwindigkeit und die reduzierte Fototoxizität bevorzugt sind, bleiben die meisten Breitfeldsysteme durch Auflösung⁸begrenzt. Abgesehen von Datenauslesungen im Zusammenhang mit der Wirksamkeit von Arzneimitteln gehen detaillierte Auswirkungen der Arzneimittelwirkung auf 3D-Zellstrukturen wandernder Zellen unweigerlich verloren, wenn sie mit einem Weitfeldsystem abgebildet werden. Umgekehrt erfasst die konfokale Laserscanmikroskopie (CLSM) hochwertige, optisch geschnittene Bilder, die in der 3D-Nacherfassung mit Computersoftware rekonstruiert und gerendert werden können. So ist CLSM leicht auf die Abbildung komplexer 3D-Zellstrukturen anwendbar und ermöglicht so die Abfrage der Auswirkungen von anti-migrastatischen Inhibitoren auf 3D-Strukturen und eingehende Analysen von Zellmigrationsmechanismen. Dies wird zweifellos als Richtschnur für die zukünftige Entwicklung migrastatischer Arzneimittel dienen. Hier wird ein kombinierter Workflow aus Sphäroiderzeugung, medikamentöser Behandlung, Färbeprotokoll und Charakterisierung durch hochauflösende konfokale Mikroskopie beschrieben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Erzeugung von Zellsphäriden

Tag 1

1. Bereiten Sie das Standardkulturmedium entsprechend der zu untersuchenden Zellenlinie vor.
2. Führen Sie alle gewebekulturassoziierten Schritte in einer Gewebekulturhaube mit sterilen Handhabungstechniken durch.
3. Versuchen und zählen Sie Krebszellen. Verwenden Sie 20 ml Zellaufhängung pro Platte. Bewahren Sie die Zellsuspensionen in klar beschrifteten sterilen Universalröhren auf.
4. Fügen Sie jedem Brunnen eine vordefinierte Anzahl von Zellen hinzu. Sowohl die anfängliche Anzahl der Zellen als auch die erforderliche endgültige Sphäroidgröße hängen von der Proliferationsrate der untersuchten Zelllinie ab.
   HINWEIS: Für etablierte Gliom-Zelllinien wie U251 und KNS42⁹erzeugen¹⁰, 5 x 10³ Zellen/ml nach 4 Tagen Inkubation ein mikroskopisch sichtbares Sphäroid (200 oder 800 m).
5. Setzen Sie die Zellen in Universalröhren durch sanfte Inversion wieder auf, um Zellverklumpungen zu vermeiden. Pipette 200 l der Zellsuspension in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte. Wenn nicht alle Brunnen benötigt werden, ist es ratsam, jedem leeren Brunnen 200 l 1x PBS hinzuzufügen, um Verdunstung zu vermeiden.
6. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator wie gewohnt bei 37 °C.
   HINWEIS: Zelllinien wie Gliom-Krebszelllinien bilden Sphäroide innerhalb von 24 h. Lassen Sie 3D-Zellarchitektur durch Inkubation des Sphäroids für 72 h entstehen.

Tag 2

7. Überprüfen Sie Zellen durch Hellfeldmikroskopie nach 24 h. Je nach Zelllinie können Zellen ein Sphäroid gebildet haben, das im Boden des Brunnens nachweisbar ist.
   HINWEIS: Etablierte Gliom-Krebszelllinien bilden leicht Sphäroide innerhalb von 24 h. Patienten-abgeleitete Gliom-Krebszelllinien können bis zu 1-2 Wochen dauern.

2. Kollagen Invasion Assay

Tag 3

1. Kollagen, 5x Kulturmedium, 1 M NaOH und eine 20 ml Tube auf Eis legen.
2. Sorgfältig und langsam 10,4 ml kaltes Kollagen in ein gekühltes Kulturrohr geben. Vermeiden Sie Blasen. Diese Menge an Kollagen reicht für eine 96-Well-Platte. Upscaling ist möglich, aber es wird empfohlen, dass jeweils ein 20 ml Rohr pro Platte vorbereitet wird.
3. 1,52 ml kaltes steriles 5x Kulturmedium vorsichtig hinzufügen. Vermeiden Sie Blasen.
4. Kurz vor Gebrauch 72 l kaltsteril 1 M NaOH vorsichtig hinzufügen. Halten Sie die Lösung auf Eis.
5. Mischen Sie sanft durch Pipettieren. Vermeiden Sie Blasen. Effizientes Mischen führt zu einem Farbwechsel (von Rot zu Orange-Rot (pH 7.4) im Medium. Lassen Sie die Mischung auf Eis, bis sie verwendet wird.
6. Entscheidender Schritt: Entfernen Sie 190 L Überstand aus der 96-Well-Platte, die am ersten Tag vorbereitet wurde. Achten Sie sehr darauf, die Sphäroide, die sich im Boden des Brunnens gebildet haben, nicht zu stören. Verwenden Sie die Pipette in einem Winkel zur Seite, nicht in die Mitte, des Brunnens.
7. Fügen Sie jedem Brunnen vorsichtig 100 l der Kollagenmischung hinzu. Um eine Sphäroidstörung zu vermeiden, pipette die Mischung auf der Seite des Brunnens. Vermeiden Sie Blasen. Bewahren Sie die verbleibende Kollagenmischung im 20 ml-Rohr bei Raumtemperatur auf, um die Polymerisation zu bewerten.
8. Inkubationsplatte im Inkubator für mindestens 10 min, damit das Kollagen polymerisieren kann. Als Richtschnur, wenn das übrig gebliebene Kollagen gesetzt hat, halbfest und schwammartig geworden ist, sind die Sphäroide bereit, mit Inhibitor behandelt zu werden.
9. Fügen Sie die Medikamente oder Inhibitoren mit 2-facher Konzentration zum Kulturmedium hinzu. Fügen Sie das Medium sanft zu jedem Brunnen hinzu (100 l pro Brunnen). Auch hier pipette das Medium auf der Seite des Brunnens, um Sphäroidstörungen zu vermeiden.
10. Beobachten und abbilden Sie jedes Sphäroid durch Hellfeldmikroskopie zu Zeiten T = 0 h, 24 h, 48 h und 72 h, um die Drogenaktivität zu bewerten. Dann geben Sie die Platte zum Inkubator zurück.
    HINWEIS: Je nach invasivem Verhalten der Zelllinie kann ab 24 H eine Migration vom ursprünglichen Sphäroidkern beobachtet werden.

3. Herstellung von Kollagen Embedded Spheroids und Migratory Cells für die konfokale Mikroskopie

1. Legen Sie die Platte in eine Gewebekulturhaube und entfernen Sie vorsichtig den Überstand (200 l). Achten Sie auch hier darauf, das Sphäroid nicht zu stören und das Kollagen nicht zu berühren, da dies den Kollagenstecker stören kann.
2. Ersetzen Sie den Überstand durch 100 l 1x PBS. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 3x.
3. Entfernen Sie die Endwäsche und ersetzen Sie sie durch 4% Formaldehyd in 1x PBS (100 l pro Brunnen).
   ACHTUNG: Formaldehyd ist ein potentielles Karzinogen. Behandeln Sie mit Sorgfalt in Übereinstimmung mit Dengesundheits- und Sicherheitsrichtlinien.
4. Die 96-Well-Platte auf eine Laborbank legen, mit Folie abdecken und 24 h bei Raumtemperatur abstellen.
5. Entfernen Sie das Formaldehyd vorsichtig und ersetzen Sie es durch 1x PBS. Wiederholen Sie diese 1x PBS Waschen 3x.
6. Bereiten Sie 0.1% Triton X-100 in 1x PBS vor. Entfernen Sie die 1x PBS-Waschanlage und ersetzen Sie sie durch 100 l der Triton X-100-Lösung. 30 min bei Raumtemperatur inkubieren. In der Zwischenzeit die Sperrlösung mit 1x PBS und 0,05% Magermilchpulver vorbereiten und gründlich vermischen.
7. Entfernen Sie Triton X-100 und waschen Sie 3x mit 1x PBS. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l Blockierlösung hinzu und brüten Sie 15 min.
8. Verdünnen Sie den erforderlichen Primärantikörper im Sperrpuffer bei der vorgegebenen Konzentration. Verwenden Sie hier Anti-Maus-IgG-Acetylaced-Tubulin-Antikörper (1:100).
9. Zentrifugieren Sie den primären Antikörper-Blockierenden Puffermix für 5 min bei 15.682 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Blockierlösung und fügen Sie den Überstand (25 x 50 l) zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 1 h.
10. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie 3x mit 1x PBS (100 l pro Brunnen).
11. Verdünnen Sie den sekundären Antikörper im Sperrpuffer in der empfohlenen oder vorgegebenen Konzentration zusätzlich zu allen zusätzlichen fluoreszierenden Flecken. Verwenden Sie hier 1:500 Anti-Maus-Fluorophor-488 konjugierten Antikörper, Phalloidin-594 (1:500) für die Aktinfärbung und den DNA-Fleck (DAPI).
12. Wiederum zentrifugieren Sie die sekundäre Antikörperlösung für 5 min bei 13.000 U/min.
13. Entfernen Sie die Blockierlösung aus jedem Brunnen, und fügen Sie 25 x 50 L des sekundären Antikörpers/Phalloidin/DAPI-Mixes hinzu. Inkubieren Sie im Dunkeln für 1,5 h bei Raumtemperatur.
14. Sekundäre Antikörper-Farbstoff-Lösung entfernen und 3x mit 1x PBS (100 l pro Brunnen) waschen.
15. Heben Sie einzelne Kollagenstecker vorsichtig durch Absaugen mit einer Kunststoffpipette (200 l) auf die Mitte eines hochwertigen Klarglasschlittens.
16. Fügen Sie einen Tropfen eines geeigneten Mountants auf den Kollagenstecker, um sicherzustellen, dass der Stecker vollständig abgedeckt ist. Vermeiden Sie Blasen.
17. Tragen Sie den Deckelder der optimalen Dicke für das Mikroskopobjektiv auf, das für die Bildgebung verwendet wird und über Nacht eingestellt werden kann. Bewahren Sie die Dias bei Raumtemperatur im Dunkeln auf.

4. Fluoreszenzmikroskopie

1. Erfassen Sie fluoreszierende Bilder mit einem geeigneten konfokalen Mikroskop.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die dreidimensionale Sphäroidtechnologie fördert das Verständnis von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Tumoren, da sie repräsentativer für die krebsspezifische Umgebung ist. Die Erzeugung von Sphäroiden kann auf verschiedene Weise erreicht werden; in diesem Protokoll wurden 96-Well-Platten verwendet. Nach der Prüfung mehrerer Produkte verschiedener Hersteller wurden die hier verwendeten Platten ausgewählt, da sie hinsichtlich erfolgreicher Sphäroidproduktion und Homogeni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Eine neue Möglichkeit, Krebszellsphäride zur Identifizierung der migrastatischen Arzneimittelaktivität mittels hochauflösender konfokaler Mikroskopie zu erstellen, wird beschrieben. Die Verwendung von niedrig haftenden Platten gegenüber anderen Techniken, wie hängende Tropfen¹⁵, hat ein Mittel zur Erzeugung reproduzierbarer und gleichmäßiger Sphäroide für den Einsatz in der Kollagenmigration und Invasion Assays erleichtert. Die kritischen Punkte in diesem Protokoll sind die Entfernung de...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen I, rat tail, 100 mg	Corning	354236	for glioma invasion assay; this is offered by many distributors/manufacturers and will need to be determined for both the type of assay intended and cell lines used. For glioma cancer cell lines Collagen rat tail type 1 (e.g. Corning) is the preferred choice. Collagen should be stored at 4 °C, in the dark, until required. It is not advisable to mix collagen from different batches as this may affect the consistency of the polymerized collagen.
Coverslips	various	various	for microscopy imaging
DMEM powder	Sigma	D5648	needed at 5x concentration for collagen solution for glioma invasion assay;  this may be purchased in powdered form, made up in double distilled water and, depending upon final composition of the growth medium, completed with any additives required. The complete 5x solution should be filtered through a syringe filter system (0.22 μm) before use.
Foetal calf serum	Sigma	F7524-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines
Glass slides	various	various	for microscopy imaging
High glucose DMEM	Gibco	41965062	needed for cell culture of glioma cell lines
Inhibitor	Tocris	various	various - according to experimental design; inhibitors can be purchased from manufacturers such as Selleckchem and Tocris. These manufacturers offer detailed description of inhibitor characteristics, links to associated references and suggestion of working concentrations. As with all inhibitors, they may be potentially toxic and should be handled according to health and safety guidelines. Inhibitors are prepared as stock solutions as recommended by the manufacturer. As an example we used the migrastatic inhibitor MI-192 to demonstrate the use of such inhibitors. We have tested a range of migrastatic inhibitors in this way with comparable results.
Mountant	various	various	for microscopic imaging
NaOH (1 M)	various	various	NaOH can be either purchased at the required molarity or prepared from solid form. The prepared solution should be filter sterilized using a syringe filter system. One M NaOH is corrosive and care should be taken during solution preparation.
Paraformaldehyde	various	various	for fixing spheroids and cells; make up at 4%, caution health hazard, ensure that health and safety regulations are adhered to for collagen solution for invasion assay
Pastettes (graduated pipette, 3 mL)	various	various	for invasion assay, solution removal
PBS, sterile for tissue culture	Sigma	D1408-500ML	needed for cell culture of glioma cell lines and washes for staining
Pen/strep (antibiotics)	Sigma	P4333	needed for cell culture of glioma cell lines
Primary antibody, secondary antibody, DAPI, Phalloidin	various	various	there are many manufacturers for these reagents, for secondary labelled antibodies we recommend Alexa Fluor (Molecular Probes). Here we used for primary antibodies mouse anti-acetylated tubulin antibody (1/100, Abcam). For secondary antibodies we used 1/500 anti-mouse Alexa Fluor 488 conjugated antibody, Molecular Probes. For nuclear stain we used DAPI (many manufacturers) and the actin stain Phalloidin (many manufacturers) both used at recommended dilution of 1/500.
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Sodium pyruvate	Sigma	P5280	needed for collagen solution for glioma invasion assay at 5x concentration
Trypsin	Sigma	T4049	for trypsinisation
Ultra low attachment plates	Sigma/Nunc	CLS7007-24EA	for glioma invasion assay; a low adherent plate is required, with 96-well plates preferred to allow for large-scale screening of compounds under investigation. There are several low adherence plates commercially available; it is advisable to test a variety of plates for optimum spheroid generation. In our experience Costar Ultra Low Cluster with lid, round bottom, works best for the generation of spheroids from glioma cancer cells in terms of 100% spheroid formation and reproducibility. These plates were also successfully used for the generation of glioma spheroids from patient-derived material, bladder and ovarian cancer cells in our laboratory. In addition, stem or progenitor neurospheres can be used in these plates to facilitate the generation of standardized neurosphere-spheroids
Stripettes (serological pipettes, sterile, 5 mL and 10 mL)	various e.g. Costar	CLS4488-50; CLS4487-50	for tissue culture and collagen preparation
Various multichannel (50 - 250 μL) and single channel pipettes (10 μL, 50 μL, 200 μL 1 mL)	various	various	for cell and spheroid handling
Widefield microscopy	various	various	for observation of spheroid generation and spheroid imaging; here wide-field fluorescence images were captured using an EVOS FL cell imaging system (Thermo Fisher Scientific)
Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective	Zeiss	quote from manufacturer	Confocal images were captured using a Zeiss LSM 880 CLSM equipped with a Plan Apochromat 63x 1.4 NA oil objective. Diode 405nm, 458/488/514 nm argon multiline and HeNe 594nm lasers were used to excite Phalloidin 594, Alexa Fluor 488, and DAPI respectively. For each image a single representative optical section were captured, with all settings, both pre- and post-image capture, maintained for comparative purposes. All images were subsequently processed using the associated Zen imaging software and Adobe Photoshop.