Method Article
* These authors contributed equally
בפרוטוקול זה מתמונות הן את המערך האימונוולוגי והן את תנועת הפרשה המקוטב הבאה לעבר הסינפולוגית החיסונית. שערי מעלה הסלולר נוצרו בין תא הסופר-אנטיגן פעמו של ראג'י (מתנהג כמו תא אנטיגן המציג) ו שיבוט ג'ורקאט (מתנהג כמו מסייע לימפוציטים T לימפופן).
מטרת השיטה היא ליצור סינפולוגית (is), דוגמה של הקונאולוגי תא הנוצר על ידי תא אנטיגן המציג (APC) ו מסייע העוזר לימפוציטים (Th) תא, ו להקליט את התמונות המתאימות לשלבים הראשונים של ה הוא היווצרות ואירועים הסחר הבאים (המתרחשים הן בנגמ ו בתא Th). אירועים אלה יובילו בסופו של דבר לפרשה מקוטבית ב-IS. בפרוטוקול זה, התאים ג'ורקאט התיגר עם בידור של סטיילוקוקוס E (ראה)-פעמו תאים כמודל תא סינפסה היה בשימוש, בגלל הקירבה של המערכת הניסיונית הזאת למציאות הביולוגית (Th תא-APC השערים הסינפטית). הגישה המוצגת כאן כוללת הקוניוגתא אל התא, רכישת זמן, רכישה, מיקרוסקופ פלואורסצטור רחב (WFFM) ואחריו עיבוד תמונה (לאחר הרכישה פירוק). זה משפר את היחס אות לרעש (SNR) של התמונות, משפר את הרזולוציה הטמפורלית, מאפשר את הרכישה מסונכרן של מספר fluorochromes המתעוררים השערים סינפטיות ומקטין הלבנת זריחה. בנוסף, הפרוטוקול הוא מותאם היטב עם נקודת הקצה פרוטוקולים הקיבעון תא (פאראפורמלדהיד, אצטון או מתנול), אשר יאפשרו החיסונית נוספת של כתמים וניתוחים. פרוטוקול זה תואם גם עם מיקרוסקופ מיקוד לייזר (LSCM) וטכניקות אחרות של מיקרוסקופ חדיש. כמו אזהרה הראשי, רק אלה הגבולות תא T-APC (המכונה ממשקים) שהיו בדיוק 90 ° זווית למישור המוקד לאורך ציר Z יכול להיות מדומה ומנותח כראוי. מודלים ניסיוניים אחרים קיימים המקלים על הדמיה בממד Z ובניתוח התמונה שלהלן, אך גישות אלה אינן מחקות את המשטח המורכב והלא סדיר של APC, ועשויים לקדם אינטראקציות לא פיזיולוגיות ב-IS. לפיכך, הגישה הניסיונית המשמשת כאן מתאימה להתרבות ולהתמודדות עם כמה מורכבויות ביולוגיות המתרחשות ב-IS.
המטרה העיקרית של השיטה היא ליצור הסינפולוגית (IS) תא אל התא שערים שנוצרו על ידי תא אנטיגן המציג (APC) פעמו עם ראה superantigens ו מהווה מבנה של תא, ולרשום את התמונות המתאימות לשלבים הראשונים של היווצרות הסינפולוגית ואירועי הסחר הבאים (המתרחשים גם בנגמ ש ובתא Th), שבסופו של דבר יוביל לפרשה מקוטמת ב-IS. הקמתה של הוא על ידי לימפוציטים על הכריכה של קולטן התא שלהם (tcr) כדי אנטיגנים המאוגדים mhc-II על הנגמ מארגנת מופע דינמי מאוד, נזיל וקריטי מעורב אנטיגן ספציפי, הומוסר הסלולר תגובות החיסון1,2. Is מוגדר על ידי היווצרות של מורכבים סופרא מולקולרית ולקולרית הפעלה מורכבת (smac) דפוס המאופיינת בתהליך התארגנות מחודש3. בבנייה על ידי לימפוציטים T עם APC, הקיטוב של הסוד ושלפוחיות לקראת הוא נראה מעורב הפרשה מקוטב בפער סינפטית. מכונות ממוקדות זה נראה בלתי פוסק לספק את המערכת החיסונית עם התכסיס מוסדר להפליא כדי לשפר את היעילות של תפקידים הפרשה קריטית של לימפוציטים T, תוך הפחתת לא ספציפי, cytokine-בוררויות הגירוי של תאים העובר, הריגת תאייעד לא רלוונטייםהתאבדות האפוטוטית באמצעות מוות תאים ההפעלה המושרה (
התוצאה של IS משתנה על אופיו של לימפוציט T ו APC. המגע הסינפטית של תאים Th (בדרך כלל CD4 + תאים) עם APC מציג אנטיגן משויך MHC-II מייצרת את ההפעלה של התא T (הפרשה cy, התפשטות, וכו ') ו, במקרים מסוימים, אפופטוזיס באמצעות AICD4. עבור לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTLs) (בעיקר CD8 + תאים) אינטראקציה עם ה-APC הצגת אנטיגן המשויכים MHC-I, התוצאה שונה על גירוי מראש או לא של ה-CTLs עם אנטיגן. לפיכך, ה-CTLs התמים מזהה אנטיגן-MHC-I מתחמים על APC הם "מוכן" כדי להרוס את תאי היעד ואת הפער. בנוסף להקים את הסינפסות עם תאי היעד (כלומר, תאים הנגועים בווירוסים או בתאי גידול) בהפקת השמדה תא ספציפית אנטיגן5,6.
הפרשה המקוטמת של האקזומים בסינפולוגית היא אזור פיתוח ומאתגר של מחקר המעורב בתגובות החיסון הרלוונטיות7. זה הוכח כי גופים multivesicular (mvb) נושאת intraluminal ושלפוחיות (ilvs) ניסיון התחבורה מקוטב לקראת IS8,9 (וידאו 1) על גירוי tcr עם אנטיגן. המיזוג של אלה mvb בקרום סינפטית מעורר שלהם degranulation ושחרורו של ilvs כמו אקסוזומים על שסוע סינפטית8,10. זה מתרחש בנוי על ידי ה-סוג התאים ג'ורקאט שהיו מאותגרים עם ראה superantigen מצופה תאים ראג'י מתנהג כמו APC11, tcr-מגורה CD4+ Lymphoblasts, ו-ctls מוכן. לפיכך, הסינפסות שנעשו על ידי התאים הג'ורקאט מהווים מודל חשוב לחקר התנועה הפרשה המקוטב של אקסוזומים. בנוסף, מספר עשורים של חקירה הראו כי תובנות בסיסיות רבות לתוך איתות TCR הגיעו מחקרים עם קווי T-cell השתנה, ואכן הידוע ביותר של מערכות אלה מודל הוא לוקמיה בבית T-cell קו12.
היווצרות של מפותחת מייצרת מספר תוצאות ביולוגיות מכריע, כולל הפעלת תאים Th, הפעלה של CTLs נאיבי או להרוג תא היעד על ידי מוכן, מלבד anergy או AICD5. לכן, ישנם שני סוגים עיקריים של הפרשה הוקמה על ידי לימפוציטים T כי התוצאה מגוונת מאוד, אבל באופן דומה, החיסונית מתפקדת פונקציות1,6,13. מצד אחד, הוא מ לימפוציטים T מטוציטוטית (CTLs) מעורר קיטוב מהיר (החל משניות עד כמה דקות) של גרגירים ליטיים (נקרא "הפרשה ליזוזומים") לקראת IS. הדגרציות של הגרגירים הליטיים מעורר את הפרשת הנקבים ואת הגרזיזים לחריץ הסינפטית14, שהם מולקולות פרו-אפוטוטיות. הניקובים המופרשים והגרזים לאחר מכן יגרמו להרג של תאי היעד15,16. , לאורך מספר דקות בלבד. כאשר תאי המטרה נרצחים3,17 זה כנראה בגלל הנסיבות כי המשימה האופטימלית של CTL דורש קשר מהיר וזמני על מנת להפיץ כמו שביתות קטלני רבים ככל האפשר לתאי יעד רבים3,17. לעומת זאת, לימפוציטים Th כגון תאים של ג'ורקאט ליצור יציב, ארוך עומד הוא (מ 10-30 דקות עד שעות), שכן זה נראה הכרחי הן הפרשה כיוונית ובלתי פוסקת של מגרה ציטוקינים3,17. ציטוקינים הם גם מוקפים הפרשה שלפוחיות וחלקם (כלומר, IL-2, IFN-γ) ניסיון הובלה מקוטב ל17 והפרשה. אחד המאפיינים החיוניים של IS היא היווצרות של הקשר גישוש, חלש וחולף בין התא T ו APC (וידאו 1) אשר עשוי לייצר אינטראקציה חזקה יותר הקמתה של בוגרת, מתן כי tcr מזהה את מתחמי אנטיגן-mhc המתאים ושיתוף התקשרויות שכונתיות מבוססים5. הן ההתחלה של המגעים הראשוניים והקמתה של בוגרת, פרודוקטיבי לחלוטין, הם תהליכים סטוכסטיים, מהירים ואסינכרוניים מיסודם5,18. יתרה מזאת, יש תדר נדיר ביצירת שערי מעלה תא אל התא19, אשר עשוי להוות אתגר עבור טכניקות הדמיה (עיין בסעיפים תוצאות ודיון).
אתגר עיקרי נוסף בבדיקת הקיטוב של מרכז המיקרו-כדורית (MTOC) וגרגרי הפרשה ב לימפוציטים T הוא כי התהליך כולו הוא מהיר (שניות עד כמה דקות), במיוחד ב-CTLs. בהתחשב בעובדות האלה, הגישות המוקדמות ביותר להתמודד עם נקודת קצה אסטרטגיה שבה APC/היעד תאים לימפוציטים T מעורבים במשותף והתכנס על ידי מהירות נמוכה צנטריפוגה, כדי לטובת היצירה המשלים תא לתא, מודב במשך כמה דקות, קבוע ולאחר מכן הוערך עבור העתקת MTOC ו/או הפרשת שלפוחיות לעבר IS20. גישה זו יש שתי מגבלות משמעותיות: לא הושגו נתונים הסחר התוסס ורמות גבוהות של רקע mtoc/הפרשה בגרגרים קיטוב הושגו, כנראה בשל האופי סטוכסטי של הקמתה18. יתר על כן, כל מתאם בין tcr-מגורה, הראשונית האירועים איתות (כלומר, הסידן תאיים עולה, אקטין התארגנות מארגון) ו שלפוחית הסוד קיטוב הוא בעייתי לחקור. לפיכך, הוראות הכרחי לדימות מתאים של ה-it בתאי החיים משתלבים כדי לשפר את החומריות התא לתאים, כדי לסנכרן את הדור של IS ו, במידת האפשר, כדי להבטיח את הקמתה של שערי מעלה הסלולר במיקרוסקופ מוגדר XY שדות ו Z תנוחות. מספר אסטרטגיות פותחו על מנת למנוע את כל הבעיות הללו. זה מחוץ לטווח של הנייר הזה כדי להסביר את השיטות האלה, היתרונות שלהם ואת החולשות. עיין בסקירות שפורסמו בעבר בהתמודדות עם נקודות חשובות אלה1,4,5,21.
העובדה כי הוא עשה על ידי לימפוציטים לאורך זמן, ואת הנסיבות כי ב לימפוציטים Th MTOC, lymphokine-המכיל בגרגרים הפרשה MTOC לקחת מתוך כמה דקות עד שעות כדי לעבור ולעגן את זה22 עושה את TH-APC הוא מועמד אידיאלי לדימות באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן.
1. הכנת שקופיות כדי לדבוק תאים ראג'י
2. הדבקת תאים של ראג'י לשקופיות קאמרית ו -7-אמינו 4-כלורומארין (CMAC) תיוג
3. דופק CMAC — שכותרתו תאים ראג'י עם סטייללוקוקו בידור E
4. הכנת התאים הג'ורקאט
5. שיתוף משותף של ראג'י וג'ורקאט תאים
6. פקיעה בזמן הדמיה של שערי מעלה סינפטית המתעוררים
7. נקודת קצה היווצרות של שערי מעלה סינפטית וקיבעון
8. עיבוד תמונה
עקבנו אחר הפרוטוקול המתואר כדי ליצור את העיר החיסונית של ג'ורקאט-ראג'י ולדמות כראוי את השלבים המוקדמים של היווצרות. המטרה שלנו היתה לשפר את הגישות המוקדמות20 בעבר ללמוד את הקיטוב של mtoc ואת מכונות הפרשה לקראת IS. גישות אלה התבססו על האסטרטגיה נקודת הסיום, כי לא אפשרו הדמיה של היווצרות היא או האירועים הראשונים סינפטיות, מאז באסטרטגיות אלה החלה היווצרות החובה על הגלולה של תאים מעורבים, centrifuged, אבל לא על מיקרוסקופ. הפרוטוקול שלנו נועד למנוע את האזהרה העיקרית הזאת, מאז הגישה התבססה על השימוש בריכוז התא המתאים (שלבים 2 ו-3), כדי להעדיף את היווצרות של תא אל התא הוא מעלה השערים על שקופיות החדר מיקרוסקופ משלו (8 מיקרו היטב שקופית קאמרית), רכוב על החממה מחומם מראש אסטרטגיה זו מעוררת את היווצרות, במקביל ללכידת ההדמיה בזמן (וידאו 1).
איור 1 מייצג את מצופני המוח הסינפטיים-ראג'י שהושגו בעקבות הפרוטוקול (שלב 5.2). התמונה מייצגת את המסגרת הראשונה מניסוי של נציג, מעידה בזמן. 2 x 105 תאים ראג'י ו 2 x 105 תאים ג'ורקאט נוספו 1 ס מ2 טוב. החלונית העליונה מציגה ערוץ המעבר, הפאנל האמצעי מורכב מערוץ CMAC (כחול) (תאים של ראג'י), והחלונית התחתונה מציגה גם השראות וערוצים ממוזגים של CMAC. חיצים צהובים לתייג כמה שערים סינפטית, כהתייחסות, ואילו חיצים ירוקים מצביעים על שערי מראות סינפטית שנעשו על ידי תא אחד של ג'ורקאט ומספר תאים של ראג'י (שערי מעלה מורכבים). הפחתת ריכוזי תאים (10 או פחות תאים ב 1 ס מ2 טוב) יהיה לעקוף את היווצרות של שערי מעלה מורכבים הסלולר, אבל לא יכול להיות מספיק תא מעלה שערי לניתוח העוקבים של התנועה מקוטב (ראה להלן), כי בתורו תפחית גם את הסיכויים למצוא ולדמות המתעוררים מעלה המוח.
איור 2 מייצג צילומי מסך המתאימים לפרמטרים הדמיה המשמשים לכידת סימולטני של שני fluorochromes שונים (cmac ו-GFP-CD63) באמצעות התוכנה המתאימה (כלומר, ניקון NIS_AR) בניסוי הפקיעה זמן נציג המתאים וידאו 1.
וידאו 1 (סינפסות אימונולוגיים, raw) מייצג לימפוציטים לימפוציט T ביטוי GFP-CD63 (סמן של גופים מרובים-mvb, ירוק ושלפוחיות) והיווצרות סינפסה כפולה בין תא 1 ג'ורקט ו-2 התאים ראג'י מתויג עם cmac, בכחול (אחד מהם עובר שתבלע). התנועה הסימולטני של MVB בתוך התא של ג'ורקאט לכיוון שטחים הסינפסה נרשמה (לכידת שיעור מסגרת = 1 מסגרת כל 20 שניות עבור GFP-CD63; שכפול וידאו מהירות = 2 מסגרות לכל s). שערי המוח הסינפטית הושגו והדמיה בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל (שלב 6.2), אשר איפשר הדמיה של סינפסות המתעוררים (וידאו 1). הלכידה הסימולטנית הן של GFP-CD63 והן ערוצי הזריחה של CMAC בוצעו באמצעות תוכנה מתאימה (כלומר, ש"ח-AR, טבלת חומרים). הסרטון מייצג את הנתונים הגולמיים מתוך ניסוי של נציג, מעידה בזמן. מערכת המיקוד האוטומטי הוגדרה עם היסט מתאים ביחס לתאי ראג'י המאוגדים לתחתית הזכוכית, כדי להבטיח מיקוד יציב לאורך הניסוי.
וידאו 2 (הסינפסות החיסונית, לאחר הפירוק) מתאים וידאו 1, אבל הפירוק של תמונות ערוץ הזריחה gfp-CD63 בוצע על ידי שימוש בתוכנה מתאימה לפירוק (כלומר, huygens), באמצעות "שדה רחב" אופציה אופטית ופרמטרים אופטיים נכונה (שלב 8). הערוץ הגולמי ממוזג לאחר מכן ל-CMAC, ערוץ raw. השיפור של יחס אות לרעש וחדות התמונה ניכר. הפירוק בוצע לאחר הרכישה, כמתואר לעיל. לפרטים ספציפיים לגבי תוכנת הפירוק נא להפנות ל-4.
וידאו 3 (סינפולוגית, לאחר תיקון ו immunofluorescence כתמים) מייצג z-מחסנית (גודל z-שלב = 0.8 μm, 5 מסגרות) של קבוע הוא המשלים לאחר שלב 6 של הפרוטוקול (אצטון קיבעון). לאחר קיבעון, immunofluorescence בוצע בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים25 באמצעות Phalloidin כדי להמחיש את F-actin (ירוק), ANTI-CD63 כדי להמחיש mvb (מגנטה), anti-γ-טובולין להמחיש mvb (אדום). CMAC (כחול) מתייג את התא ראג'י. לאחר מכן המשלים היה התמונה על ידי epiפלואורסצנטית ומספר ערוצים לפירוק באמצעות "שדה רחב" אופציה אופטית הפרמטרים האופטיים הנכונים (שלב 7). הערוצים לפירוק מוזגו לאחר מכן ל-CMAC, ערוץ raw, כפי שמצוין בפאנלים השונים (CMAC בתוספת מעבר מעבר-טרנס, cmac פלוס Phallodin, CMAC פלוס anti-CD63 ו-CMAC פלוס anti-γ-טובולין, בהתאמה). החץ הלבן מתייג את הסינפסה, ואילו החץ הירוק מתייג את ה-MVB ואת החץ הצהוב מתייג את MVB. הקוונפיקציה מפורטת של mvb ו mvb קיטוב הוסבר במקום אחר25.
הגישה המוצגת כאן כרוכה בהיווצרות שערי מעלה תא אל התא, ובמקביל, רכישת הזמן השגה על ידי המיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב (WFFM) ואחריו עיבוד תמונה (לאחר הרכישה מפרק). טקטיקה זו שיפרה את היחס אות לרעש (SNR) של התמונות, הגדילו את הרזולוציה הטמפורלית שלהם, ואיפשר את הרכישה מסונכרן של מספר fluorochromes ב המתעוררים השערים סינפטית4. בנוסף, הפרוטוקול הוא מותאם היטב עם שיטות קיבעון הסופי של תא הקצה (פאראפורמלדהיד, אצטון או מתנול), אשר יאפשרו החיסונית נוספת של כתמים וניתוחים25 (וידאו 3). פרוטוקול זה תואם גם עם מיקרוסקופ מיקוד לייזר וטכניקות אחרות של מיקרוסקופ חדיש.
איור 1: שדה מיקרוסקופ בגודל כפול של שערים סינפטית. התמונה מייצגת את המסגרת הראשונה מתוך ניסוי של נציג, מעידה בזמן שלאחר הפרוטוקול. הלוח העליון מציג את הערוץ המעבר, ערוץ CMAC האמצעי (תאים ראג'י) והלוח התחתון שני הערוצים הממוזגים. חיצים צהובים לסמן כמה שערים סינפטית, כהפניה. החצים הירוקים מציינים שערי מעלה סינפטית מורכבים (כלומר, תא אחד של ג'ורקאט הקמת הסינפסות עם יותר מתא ראג'י אחד). שנתפסו עם מטרה 40x EWD (0.6 NA). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הגדרות מיקרוסקופ זמן פקיעה. התמונה מתאימה כמה צילומי מסך המתאימים לפרמטרים הדמיה המשמשים לכידת סימולטני של שני fluorochromes שונים (CMAC ו-GFP-CD63) באמצעות התוכנה המתאימה (כלומר, ניקון NIS_AR) בניסוי הפקיעה זמן נציג המתאים וידאו 1. כל מסגרת עבור ערוץ GFP-CD63 נלכד כל 20 s. רק מסגרת אחת עבור ערוץ UV מתוך שמונה מסגרות עבור ערוץ GFP נלכד על מנת לשמור על הכדאיות התאית לאורך הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: סינפסות אימונולוגיים שנעשו על ידי תא של ג'ורקט ביטוי GFP-CD63, נתונים גולמיים. התאים ראג'י B מתויג עם מעקב תאים כחול (CMAC, כחול) היו פעמו עם לראות עבור 30 דקות ו הסינפסות עם תאים וכיוקאט ביטוי GFP-CD638 נוצרו. זמן הכשלים המתאימים GFP-CD63 וערוצי CMAC נתפסו (20 s לכל מסגרת; שכפול וידאו מהירות = 2 מסגרות לכל s) ודוגמה ייצוגית מוצג. שנתפסו עם מטרת התוכנית 60x (1.4 NA). אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו 2: סינפסות אימונולוגיים שנעשו על ידי תא של ג'ורקט ביטוי GFP-CD63, לאחר הפירוק. כמו וידאו 1, אבל תמונות היו לפרק באמצעות תוכנה לפירוק. היחס המשופר של האות לרעש והחדות המשופרת, עקב חיסול מזהם האור של הזריחה, ניכר. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
וידאו 3: סינפולוגית קבועה ומוכתמת חיסונית. התמונה מציגה את המשלים של הסינפטיות קבוע לאחר שלב 7 של הפרוטוקול ובעקבות immunofluorescence הבאים. CMAC (כחול) תוויות התאים ראג'י, מעבר (טרנס) כדי להראות את המשלים סינפטית (חץ לבן), תוויות Phalloidin (ירוק), anti-CD63 תוויות MVB (מגנטה, החץ הירוק) ו anti-γ-טובולין תוויות MVB (אדום, חץ צהוב), בהתאמה. ערוצים אלה התעברו על ידי אפיטנטית, התמזגו ומוזגו כמצוין. הווידאו כולל Z-מחסנית (גודל z-שלב = 0.8 μm, 5 מסגרות). החץ הלבן מתייג את אזור יצירת הקשר הסינפטית, ואילו החץ הירוק מתייג את MVB ואת החץ הצהוב מתייג את MVB. אנא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
הגבלה של פרוטוקול זה היא כי לא כל הסינפסות יהיה מונחה באופן אידיאלי בניצב לציר האופטי. באמצעות טכניקה זו, אין דרך לנבא ו/או להשפיע על האוריינטציה האידיאלית הדמיה החיסון החיסונית. כדי לפתור בעיה זו, אנו לא לכלול את הניתוחים הבאים כל הסינפסות שנתפסו באופן אקראי, כי לבסוף לא למלא את הקריטריונים האידיאליים. הסינפסות האלה, בלתי מספיקים, אינן תכופות במיוחד. עם זאת, ניתן לעקוף מגבלה זו באמצעות מספר גישות נסיוניות4.
שחרור מקוטב CD63 (degranulation) ניתן לכמת על ידי טכניקות משלימות אחרות כגון משטח התא כתמים של CD63 (CD63 מחדש לפני השטח התא) בתאי החיים (לא קבוע ולא חדיר), לאחר שלב 6, והכביסה הבאים וקיבוע, כפי שהוצג בעבר8. בנוסף, CD63 שחרור על אקסוזומים8,9 ו אקפי כימות על ידי ניתוח ננו-חלקיק מעקב9,25 ניתן לבצע. גישות אלה מתאימות בהחלט עם הפרוטוקול שלנו, סיפק קיבעון מבוצעת לאחר משטח התא מאימונוoforof תאים חיים.
מצאנו את המספר האידיאלי של תאים (עבור 1 ס מ2 גם בשקופית קאמרית 8-היטב) הוא 4 x 105 תאים (2 x 105 תאים ראג'י ו-2 x 105 התאים האלה) מאז הם לדבוק ביעילות בתחתית הבאר. מאגד יעילות פלסטיק (באמצעות fibronectin), או בתחתית הזכוכית (באמצעות פולי-L-ליזין) מיקרושקופיות אינה בדרך כלל בעיה. מספרי תאים גבוהים יותר עלולים ליצור מרווחים בין התאים הדבקו, ולאחר מכן לאחר מכן, לאחר מכן, בעלי מעלה סינפטית מורכבים (איור 1); שני המצבים אינם רצויים כאשר שערי מעלה בודדים של תא לתאים צריכים להיות מותמונות ב-, למשל, MTOC או הפרשה החוצה ניסויים בקיטוב. מספר נמוך יותר של תאים עלול להקטין את הסיכוי למצוא שערי מעלה, במיוחד כאשר התאים האחרים בתאי הכניסה מאותגרים עם APC ליצור הסינפסות. שימו לב כי הבחנו כי הטמפרטורה התייצב בשלב החממה במקום על המיקרוסקופ X/Y שלב לפני תחילת הפרוטוקול (כלומר, 1-2 h מראש כדי לייצב את השלב/מיקרוסקופ ההתקנה) שומר יציב X, Y, הפרמטרים Z, אשר חיוני הדמיה נכונה. מערכת המיקוד האוטומטי תפצה בסופו של דבר וריאציות קטנות של Z.
כשטכניקות מסוימות של התמרה גנטית כגון אלקטרופורציה משמשות לבטא חלבונים מסוג פלורסנט (כלומר, GFP-CD63) במשובטים ג'ורקאט (וידאו 1), חלק ניכר של התאים עלול למות לאחר אלקטרופורציה. זו יכולה להיות בעיה, כי למרות תאים מתים לא יוצרים הסינפסות, כאשר הם מיותרים על החיים, התאים מזוהמים, הם עלולים להפריע להיווצרות שערים שנעשו על ידי חיים Th תאים. מצאנו כי חיסול זהיר של תאים מתים מתרבויות מעלה באמצעות צפיפות בינוני הדרגתי בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים לפני שלב היווצרות המשלים יכול באמת להגדיל את הסיכויים התמונה כראוי השערים. בנוסף, יעילות הזיהום הנמוך (< 20%) יכול להיות אזהרה חשובה מאז זה, בשילוב עם יעילות היווצרות המשלים מתון (בסביבות60%),תפחית את ההסתברות למצוא שערי מעלה שנעשו על ידי תאים מזוהמים. זו אינה בעיה כאשר תאים לא מבוקר משמשים כדי להשיג שערי מעלה בניסויים נקודת סיום הקיבעון העוקב. שמונה השקופיות בחדר המיקרוגל תואמות. לפרוטוקולי אימונולוורנציה קונבנציונליים פעולה זו מגבירה את הגמישות של הפרוטוקול הנ ל במטרות שונות. קיבעון עם אצטון יכול להיות בעיה לשקול בעת שימוש שקופיות קאמרית עם בארות התחתון פלסטיק. עם זאת, יש מסחרית זמינים 8 מיקרוסקופ למיקרוגל קאמרית המכילים שבחרת זכוכית, אשר תואמים אצטון קיבוע. להסיר מכסים פלסטיים כאשר אצטון משמש כדי לתקן את התאים המתורבת 8 שקופיות בחדר בתחתית זכוכית המיקרוגל.
מומלץ כי המיקרוסקופ מצויד בשלב XY ממונע, ממונע מנועי הצריח ומיקוד המוקד אוטומטי (g., מערכת המוקד מושלמת) או תוספי מקבילה. כאשר יש צורך ברכישה מרובת היטב25, מערכת המיקוד האוטומטית תבטיח מיקוד יציב לאורך כל הניסוי. ניסיון קודם מציין כי על ידי הקמת היסט מיקוד מתאים על התאים ראג'י, הן התנועה של תאי T (וידאו 1) ואת התנועות מיקרוסקופ שלב/שקופית קאמרית בניסויים מרובת נקודות, ניתן לפצות. זה אכן נוח עבור לכידת זמן רב היטב לכידה.
שחור ולבן, כרומטית ומקורר טעונה מצמידים המכשיר (CDD) מצלמה שימש אך גבוהה רגישות, מדעית המשלים מתכת תחמוצת מוליכים למחצה (sCMOS) מצלמה רצוי, מאז זה יהיה להקטין את החשיפה מצלמה פעמים ולשפר את הרזולוציה הטמפורלית. המצלמה קצר חשיפה פעמים השתמשנו (טופס הדירוג 100 ms ל 500 ms) בשילוב עם תריס הזריחה אוטומטי מאפשר לכידת זמן ממושך (עד 24 שעות) עם רזולוציית זמן נאותה (1 מסגרת לדקה או פחות, עבור עד 16 משרות XY) ללא הלבנת זריחה משמעותית ו/או אובדן של הכדאיות התא. השלב המונע מאפשר מרובת נקודות (XY) ומגדיל את ההזדמנות למצוא ולדמות את הסינפסות המתפתחת והמתפתחת באוריינטציה האידיאלית, אך גם מתיר רכישת תמונה בשקופיות קאמרית מרובות כאשר שיבוטים שונים של ג'ורקאט צריכים להיות מצוקים בו25. מפתח מספרי גבוה של המטרה (כלומר 60x, 1.4) הוא הכרחי על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר בעת ניתוח התנועה של בגרגרים הפרשה.
ראג'י-ראה-ג'ורקאט מהווה מודל סינפולוגית מבוסס היטב, ששימש מספר רב של חוקרים מאז שתוארה במקור11. התאמתי את הפרוטוקול שלנו למודל זה כדי לדמות כראוי את השלבים המוקדמים של היווצרות. המטרה שלנו היתה לשפר את הגישות המוקדמות20 בעבר ללמוד את הקיטוב של mtoc ואת מכונות הפרשה לקראת IS. זה מדהים כי שערי הבצובות עשה עם פרוטוקול זה לייצר F-actin התארגנות מחודש בסינפסה, הגדרת SMAC קאנוני, במקביל לתנועה מקוטב MVB25. האירועים הקריטיים הללו נותחו ואומתו על ידי המיקרוסקופיה הקונפוקלית25.
הבדלים קינטי בתנועה מקוטב קיימים בין סוגים שונים של IS. לדוגמה, הובלה מקוטנת של גרגרי לטיק מ-CTLs מתקיימת בתוך שניות או דקות ספורות בלבד, בעוד שמספר ציטוקין המכיל שלפוחיות מתוך לימפוציטים של Th מגיע מדקות עד מספר שעות עד לסיום. וני הזמני הזה יש לקחת בחשבון מראש, על מנת לעצב את האסטרטגיה הטובה ביותר כדי לבחור את הגישה המתאימה ביותר ניסיוני והדמיה, מאז כמה תחבולות הדמיה (כלומר, סריקת לייזר קונפוקלית יקרוסקופית מיקרוסקופ (lscm)), הזמן יכול להיות גורם מגביל מאז הזמן ללכוד הוא הרבה יותר גבוה אין זו מגבלה כאשר מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית (WFFM) משמש כמתואר בפרוטוקול לעיל. מאז ב-ctls, הקיטוב של mtoc לכיוון הסינפסה נמשך רק כמה דקות3,6,17, מדינה ספציפית מגוונת של מיקרוסקופ אמנות גישות שונות שתוארו כאן (אך מחסה מרחבית גבוהה יותר הרזולוציה הטמפורלית) נחוצים כדי לדמות נכונה התמונה האלה סינפסות26,27, בעיקר כאשר מספר שדות מיקרוסקופ ( אלה ברזולוציה גבוהה, גישות חדשות יכול להיות מנוצל גם עבור הדמיה של הסינפסות שנעשו על ידי לימפוציטים Th, אם כי חסכוני ו/או לוגיסטי סיבות (כלומר, ציוד הליבה הנדרש עבור חלק מטכניקות אלה הדמיה עלויות 6-7 פעמים יותר מאשר המתואר כאן) יכול בהחלט להוות מגבלה עבור המצב הזה של שיטות דימות אמנות4 העובדה כי הוא עשה על ידי לימפוציטים לאורך זמן, ואת הנסיבות כי ב לימפוציטים ה-MTOC, lymphokine המכיל הסוד שלפוחיות ו MTOC לקחת מתוך מספר דקות עד שעות הובלה לעגן את זה22, עושה את הפרוטוקול הזה אידיאלי, גישה במחיר נוח עבור הדמיה TH-APC הוא.
WFFM בשילוב עם פירוק תמונה לאחר הרכישה מהווה גישה מעניינת ולא רק סיבות כלכליות תומכות באסטרטגיה זו. הרזולוציה הירודה הפנימית בציר Z (האזהרה החשובה ביותר של הטכניקה) ניתן לשפר באמצעות התמונה שלאחר הרכישה מפרק4 (השוואת וידאו 1 עם וידאו 2). התהליך משתמש בגישה מבוססת חישוב, עיבוד תמונה שיכול לשפר את יחס הרעש ואת רזולוציית התמונה וניגודיות27 עד 2 פעמים, עד 150-100 ננומטר בציר XY ו 500 nm בציר Z4.
השימוש ברגישות גבוהה יותר, מהירות בדיקה גבוהה וטווח דינמי רחב, מצלמות חדשות של הזריחה sCMOS ישפרו את איכות התמונות תפחית את הלבנת הזריחה. הגמישות המוצעת על-ידי הפרוטוקול של התא לתאים המתואר כאן מאפשרת את השילוב של הגישה הסלולרית המתוארת עם מספר מצבים של טכניקות מיקרוסקופ אמנות, הן בתאי החיים אלא גם בתאים קבועים, והתוצאה הצפויה בהחלט ישפרו את הידע שלנו על הסינפולוגית החיסונית.
למרות שיושמו ובתוקף את הפרוטוקול באמצעות קל לטפל, קווי תא מבוססת, פוטנציאל הגישה עשויה לאפשר ויזואליזציה של אינטראקציות פיזיולוגיות יותר כאשר התאים הראשוניים T וסוגים שונים של תאים אנטיגן הצגת (כגון תאים דנדריטים של מקרופאגים) משמשים5. בהקשר זה, פרוטוקול זה הורחב גם ואומת על ידי שימוש סופר אנטיגן (סאב)-פעמו עכבר אל 4 קו התא המשמש APC, כדי לאתגר את העכבר הראשי T lymphoblasts9. אכן, לימפוציטים הראשי T, CTLs בפרט, מעובד יותר קצר-חי ודינמי הקשר הסינפטית (ראה וידאו משלים 8 בהפניה9) לאלה שנראו עם המודל ראה-ראג'י וג'ורקאט. השונות של מצבי קשר סינפטית ניתן לראות הטוב ביותר עבור אינטראקציות T-cell הראשי עם תאים דנדריטים או B בתאי דו מימדי של רקמות שווי מבחנה שניתן גם להקליט ונותחו באמצעות פרוטוקול זה. בנוסף, מלבד superantigens, הטכניקה יכולה לשמש לתמונה סוגים אחרים של הסינפסות. למשל, זה יכול לשמש tcr transgenic, אנטיגן ספציפי מודל תא T, למשל באמצעות אובלבומין ספציפי מורטין OT1/OT2 מערכת או על ידי העברה של תאים t עם קולטנים ייחודיים לאנטיגן t תאים. הדבר פותח מספר רב של אפשרויות נסיוניות לעתיד הקרוב.
המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים
אנו מכירים בכל העבר והנוכחים במעבדה על תרומתם הנדיבה. עבודה זו הייתה נתמכת על ידי מענקים מMinisterio הספרדית דה אקונוניה התחרות אבא (MINECO), תוכנית הלאומי של המחקר (SAF2016-77561-R כדי מ, אשר היה בחלקו הוענק עם מימון פדר-EC). אנו מכירים בפסולטד דה מדיטינה (UAM) ובחלק האמצעי לתמיכה ולמתקנים הניתנים להפקת הווידאו. אנו מכירים בחברת NIKON-Europe לתמיכה טכנית רציפה ועיונית מעולה. גישה חופשית למאמר זה ממומנת על ידי ניקון.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software Image J | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved