זלוף ואינפלציה של ריאת העכבר עבור היסטולוגיה גידול

Summary

מטרת שיטה זו היא להציג שיטה פשוטה ויעילה עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר לבדיקת פתולוגיה גידול ריאות והערכת גרורות לריאה.

Abstract

היכולת להעריך היסטולוגיה של ריאות היא קריטית לתחומי חקר סרטן ריאות וגרורות סרטן. חשוב באותה מידה לבצע necropsies במהירות וביעילות ממחקרים מבלי להקריב את איכות הרקמות שנרכשו. מטרת פרוטוקול זה היא להציג שיטה להחדיר במהירות, לנפח ולתקן ריאות עכבר לניתוח היסטולוגי במורד הזרם. שיטה זו אינה מתקן את אינפלציית הריאות; לכן, זה לא דורש כל נהלים מיוחדים או ציוד ובמקום זאת פשוט מחדיר קיבוע ישירות דרך קנה הנשימה בעקבות זלוף דרך הלב. זה מאפשר הערכה מספקת של גודל הגידול, היסטולוגיה, וניקוד. זה גם מאפשר איסוף של רקמה קפואה לפני קיבוע רקמת הריאה. שיטה זו מוגבלת בכך שהיא אינה מאפשרת כימות מורפומטרי מאוחר יותר של הריאה; עם זאת, זה יותר ממספיק לניתוח גידול ריאות ממודלים עכבר מהונדסים גנטית (GEMMs), מודלים סינגניים, כמו גם גידול קסנוגרפט ומחקרי גרורות.

Introduction

קיימים מגוון דגמי עכברים של אונקוגנזה ריאה וגרורות סרטן לריאה, החל מ- GEMMs מורכבים ועד דגמים הנגרמים על ידי מסרטן ועד מודלים סינגניים ושנאת זרים, שבהם מוזרקים תאים סרטניים באמצעות אינטרקרדיאק, תוך-עורית, וריד הזנב או שיטות אחרות לביסוס גידולים בריאה. כל המודלים האלה חולקים את הצורך המשותף להערכה היסטולוגית של היסטולוגיה של ריאות ופתולוגיה. לכן, יש צורך בשיטה חזקה אך מהירה לבצע necropsies של עכברים תוך זלוף הריאות כדי להסיר דם עודף, ניפוח ותיקון הריאות כדי לדמיין בבירור את ארכיטקטורת הריאות. מהירות היא מרכיב קריטי של הליך זה כפי שייתכן שיהיה צורך לאסוף את הריאות מעשרות עכברים בנקודת זמן אחת. ניתן לבצע הליך זה בפחות מ- 6 דקות לכל עכבר.

בעוד הליך זה הוא יותר ממספיק להערכת היסטולוגיה הגידול, זה לא מומלץ עבור אלה המעוניינים לבצע מדידות סטריאולוגיה או morphometric של הריאות. מדידות כאלה דורשות אינפלציית ריאות להיות סטנדרטית, כמו גם את החישוב של שטח הפנים המוחלט של הריאה, נפח מוחלט, וגודל מכתשי ומספר¹. שיטה זו גם אינה אופטימלית עבור גישות הדמיה מסוימות. לדוגמה, הדמיה של הריאות באמצעות μCT לניתוח מורפומטרי אקס ויוו דורשת שהריאות יישארו מלאות באוויר². כאשר שימור המרחבים והממדים האוויריים הם הדאגה העיקרית, מומלץ לתקן את הריאות על ידי טכניקות התייבשות זלוף^3,4. אחד החששות הגדולים ביותר של מודל זה הוא הפוטנציאל לקרע של קירות מכתשים, להפחית את השימוש בו במחקרים של נפחת; עם זאת, ההליך המומלץ לקיבעון הריאות לחקר אמפיזמה עדיין דומה למדי, שכן מומלץ לתקן את הריאות או על ידי החדרה תוך-טרה-סחית של 10% פורמלין (בדומה לפרוטוקול המתואר כאן) תחת לחץ נוזלים מתמיד או על ידי קיבוע⁵.

היתרון של ההליך המתואר כאן הוא שזה לא דורש לחץ נוזלים מתמיד, במקום לנפח את הריאות עד שהם התרחבו באופן מלא, ובכך להקטין את הזמן הדרוש להליך. ההליך המתואר כאן דומה מאוד לשיטות המומלצות על ידי חימוש של האגודה לפתולוגיה טוקסיקולוגית, שם הוקמה ועדת משנה להמליץ על השיטות הטובות ביותר של קיבוע ריאות למחקרי רעלים. רוב המדענים בתוך ועדת משנה זו המליצו לתקן את הריאות על ידי החדרה תוך-סטריאלית עם מזרק, אם כי היו המלצות שונות בזמן שהריאה הושארה בקיבעון⁶. לכן, בעוד מגוון שיטות של אינפלציה ריאות קיבעון קיים, השיטה המתוארת בזאת מוצע להיות השיטה האופטימלית במהירות לנפח ולתקן את הריאות להערכה היסטולוגית גידול במורד הזרם.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אלבמה בברמינגהם.

1. פרוטוקול ניסיוני

1. הקרב את העכבר באמצעות שיטת IACUC מאושרת. כאן, השתמשנו נקע צוואר הרחם של עכבר הרדמה עם 5% isoflurane. השתמש בעכבר מתאים למחקר; כאן, אנו משתמשים בעכבר FVB בן 8 שבועות
2. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך אופקי 3.5-5 מ"מ באמצע הבטן התחתונה. לאחר מכן, הכנס מספריים כירורגיים לתוך החור הקטן שנוצר חתך לחתוך אנכית במעלה קו האמצע המרכזי רק מתחת לצוואר של העכבר.
3. משוך את העור לאחור עם האצבעות ולבדוק את בלוטות הלימפה בבית השחי.
4. באמצעות מספריים כירורגיים, לעשות חתך לרוחב 3.5 מ"מ כדי לפתוח את חלל הבטן, ולאחר מכן לחתוך בכיוון החזית עד לתחתית בית החזה. בדוק את האיברים בחלל הבטן: כבד, טחול, כליות וכו '.
5. עם הדירה של מספריים כירורגיים, או באמצעות מלקחיים, להזיז את הכבד כדי לחשוף את הסרעפת. בדוק את הסרעפת לצמיחה הגידול או גרורות. לאחר מכן, בעדינות לצלוך את הסרעפת בצד ימין של המפעיל, ומאפשר לו להתרחב. חותכים בעדינות את הסרעפת מימין לשמאל כדי לחשוף את חלל בית החזה והריאות. תיזהר לא לחתוך את הריאות.
6. חותכים דרך הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות השמאלי (בצד ימין של המפעיל) כדי לבדוק את האונה השמאלית של הריאות.
7. בעדינות להזיז את האונות הימניות של הריאה מהדרך לחתוך את הקיצוניות לרוחב של כלוב הצלעות הימני ולהסיר כלוב צלעות.
   הערה: הסרת כלוב הצלעות היא אופציונלית, אם כי ההסרה מאפשרת תצוגה ברורה יותר של אינפלציית ריאות מאוחרת יותר.
   1. אם יש צורך ברקמת ריאה טרייה או קפואה, יש להשתמש במלקחיים של המוסטט כדי להדק את הסימפונות של האונה השמאלית ולכרות את הריאה השמאלית באמצעות מספריים כירורגיות לפני הזלוף.
8. באמצעות מלקחיים כדי להרים את הרקמה מכסה את קנה הנשימה, לחתוך כל רקמה עודפת. ואז לחתוך בעדינות את הרקמה הדקה רירית קנה הנשימה כדי לחשוף את דרכי הנשימה.
9. חותכים דרך עורק הכליה עם מספריים כירורגיים.
10. כדי לעיין בריאות, להשתמש מזרק 3 מ"ל עם מחט 22 G להזריק 1x PBS עם 10 U / mL הפרין לתוך החדר הימני של הלב. לאט לחלחל את הריאות בערך 300 μL / s עם PBS / הפרין. הריאות יהפכו לעתים קרובות ללבנות. 2.5 מ"ל של PBS משמשים בדרך כלל בשלב זה.
11. לאינפלציית ריאות, השתמש במזרק 3 מ"ל עם מחט 22 גרם, הפעם מוחזק במקביל לקנה הנשימה. הכנס את המחט לתוך קנה הנשימה ולהזריק 10% פורמלין עם קצב זרימה לא יותר ~ 200 μL / s עד הריאות יש מנופח לחלוטין. ברגע שהריאות מנופחות, הפורמלין יחזור לזרום מקנה הנשימה. החזק את המחט במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לסגת.
    1. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לפני משיכת מחט ואינפלציה ריאות, להשתמש בחוט תפר כדי לקשור את קנה הנשימה. כדי להשיג זאת, השתמש 4 סנטימטרים של חוט תפר מחזיק את הנקודה של החוט עם זוג קטן של מלקחיים. מניחים את החוט בצד הגבי של קנה הנשימה ולמשוך דרך לעשות לולאה סביב המחט. לאחר מכן ליצור קשר מעל פני המחט. משוך קשר חזק, להסיר מחט מקנה הנשימה, קשר קרוב.
12. השתמש מלקחיים כדי להרים את הלב, להכניס מספריים כירורגיים ישירות מאחורי הריאות, לחתוך רקמת חיבור תוך הרמת הלב כדי לכרות ריאות.
13. חותכים את הלב כדי להסיר אותו מהריאות.
14. מניחים את הריאות קלטת עם מזהה העכבר או מזהה המחקר. ניתן להשאיר את הריאות בתיקון במשך למעלה משנה במידת הצורך.
15. מעבירים את הקלטת המכילה את הריאות ל-70% אתנול וממשיכים לעיבוד היסטולוגיה.

תוצאות

הפרוטוקול לעיל מאפשר זלוף מהיר, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר. הנתונים המוצגים להלן מייצגים את החשיבות של כל שלב. איור 1 מתאר ריאות מוכתמות H&E שהודבקו ל-PBS ולריאות שבהן דילגו על שלב הזלוף או שהריאות לא הצליחו לחלחל כראוי. כפי שמוצג, עודף דם בריאות perfused גרוע יוצר פחות היסטולוג...

Discussion

ההליך המתואר לעיל עבור זלוף, אינפלציה, קיבוע של ריאות העכבר הוא אידיאלי עבור הכנה מהירה ויעילה של ריאות העכבר עבור היסטולוגיה גידול ריאות וניתוח פתולוגיה. ההליך אינו דורש כל ציוד מיוחד והוא יכול להתבצע בתוך פחות מ 6 דקות לכל עכבר. ההליך אינו דורש נפח קבוע לאינפלציה או לחץ נוזלים מתמיד. מכיו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428