Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
В этом протоколе образуется как иммунологическое синапсовое образование, так и последующий поляризованный секреторный трафик в сторону иммунологического синапса. Сотовые конъюгаты были сформированы между суперантиген-пульсированной клеткой Раджи (действуя как антиген-представляя клетка) и клоном Jurkat (действуя в качестве эффектора-помощника Т-лимфоцитов).
Целью метода является создание иммунологического синапса (ИС), пример ассоциирования клеток к клетке, образованной антигенообразующей клеткой (APC) и эффективным помощником T-лимфоцитов (Т) и записи изображений, соответствующих первым стадиям Формирование ИГ и последующие события, связанные с торговлей людьми (происходящие как в БТР, так и в ячейке Th). Эти события в конечном итоге приведут к поляризованной секреции в ИГ. В этом протоколе, клетки Jurkat оспаривается с стафилококкэн энтеротоксин Е (SEE)-импульсные клетки Раджи, как модель синапса клетки был использован, из-за близости этой экспериментальной системы к биологической реальности (Th cell-APC синаптических конъюгированных). Представленный здесь подход включает в себя спряжение от клеток к клетке, приобретение покадровой промежутки, широкополевую флуоресценционную микроскопию (WFFM), за которым следует обработка изображений (после приобретения деконволюции). Это улучшает соотношение сигнала к шуму (SNR) изображений, улучшает временное разрешение, позволяет синхронизировать приобретение нескольких фторхромов в возникающих синапических конъюгированных и уменьшает отбеливание флуоресценции. Кроме того, протокол хорошо сочетается с протоколами фиксации конечных ячеек (параформальдегид, ацетон или метанол), что позволит дополнительно оформить и анализировать иммунофлуоресценцию. Этот протокол также совместим с лазерной сканирующей конфокальной микроскопией (LSCM) и другими самыми современными методами микроскопии. В качестве основного предостережения, только те T-ячейки-APC границ (так называемые интерфейсы IS), которые были на правом 90 "угол фокус плоскости вдоль оси может быть правильно отображаются и проанализированы. Существуют и другие экспериментальные модели, которые упрощают визуализацию в измерении и следующий анализ изображений, но эти подходы не эмулируют сложную нерегулярную поверхность БТР и могут способствовать нефизиологическому взаимодействию в ИС. Таким образом, экспериментальный подход, используемый здесь, подходит для воспроизведения и противостояния некоторым биологическим сложностям, возникающим в ИГ.
Основной целью метода является создание иммунологических синапсов (ИС) конъюгированных клеток к клетке, образованной антиген-представляя клеткой (APC), импульсной с суперантигенами SEE и эффектором Th-клеток, и регистрировать изображения, соответствующие первым стадиям формирования иммунологического синапса и последующих событий, связанных с торговлей людьми (происходящих как в APC, так и в Т.К.), что в конечном итоге приведет к поляризации. Создание IS Т-лимфоцитов при связывании их клеточного рецептора (TCR) к антигенам, связанным с MHC-II на APC организует чрезвычайно динамичный, податливый и критический экземпляр, участвующий в антиген-специфических, гуморальных и клеточных иммунных реакциях1,2. IS определяется формированием специального супрамолекулярного активированного комплекса (SMAC) шаблон характеризуется актина процесса реорганизации3. После строительства ИГ Т-лимфоцитами с БТР, поляризация секреторных пузырьков по отношению к ИГ, по-видимому, замешана в поляризованной секреции в синаптической пропасти. Этот сфокусированный механизм, как представляется, недвусмысленно поставлять иммунную систему с великолепно регулируется хитрость для повышения эффективности критических секреторных эффектор роли Т-лимфоцитов, при одновременном снижении неспецифических, цитокино-арбитражная стимуляция клеток-прохожих, убийство нерелевантных клеток-мишеней и апоптотического самоубийства через активацию индуцированной смерти клеток (AICD)4.
Последствия IS меняя на природе и T лимфоцитов и APC. Синаптический контакт Т-клеток (обычно CD4" клеток) с APC отображения антигена, связанных с MHC-II производит активацию Т-клеток (цитокин секреция, пролиферация и т.д.) и, в некоторых случаях, апоптоз через AICD4. Для цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) (главным образом клеток CD8), взаимодействующих с APC, представляющим антиген, связанный с MHC-I, результат отличается от предварительной стимуляции или нет CTLs с антигеном. Таким образом, наивные CtL, идентифицирующие комплексы антигена-MHC-I на БТР, «прикораются» для уничтожения клеток-мишеней и разделения. Primed CTLs также установить синапсы с клетками-мишенями (т.е., клетки, инфицированные вирусами или опухолевыми клетками) производя антиген-специфические выращения клеток5,6.
Поляризованная секреция экзосом в иммунологическом синапсе является развивающейся и сложной областью исследований, участвующих в соответствующих иммунных реакциях7. Было продемонстрировано, что многовезикулярные тела (MVB) с внутрилюмичными пузырьками (ILVs) опыт поляризованной транспортировки к IS8,9 ( Видео1) на стимуляции TCR с антигеном. Слияние этих MVB на синаптической мембране индуцирует их дегранизацию и высвобождение ILVs как экзосомы к синаптической расщелине8,10. Это происходит в IS формируется Th-типа Jurkat клеток, которые были оспорены с SEE суперантигена покрытием Раджи клетки, действующие в качестве APC11, TCR-стимулировали CD4и лимфобласты, и загрунтованные CTL. Таким образом, синапсы, изготовленные клетками Jurkat, представляют собой ценную модель для изучения поляризованного секреторного движения экзосом. Кроме того, несколько десятилетий исследования показали, что многие фундаментальные идеи в TCR сигнализации пришли из исследований с преобразованными Т-клеточных линий, и действительно наиболее известным из этих моделей систем является Jurkat лейкемии Т-клеточной линии12.
Формирование полностью развитой IS производит несколько важнейших биологических результатов, в том числе активации Т-клеток, активации наивных CTLs или убийство целевых клеток загрунтованные CTLs, кроме анергии или AICD5. Таким образом, Есть два основных типа секреторных IS создана Т-лимфоцитов, которые приводят к очень разнообразны, но так же критически, иммунный эффектор функции1,6,13. С одной стороны, ИГ из загрунтованное цитотоксические Т-лимфоциты (КТЛ) вызывает быструю поляризацию (от секунд до нескольких минут) литических гранул (называемых "секретными лизосомыми") по отношению к ИГ. Дегрануляция литические гранулы индуцирует секрецию перфорина и гранзимков в синаптической расщелине14, которые являются про-апоптотические молекулы. Выделяемые перфорин и гранзимы впоследствии вызывают убийство целевых ячеек15,16. CTL развиваются временные синапсы, продолжительностью всего несколько минут, так как целевые ячейки убивают3,17. Это, вероятно, связано с обстоятельством, что оптимальная задача CTL требует быстрого и временного контакта для того, чтобы распределить как можно больше смертельных ударов по многочисленным ячейкам3,17. В отличие от этого, Т лимфоцитов, таких как клетки Jurkat генерировать стабильный, давний IS (от 10-30 мин до часов), так как это, как представляется, необходимо как для направленного и непрекращающейся секреции стимулирования цитокинов3,17. Цитокины также заключены в секреторные пузырьки, и некоторые из них (напротив, ИЛ-2, ИФН-З) испытывают поляризованный транспорт в ИС17 и секрецию. Одной из основных характеристик ИГ является формирование поисковых, слабых и переходных контактов между Т-ячейкой и БТР(видео 1),которые могут привести к более сильному взаимодействию и созданию зрелого ИГ, при условии, что ТКР определяет коньячные комплексы антиген-МХК и что установлены соответствующие костимулирующие соединения5. И начало первоначальных контактов, и основание зрелого, полностью продуктивного ИГ, по своей сути стохастические, быстрые и асинхронные процессы5,18. Кроме того, существует скудная частота в создании клеток к клетке конъюгирует19, которые могут представлять собой проблему для методов визуализации (пожалуйста, обратитесь к результатам и обсуждения разделов).
Еще одна основная проблема при изучении поляризации микротубуле-организационного центра (MTOC) и секреторных гранул в Т-лимфоцитах заключается в том, что весь процесс происходит быстро (секунд до нескольких минут), особенно в КТЛ. Учитывая эти факты, большинство ранних подходов сталкиваются с конечная точка стратегии, в которой APC / целевых клеток и Т-лимфоцитов смешиваются совместно и сходятся низкой скорости центрифугирования, в пользу клетки к клетке сопряженного создания, инкубируется в течение нескольких минут, фиксированной и впоследствии оценивается для передислокация MTOC и / или секреторные пузырьки к IS20. Этот подход имеет два существенных ограничения: никаких живых данных о торговле людьми не было достигнуто и высокий уровень фоновой MTOC / секреторные гранулы поляризации были получены, вероятно, из-за стохасического характера создания ИГ18. Кроме того, любая корреляция между TCR-стимулировали, первоначальные сигнальные события (т.е. внутриклеточного кальция поднимается, актин реорганизации) и секреторной поляризации везикул является проблематичным для исследования. Таким образом, императивные положения для надлежащей визуализации ИС в живых клетках объединяются для повышения конъюгированной материализации от клетки к клетке, синхронизации генерации ИС и, по возможности, для обеспечения создания клеточных конъюгированных веществ на определенных полях микроскопа XY и позициях. Для того чтобы избежать всех этих проблем, было разработано несколько стратегий. Вне рамок настоящего документа объясняется эти методы, их преимущества и недостатки. Пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным обзорам, которые касаются этих важных пунктов1,4,5,21.
Тот факт, что IS, сделанные Th лимфоцитов являются долгоживущими, и то обстоятельство, что в Th лимфоцитов MTOC, лимфокин-содержащих секреторных гранул и MVB занять от нескольких минут до часов, чтобы двигаться и доск IS22 делает Th-APC является идеальным кандидатом для визуализации с помощью протокола, описанного здесь.
1. Подготовка слайдов для соблюдения Raji клетки
2. Прилипание клеток Раджи к камерным слайдам и 7-амино-4-хлоретилкумарин (CMAC) Маркировка
3. Пульс CMAC - Приклеенные этикетку клетки Раджи со стафилококковым энтеротоксином E
4. Подготовка ячеек джурката
5. Совместное посев ячеек Раджи и Джуркат
6. Время Lapse Изображение новых синаптические конъюгирует
7. Формирование конечных точек синаптической конъюги и фиксации
8. Обработка изображений
Мы следовали описанному протоколу, чтобы создать спряжение иммунного синапса Jurkat-Raji и правильно изобразить ранние стадии формирования ИГ. Наша цель состояла в том, чтобы улучшить ранние подходы20 ранее последовали для изучения поляризации MTOC и секреторного механизма по отношению к ИГ. Эти подходы были основаны на стратегии конечной точки, которая не позволяла сотнизить образование ИГ или ранние синаптические события, так как в этих стратегиях обязательное формирование ИГ происходило в гранулах смешанных, центрифугированных клеток, но не под микроскопом. Наш протокол был разработан, чтобы избежать этого основного предостережения, так как подход был основан на использовании соответствующей концентрации клеток (Шаги 2 и 3), в пользу формирования клетки к клетке IS спрягает на собственных слайдах камеры микроскопа (8 микро-хорошо камеры слайд), установленный на предварительно подогретой микроскоп этап инкубатора (в шаге 4). Эта стратегия индуцирует формирование ИГ, одновременно с замедленной захвата изображений(видео 1).
Рисунок 1 представляет собой синаптические конъюгаты Jurkat-Raji, полученные по протоколу (шаг 5.2). Изображение представляет собой первый кадр из репрезентативного эксперимента замедленного периода. 2 x 105 Раджи-клетки и 2 х 105 юркатных клеток были добавлены в 1 см2 колодца. Верхняя панель показывает канал передачи, средняя панель состоит из CMAC (синий) канал (клетки Раджи), а нижняя панель показывает как передачу плюс CMAC объединены каналы. В качестве эталона желтые стрелки маркируют некоторые синаптические конъюгаты, в то время как зеленые стрелки указывают на синаптические конъюгированные, сделанные одной клеткой Jurkat и несколькими клетками Раджи (сложные конъюги). Снижение концентрации клеток (105 или менее клеток в 1 см2 хорошо) будет обойти образование сложных клеточных конъюгированных, но не может быть достаточно клеточных конъюгирований для последующего анализа поляризованного трафика (см. ниже), что, в свою очередь, уменьшит также шансы найти и изображение возникающих синаптических конъюги.
Рисунок 2 представляет собой скриншоты, соответствующие параметрам изображения, используемым для одновременного захвата двух различных флюорохромов (CMAC и GFP-CD63) с помощью соответствующего программного обеспечения (т.е. NIKON NIS_AR) в эксперименте по промежуток времени, соответствующему видео 1.
Видео 1 (Иммунологические синапсы, сырые) представляет собой лимфоцит Jurkat T, выражающий GFP-CD63 (маркер многовезикулярных тел-MVB, зеленые пузырьки) и образование двойного синапса между 1 ячейкой Jurkat и 2 клетками Раджи, помеченными CMAC, синим цветом (один из них подвергается поглощению). Было зафиксировано одновременное движение MVB внутри ячейки Jurkat в сторону областей синапса (частота захвата кадров - 1 кадр каждые 20 секунд для GFP-CD63; скорость воспроизведения видео - 2 кадра в секунду). Синаптические конъюги были получены и изображены после описанного выше протокола (Шаг 6.2), который позволил изображение возникающих синапсов(видео 1). Одновременное захват каналов флуоресценции GFP-CD63 и CMAC осуществлялось с помощью соответствующего программного обеспечения (т.е. NIS-AR, Таблица материалов). Видео представляет собой необработанные данные из репрезентативного эксперимента замедленного заключения. Автоматическая система фокусировки была определена с соответствующим смещением по отношению к клеткам Раджи, привязанным к стекольу дну, чтобы обеспечить стабильный фокус вдоль эксперимента.
Видео 2 (иммунологические синапсы, после деконволюции) соответствует видео 1,но деконволюция изображений канала флуоресценции GFP-CD63 была выполнена с использованием соответствующего программного обеспечения деконволюции (т.е. Гюйгенов), используя оптический вариант «широкого поля» и надлежащие оптические параметры (шаг 8). Этот деконволютный канал был впоследствии объединен с CMAC, сырьеканалом. Налицо улучшение как соотношения сигнала к шуму, так и резкости изображения. Деконволюция была выполнена после приобретения, как описано выше. Для получения более подробной информации о деконволюции программного обеспечения, пожалуйста, обратитесь к4.
Видео 3 (иммунологический синапс, после фиксации и окрашивания иммунофлюоресценции) представляет собой q-stack (z-шаг размером 0,8 мкм, 5 кадров) фиксированного конъюгирования ИС после шага 6 протокола (фиксация ацетона). После фиксации, иммунофлуоресценция была выполнена в соответствии со стандартными протоколами25 с помощью Phalloidin для визуализации F-актина (зеленый), анти-CD63 для визуализации MVB (магента), анти--тубулин для визуализации MTOC (красный). CMAC (синий) маркирует ячейку Raji. Впоследствии конъюгация была изображена эпифлюоресценцией и несколько каналов deconvoluted с использованием "широкого поля" оптический вариант и надлежащие оптические параметры (шаг 7). Впоследствии каналы, связанные с дековолюцией, были объединены в CMAC, сырой канал, как указано в различных панелях (CMAC plus Transmittance-TRANS, CMAC plus Phallodin, CMAC plus anti-CD63 и CMAC plus anti-q-tubulin, соответственно). Белая стрелка маркирует синапс, в то время как зеленая стрелка маркирует MVB, а желтая стрелка этикетки MTOC. Подробная количественная оценка поляризации MVB и MTOC была объяснена в другом месте25.
Представленный здесь подход предполагает формирование конъюгов от клетки к клетке и, одновременно, замедленное приобретение широкоугольной флуоресценционной микроскопией (WFFM), за которым следует обработка изображений (после приобретения деконволюции). Эта тактика улучшила соотношение сигнала к шуму (SNR) изображений, улучшила их временное разрешение и позволила синхронизировать приобретение нескольких фторхромов в новых синапических конъюгированных4. Кроме того, протокол хорошо сочетается с последующими методами фиксации конечных клеток (параформальдегид, ацетон или метанол), что позволит дополнительно оформить иммунофлуоресцентное окрашивание и анализировать25 (видео 3). Этот протокол также совместим с лазерной сканирующей конфокальной микроскопией и другими самыми современными методами микроскопии.
Рисунок 1: Представитель двухразмерного микроскопического поля синаптических конъюгированных. Изображение представляет собой первый кадр из репрезентативного эксперимента замедленного выполнения в соответствии с протоколом. Верхняя панель показывает канал передачи, канал CMAC средней панели (клетки Raji) и нижнюю панель как слитые каналы. В качестве эталона желтые стрелки маркируют некоторые синаптические конъюги. Зеленые стрелки указывают на сложные синаптические конъюги (т.е. одна ячейка Джурката, устанавливающая синапсы с более чем одной ячейкой Раджи). Захваченные с 40x EWD (0.6 NA) цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Настройки микроскопа по времени. Изображение соответствует нескольким скриншотам, соответствующим параметрам изображения, используемым для одновременного захвата двух различных флюорохромов (CMAC и GFP-CD63) с использованием соответствующего программного обеспечения (т.е. NIKON NIS_AR) в эксперименте по промежуток времени, соответствующему видео 1. Каждый кадр для канала GFP-CD63 был захвачен каждые 20 с. Только один кадр для УФ-канала из восьми кадров для канала GFP был захвачен для поддержания жизнеспособности клеток в ходе эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Видео 1: Иммунологические синапсы, сделанные клеткой Jurkat, выражающей GFP-CD63, необработанные данные. Клетки Raji B, помеченные синим сливным трекером (CMAC, синий), были импульсивными с SEE в течение 30 минут, и были сформированы синапсы с клетками Jurkat, выражающими GFP-CD638. Были зафиксированы покадровые сроки, соответствующие каналам GFP-CD63 и CMAC (20 с на кадр; скорость воспроизведения видео - 2 кадра на с) и показан репрезентативный пример. Захваченные с 60x PLAN APO (1.4 NA) цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Видео 2: Иммунологические синапсы, сделанные клеткой Jurkat, выражающей GFP-CD63, после деконволюции. То же самое, что видео 1, но изображения были deconvoluted с помощью программного обеспечения deconvoltion. Налицо улучшение соотношения сигнала к шуму и повышенная резкость, обусловленная устранением загрязняющей из фокуса флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Видео 3: Фиксированный и иммуноокрашенный иммунологический синапс. На рисунке показана репрезентативная фиксированная синаптика после шага 7 Протокола и последующего иммунофлуоресценции. CMAC (синий) этикетки raji клетки, передатчик (TRANS), чтобы показать синаптический конъюгированный (белая стрелка), Phalloidin этикетки F-актин (зеленый), анти-CD63 этикетки MVB (magenta, зеленая стрелка) и анти--тбулина этикетки MTOC (красный, желтая стрелка), соответственно. Эти каналы были изображены эпифлюоресценции, deconvoluted и объединены, как указано. Видео включает в себя стек (z-шаг размером 0,8 мкм, 5 кадров). Белая стрелка маркирует синаптической область контакта, в то время как зеленая стрелка маркирует MVB, а желтая стрелка этикетки MTOC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (Право нажмите, чтобы скачать).
Ограничение этого протокола заключается в том, что не все синапсы будут идеально ориентированы на оптическую ось. Используя этот метод, нет никакого способа предсказать и / или влиять на идеальную ориентацию для иммунной визуализации синапса. Чтобы решить эту проблему, мы исключаем из последующих анализов все случайно захваченные синапсы, которые, наконец, не соответствуют идеальным критериям. Эти синапсы, достаточно благоприятны, не очень часто. Тем не менее, можно обойти это ограничение, используя несколько экспериментальных подходов4.
Поляризованный релиз CD63 (дегрануляция) может быть количественно с помощью других дополнительных методов, таких как окрашивание поверхности клеток CD63 (CD63 для переселения на поверхность клетки) в живых клетках (не фиксированных и не пронизанных), после шага 6, и последующей стирки и фиксации, как ранее показано8. Кроме того, CD63 релиз на экзосомы8,9 и экзосомы количественнонатжение наночастиц отслеживания анализов9,25 может быть выполнена. Эти подходы, безусловно, совместимы с нашим протоколом, при условии, что фиксация выполняется после иммунофлуоресценции поверхности клетки живых клеток.
Мы обнаружили, что идеальное количество клеток (для 1 см2 хорошо в 8-ну хорошо камеры слайд) составляет 4 х 105 клеток (2 х 105 Raji клеток и 2 х 105 Jurkat клетки), так как они эффективно придерживаться нижней части колодца. Связывание эффективности к пластику (с использованием фибронектина) или стеклянного дна (с использованием поли-L-лизин) микрооползней, как правило, не является проблемой. Более высокие числа клеток могут не производить разрывов между присоединенными клетками и, впоследствии, сложными синаптические конъюгированными(рисунок 1); обе ситуации нежелательны, когда одноклеточные конъюгаты должны быть изображены, например, в экспериментах по поляризации MTOC или секреторных гранул. Меньшее количество клеток может уменьшить шансы найти конъюги, особенно когда трансинфицированные клетки Jurkat оспариваются СБ для генерации синапсов. Пожалуйста, обратите внимание, что мы заметили, что температурно-стабилизированный инкубатор стадии на месте на микроскопx X/ Y этапе до начала протокола (т.е., 1-2 ч заранее, чтобы стабилизировать этап / микроскоп установки) поддерживает стабильные X, Y, - параметры, что имеет решающее значение для надлежащего изображения. Автоматическая система фокусировки в конечном итоге компенсирует небольшие вариации.
Когда некоторые методы трансдукции генов, такие как электропорация используются для экспресса флуоресцентных химерных белков (т.е. GFP-CD63) в клонах Jurkat (Видео 1), значительная часть клеток может умереть после электропорации. Это может быть проблемой, поскольку, хотя мертвые клетки не образуют синапсы, когда они находятся в избытке над живыми, транс-инфицированных клеток, они могут вмешиваться в формирование конъюгированных, сделанных живыми Т клеток. Мы обнаружили, что тщательное устранение мертвых клеток из трансзараженных культур с помощью среды градиента плотности следующие стандартные протоколы до шага конъюгированного формирования действительно может увеличить шансы правильно спряжения изображения. Кроме того, низкая эффективность трансфекции (0,20%) может быть важным предостережением, так как это, в сочетании с умеренной конъюгированной эффективности формирования (около 60%)25, уменьшит вероятность найти конъюги, сделанные трансинфицированных клеток. Это не является проблемой, когда нетранспередаваемые клетки используются для получения конъюги в конечных экспериментах и последующей фиксации. 8 камерных слайдов микроколодца совместимы с обычными протоколами иммунофлуоресценции. Это повышает гибкость вышеуказанного протокола с различными целями. Фиксация с ацетоном может быть проблемой для рассмотрения при использовании камерных слайдов с пластиковыми дном колодцев. Тем не менее, есть коммерчески доступные 8 микроколодца микроскоп камеры слайды, содержащие стеклянные днища, которые совместимы с ацетоном фиксации. Удалите пластиковые крышки, когда ацетон используется для фиксации клеток, культивированных в 8 microwell стеклянных нижних слайдов камеры.
Рекомендуется, чтобы микроскоп оснащался моторизованной стадией XY, моторизованной репрелепрелитируемой репрелесолисткой и автоматической системой фокусировки (например, Perfect Focus System) или эквивалентными добавками. Когда мульти-хорошо приобретение требуется25, автоматическая система фокусировки обеспечит стабильный фокус на всем протяжении эксперимента. Предыдущий опыт показывает, что, установив соответствующий фокус компенсируется на клетки Раджи, как движение Т-клеток(видео 1) и микроскоп этап / камеры слайд движений в XY многоточечных экспериментов, могут быть компенсированы. Это действительно удобно для многократного захвата замедленного времени.
Черно-белая, панхроматическая и охлажденная заряженная соединенная камера (CDD) была использована, но более высокой чувствительности, флуоресценции научной дополнительной металлооксидной полупроводниковой (sCMOS) камера желательна, так как это уменьшит время экспозиции камеры и повысит временное разрешение. Короткое время экспозиции камеры мы использовали (рейтинг форме 100 мс до 500 мс) в сочетании с автоматической флуоресценции затвор позволяет длительный промежуток времени захвата (до 24 ч) с адекватным разрешением времени (1 кадр в минуту или меньше, до 16 Позиций XY) без значительного флуоресценции отбеливания и / или потери в жизнеспособности клеток. Моторизованный этап позволяет многоточечный (XY) захвата и увеличивает шанс найти и изображение возникающих и развивающихся синапсов в идеальной ориентации, но и позволяет приобретение изображения в многофункциональных камерных слайдов, когда различные клоны Jurkat должны быть одновременно сопряжены25. Высокая численная диафрагма цели (т.е. 60x, 1.4) необходима для того, чтобы получить наилучшие результаты при анализе трафика секреторных гранул.
RAJI-SEE-Jurkat представляет собой устоявшуюся иммунологическую синапсовую модель, которая была использована множеством исследователей, так как она была первоначально описана11. Мы адаптировали наш протокол к этой модели, чтобы правильно изобразить ранние этапы формирования ИГ. Наша цель состояла в том, чтобы улучшить ранние подходы20 ранее последовали для изучения поляризации MTOC и секреторного механизма по отношению к ИГ. Примечательно, что конъюги, сделанные с этим протоколом производят F-актин реорганизации на синапсе, настройка канонического SMAC, сопутствуя MVB поляризованного трафика25. Эти важные события были также проанализированы и проверены конфокальной микроскопии25.
Кинетические различия в поляризованном трафике существуют между различными типами ИС. Например, поляризованная транспортировка литические гранулы из CTLs происходит в секундах или очень мало минут, в то время как несколько цитокиносодержащих пузырьков из Th лимфоцитов занять от нескольких минут до нескольких часов до конца. Эти временные различия должны быть приняты во внимание заранее, для того, чтобы разработать наилучшую стратегию и выбрать наиболее подходящий экспериментальный и визуальный подход, так как для некоторых визуальных утех (т.е. лазерное сканирование конфокальной микроскопии (LSCM)), время может быть ограничивающим фактором, так как время захвата гораздо выше, чем соответствующее разрешение времени (1 минута или меньше)4. Это не является ограничением, когда широкополевой флуоресценции микроскопии (WFFM) используется, как описано в протоколе выше. Так как в CTLs, поляризация MTOC к синапсу длится всего несколько минут3,6,17, различные конкретные состояния современной микроскопии подходы отличаются от описанных здесь (но укрывательство более высокое пространственное и временное разрешение) необходимы для того, чтобы правильно изображение этих синапсов26,27, в основном, когда несколько микроскопов (многоточечные захват) изображения. Эти высокие разрешения, новые подходы могут быть также использованы для визуализации синапсов, сделанных Th лимфоцитов, хотя экономичные и / или логистических причин (т.е., основное оборудование, необходимое для некоторых из этих методов визуализации стоит 6-7 раз больше, чем описано здесь), безусловно, может представлять собой ограничение для этих современных методов визуализации4. Тот факт, что IS сделаны Th лимфоцитов являются долгоживущими, и то обстоятельство, что в Th лимфоцитов MTOC, лимфокин-содержащих секреторных пузырьков и MVB занять от нескольких минут до часов для транспортировки и док-станции IS22, делает этот протокол идеальным, доступным подходом для визуализации TH-APC IS.
WFFM в сочетании с деконволюцией изображений после приобретения представляет собой интересный подход, и не только экономические причины поддерживают эту стратегию. Внутреннее плохое разрешение в оси q (наиболее важное предостережение техники) может быть улучшено с помощью пост-приобретения изображения deconvoltion4 (сравните видео 1 с видео 2). Deconvolution использует расчетный подход к обработке изображений, который может улучшить соотношение сигнала к шуму и разрешение изображения и контрастироватьот 27 до 2 раз, вплоть до 150-100 нм в оси XY и 500 нм в оси4.
Использование высокой чувствительности, высокой скорости считывания и широкого динамического диапазона, новых флуоресценции sCMOS камеры улучшат качество изображения и уменьшит отбеливание флуоресценции. Гибкость, предлагаемая описанным здесь протоколом спряжения от клеток к клетке, позволяет сочетать описанный клеточный подход с несколькими методами современной микроскопии, как в живых клетках, так и в стационарных клетках, и ожидаемый результат действительно улучшит наши знания иммунологического синапса.
Хотя мы внедрили и проверили протокол с помощью простых в обращении, хорошо установленных клеточных линий, потенциал подход может позволить визуализации более физиологических взаимодействий, когда первичные Т-клетки и различные типы антиген-представления клеток (таких как дендритные клетки макрофагов) используются5. В этом контексте, этот протокол был также расширен и проверен с помощью суперантигена (SEB) импульсной мыши EL-4 клеточной линии, используемой в качестве APC, чтобы бросить вызов первичной мыши T лимфобластов9. Действительно, первичные T лимфоциты, CTLs, в частности, оказали более недолговечные и динамические синаптические контакты (см. Дополнительное видео 8 в ссылке9) для тех, кто видел с моделью SEE-Raji и Jurkat. Вариабельность синапических контактных режимов лучше всего просмотреть для первичных взаимодействий Т-клеток с дендритными клетками или В-клетками в двухмерных эквивалентах ткани in vitro, которые также могут быть записаны и проанализированы с помощью этого протокола. Кроме того, помимо суперантигенов, этот метод можно использовать для изображения других типов синапсов. Например, он может быть использован в TCR трансгенных, антиген-специфических Т-клеток модели, например, с использованием овальбумин конкретных морин OT1/OT2 системы или трансфекции Т-клеток с антиген-специфических Т-клеточных рецепторов. Это открывает множество экспериментальных возможностей в ближайшем будущем.
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Мы признаем все прошлые и нынешние члены лаборатории за их щедрый вклад. Эта работа была поддержана грантами от испанского министра и Компетивидада (MINECO), Plan Nacional de Investigacion Cientefica (SAF2016-77561-R to M.I., которая была частично предоставлена за счет финансирования FEDER-EC). Мы признаем, факультет медицины (UAM) и Departamento де аудиовизуальных факультетов Медицины за их поддержку и средства, предоставляемые для производства видео. Мы признаем NIKON-Europe за непрерывную и превосходную техническую и теоретическую поддержку. Бесплатный доступ к этой статье спонсируется Nikon.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software ImageJ | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены