Tümör Histolojisi için Fare Akciğerinin Perfüzyonu ve Enflasyonu

Özet

Bu yöntemin amacı, akciğer tümörü patolojisinin incelenmesi ve akciğere metastazların değerlendirilmesi için fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için basit ve verimli bir yöntem sunmaktır.

Özet

Akciğer histolojisini değerlendirme yeteneği akciğer kanseri araştırmaları ve kanser metastazı alanları için kritik öneme sahiptir. Temin edilen dokuların kalitesinden ödün vermeden çalışmalardan hızlı ve verimli bir şekilde nekropsi yapılması da aynı derecede önemlidir. Bu protokolün amacı, aşağı akış histolojik analizi için fare akciğerlerini hızla boğmak, şişirmek ve düzeltmek için bir yöntem sunmaktır. Bu yöntem akciğer enflasyonuna standardize etmez; bu nedenle, herhangi bir özel prosedür veya ekipman gerektirmez ve bunun yerine kalpten perfüzyonu takiben doğrudan trakea yoluyla fiksatif aşılar. Bu, tümör büyüklüğü, histolojisi ve puanlamasının yeterli tahminini sağlar. Bu aynı zamanda akciğer dokusu fiksasyonundan önce donmuş dokunun toplanmasına izin verir. Bu yöntem, akciğerin daha sonra morfometrik niceliğine izin vermediği için sınırlıdır; ancak genetik olarak tasarlanmış fare modelleri (GEMM'ler), singeneik modellerin yanı sıra ksinograft tümör ve metastaz çalışmalarından akciğer tümörü analizi için fazlasıyla yeterlidir.

Giriş

Akciğer onkogenezi ve akciğere kanser metastazının çeşitli fare modelleri, karmaşık GEMM'lerden kanserojen kaynaklı modellere, kanser hücrelerinin intrakardiyak, intratorasik, kuyruk damarı veya akciğer içinde tümör oluşturmak için diğer yöntemlerle enjekte edildiği singeneik ve ksinograft modellerine kadar çeşitli vardır. Tüm bu modeller akciğer histolojisi ve patolojisinin histolojik değerlendirmesi için ortak ihtiyacı paylaşsa. Bu nedenle, fazla kanı çıkarmak için akciğerlere perfüzyon yaparken farelerin nekropsilerini yapmak ve akciğer mimarisini net bir şekilde görselleştirmek için akciğerleri şişirmek ve sabitlemek için sağlam ama hızlı bir yönteme sahip olmak gerekir. Hız, akciğerleri tek bir zaman noktasında düzinelerce fareden toplamak gerekebileceğinden, bu prosedürün kritik bir bileşenidir. Bu yordam fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir.

Bu işlem tümör histolojisini değerlendirmek için fazlasıyla yeterli olmakla birlikte, akciğerlerin stereoloji veya morfometrik ölçümlerini yapmak isteyenler için önerilmez. Bu tür ölçümler, akciğerin mutlak yüzey alanının, mutlak hacminin ve alveolar boyutunun ve¹sayısının hesaplanmasında olduğu gibi akciğer enflasyonunun standartlaştırılmasını gerektirir. Bu yöntem bazı görüntüleme yaklaşımları için de en uygun değildir. Örneğin, ex vivo morfometrik analiz için akciğerlerin μCT ile görüntülenmesi, akciğerlerin hava²ile dolu kalmasını gerektirir. Hava alanlarının ve boyutlarının korunması birincil endişe kaynağı olduğunda, akciğerlerin perfüzyon dehidrasyon teknikleri ile düzeltilmesi önerilir^3,4. Bu modelin en büyük endişelerinden biri, amfizem çalışmalarında kullanımını azaltarak alveolar duvarların yırtılma potansiyelidir; bununla birlikte, amfizem çalışması için akciğerlerin sabitlenmesi için önerilen prosedür hala oldukça benzerdir, çünkü akciğerlerin sürekli sıvı basıncı altında % 10 formalin intratraseral aşılama (burada açıklanan protokole benzer) veya yerinde fiksasyon⁵ile sabitlenmesi önerilir.

Burada açıklanan prosedürün avantajı, sürekli sıvı basıncı gerektirmemesi, bunun yerine akciğerleri tamamen genişleyene kadar şişirmesi ve böylece işlem için gereken süreyi azaltmasıdır. Burada açıklanan prosedür, toksikoloji çalışmaları için en iyi akciğer fiksasyon yöntemlerini önermek için bir alt komitenin oluşturulduğu Toksikoloji Patoloji Derneği'nin bir silahlanma armamentariumunun önerdiği yöntemlere yakından benzemektedir. Bu alt komitedeki bilim adamlarının çoğunluğu, akciğerin fiksatif^6'dabırakıldığı zaman farklı öneriler olmasına rağmen, akciğerlerin bir şırınna ile intratrakial aşılama ile sabitlenmesini önerdi. Bu nedenle, akciğer şişirme ve fiksasyon çeşitli yöntemler mevcut iken, burada açıklanan yöntem hızlı bir şekilde şişirmek ve downstream tümör histolojik değerlendirme için akciğerleri düzeltmek için en uygun yöntem olarak önerilmiştir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Birmingham'daki Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Deneysel protokol

1. Onaylı bir IACUC yöntemi kullanarak fareyi feda edin. Burada% 5 izofluran ile uyuşturulan bir farenin servikal çıkığı kullandık. Çalışma için uygun bir fare kullanın; Burada, 8 haftalık bir FVB fare kullanıyoruz
2. Cerrahi makas kullanarak, alt karın ortasında 3,5-5 mm yatay bir kesi yapın. Daha sonra, kesiden oluşturulan küçük deliğe cerrahi makas yerleştirin ve orta orta çizgiyi farenin boynunun hemen altına dikey olarak kesin.
3. Cildi parmaklarla geri çekin ve aksiller lenf düğümlerini inceleyin.
4. Cerrahi makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için 3,5 mm yanal kesi yapın ve ardından ön yönde toraksın dibine kadar kesin. Karın boşluğundaki organları inceleyin: karaciğer, dalak, böbrekler vb.
5. Cerrahi makasın düzlüğünde veya tokmak kullanarak, diyaframı açığa çıkarmak için karaciğeri hareket ettirin. Diyaframı tümör büyümesi veya metastazları için inceleyin. Ardından, operatörün sağ tarafındaki diyaframı hafifçe kırparak genişlemesini sağlar. Torasik boşluğu ve akciğerleri açığa çıkarmak için diyaframı sağdan sola doğru yavaşça kesin. Akciğerleri kesmemeye dikkat edin.
6. Akciğerlerin sol lobunun incelenmesi için sol göğüs kafesinin lateral aşırı (operatörün sağında) kesilmiştir.
7. Akciğerin sağ loblarını yavaşça hareket ettirin ve sağ göğüs kafesinin yanal aşırısını kesin ve göğüs kafesini çıkarın.
   NOT: Göğüs kafesinin çıkarılması isteğe bağlıdır, ancak çıkarılması daha sonraki akciğer enflasyonunun daha net görülmesini sağlar.
   1. Taze veya donmuş akciğer dokusu gerekiyorsa, sol lobun bronşlarını sıkıştırmak için hemostat tokadı kullanın ve perfüzyondan önce cerrahi makas kullanarak sol akciğeri resect.
8. Nefes nefesini kaplayan dokuyu kaldırmak için tokmakları kullanmak, fazla dokuları kesmek. Daha sonra solunum yolunu açığa çıkarmak için nefes borusuna astarlı ince dokuyu hafifçe kesin.
9. Böbrek atardamarını cerrahi makasla kesin.
10. Akciğerleri boğmak için, kalbin sağ ventrikülüne 10 U/mL heparin ile 1x PBS enjekte etmek için 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. PBS/heparin ile akciğerleri yaklaşık 300 μL/s'de yavaşça perfuse edin. Akciğerler sık sık beyaza döner. Bu adımda genellikle 2,5 mL PBS kullanılır.
11. Akciğer şişirme için, bu kez nefes borusuna paralel tutulan 22 G iğneli 3 mL şırınga kullanın. İğneyi nefes borusuna yerleştirin ve akciğerler tamamen şişirilene kadar ~200 μL/sn'den büyük olmayan akış hızıyla% 10 formalin enjekte edin. Akciğerler şişirildikten sonra formalin nefes borusundan geri akacak. İğneyi birkaç saniye daha yerinde tutun ve geri çekin.
    1. (İsteğe bağlı) İğne ve akciğer şişirme geri çekilmeden önce, nefes borusu bağlamak için dikiş ipliği kullanın. Bunu başarmak için, ipliğin noktasını küçük bir çift asa ile tutan 4 inç dikiş ipliği kullanın. İpliği nefes borusunun dorsal tarafına yerleştirin ve iğnenin etrafında bir halka yapmak için çekin. Sonra iğnenin etrafında bir el düğümü yapın. Düğümü sıkıca çekin, iğneyi nefes borusundan çıkarın, düğümü kapatın.
12. Kalbi kaldırmak için tokmak kullanın, doğrudan akciğerlerin arkasına cerrahi makas yerleştirin ve kalbi akciğerleri resect etmek için kaldırırken bağ dokusunu kesin.
13. Kalbi kesip akciğerlerden alın.
14. Akciğerlere fare kimliği veya çalışma kimliği ile etiketlenmiş bir kaset yerleştirin. Akciğerler istenirse bir yıldan fazla bir süre sabitlenebilir.
15. Akciğerleri içeren kaseti% 70 etanol'e aktarın ve histoloji için işlemeye devam edin.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokol, fare akciğerlerinin hızlı perfüzyonunu, enflasyonuna ve sabitlenmesine izin verir. Aşağıda gösterilen rakamlar her adımın önemini temsil eder. Şekil 1' de PBS ile perfüzyona uğramış H&E lekeli akciğerler ve perfüzyon adımının atladığı veya akciğerlerin doğru şekilde perfüzyona maruz kalmadığı akciğerler tasvir edilmiştir. Gösterildiği gibi, zayıf perfüzyonlu akciğerlerdeki fazla kan ideal histolojiden daha az oluşturur ve akciğer ...

Tartışmalar

Fare akciğerlerinin perfüzyonu, enflasyonu ve fiksasyonu için yukarıda açıklanan prosedür, akciğer tümörü histolojisi ve patoloji analizi için fare akciğerlerinin hızlı ve verimli bir şekilde hazırlanması için idealdir. Prosedür herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve fare başına 6 dakikadan daha kısa bir sürede gerçekleştirilebilir. Prosedür, enflasyon veya sabit sıvı basıncı için sabit bir hacim gerektirmez. Bu işlem standart hale getirmediği için akciğerin stereolojik veya morfome...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428