腫瘍組織学におけるマウス肺の多灌流とインフレーション

要約

この方法の目的は、肺腫瘍病理の検査および肺への転移の評価のためのマウス肺の灌流、膨張、および固定のための簡単で効率的な方法を提示することである。

要約

肺の病態を評価する能力は、肺がん研究やがん転移の分野で重要です。調達した組織の質を犠牲にすることなく、研究から迅速かつ効率的に壊死を行うことも同様に重要です。このプロトコルの目的は、下流の組織学的分析のためにマウス肺を迅速に穿ファズ、膨張、および固定する方法を提示することです。この方法は、肺の膨張を標準化しません。したがって、特別な手順や機器を必要とせず、心臓を通して灌流した後の気管を通して直接固定液を植え付けるだけです。これにより、腫瘍のサイズ、組織学、およびスコアリングの十分な推定が可能になります。これはまた肺組織の固定の前に凍結組織のコレクションを可能にする。この方法は、後で肺の形態学的定量を可能にしないために制限されています。しかし、遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)、異種モデル、異種移植片腫瘍および転移研究による肺腫瘍分析には十分です。

概要

肺腫瘍発生や癌転移から肺への様々なマウスモデルは、複雑なGEMMから発がん性および異種移植片モデルに至るまで、癌細胞が心臓内、胸腔内、尾静脈、または肺内に腫瘍を確立する他の方法を介して注入される同種および異種移植片モデルに至るまで存在する。これらのモデルはすべて、肺組織学と病理の組織学的評価に共通する必要性を共有しています。したがって、余分な血液を除去するために肺を浸透させ、肺を膨らませて肺のアーキテクチャを明確に可視化しながら、マウスの壊死を行う堅牢かつ迅速な方法が必要である。速度は、単一の時点で数十匹のマウスから肺を収集する必要があるため、この手順の重要な要素です。この手順は、マウスあたり6分以内に実行できます。

この手順は腫瘍組織学を評価するのに十分ですが、肺のステテロロジーまたは形態測定を行いたい人には推奨されません。このような測定では、肺の絶対表面積、絶対体積、歯槽サイズおよび番号¹の計算と同様に、肺の膨張を標準化する必要があります。この方法は、一部のイメージングアプローチにも最適ではありません。例えば、ex vivoモルフォメトリック解析のためにμCTを介して肺をイメージングするには、肺が空気²で満たされたままである必要があります。空気空間および寸法の保存が第一の関心事である場合、過灌流脱水技術^3、4によって肺を固定することが推奨される。このモデルの最大の懸念の1つは、肺胞壁の破裂の可能性であり、肺気腫の研究における使用を減らす。しかし、肺気腫の研究のための肺の固定のための推奨手順は、一定の流体圧力下で(ここで説明するプロトコルに類似した)10%ホルマリンの気管内点眼点眼によって、またはその場で固定5で肺を固定することが推奨されるように、まだ非常に似^{ています。}

ここで説明した手順の利点は、一定の流体圧力を必要とせず、肺が完全に膨張するまで膨張し、処置に必要な時間を短縮することです。ここで説明する手順は、毒物学病理学会の軍備間膜によって推奨される方法によく似ており、毒物学研究のための肺固定の最良の方法を推奨する小委員会が結成された。この小委員会内の科学者の大半は、肺が固定剤⁶に残された時間に様々な勧告があったが、注射器で気管内点眼によって肺を固定することを推奨した。従って、肺の膨張および固定の様々な方法が存在する一方で、本明細書に記載される方法は、下流腫瘍組織学的評価のために肺を迅速に膨張および固定する最適な方法であると提案される。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、バーミンガムのアラバマ大学の制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. 実験プロトコル

1. 承認された IACUC 方式を使用してマウスを犠牲にします。ここでは、5%イオブルランで麻酔したマウスの子宮頸部脱臼を用いた。研究に適切なマウスを使用します。ここでは、8週齢のFVBマウスを使用しています
2. 手術用ハサミを使用して、下腹部の真ん中に3.5〜5mmの水平切開を行います。次に、切開から作成された小さな穴に外科用ハサミを挿入し、マウスの首のすぐ下に中央の正中線を垂直に切断します。
3. 指で皮膚を引き戻し、腋窩リンパ節を検査します。
4. 手術用ハサミを使用して、3.5mmの側面切開を行い、腹腔を開き、胸部の底まで前方向に切断します。腹腔内の臓器を検査します:肝臓、脾臓、腎臓など。
5. 手術用ハサミの平らで、または鉗子を使用して、肝臓を動かして横隔膜を露出させる。横隔膜の腫瘍の成長や転移を検査します。その後、オペレータの右側にあるダイヤフラムをそっと切り取り、拡大します。横隔膜を右から左にそっと切り、胸腔と肺を露出させる。肺を切らないように注意してください。
6. 左肋骨ケージの横端(オペレータの右)を切り取って、肺の左葉を検査します。
7. 肺の右葉をそっと動かし、右肋骨ケージの横端を切り取り、リブケージを取り除きます。
   注:リブケージの除去はオプションですが、除去は後の肺インフレのより明確なビューを可能にします。
   1. 新鮮な肺組織または凍結した肺組織が必要な場合は、ヘモスタット鉗子を使用して左葉の気管支をクランプし、灌流前に外科用ハサミを使用して左肺を切除する。
8. 鉗子を使用して気管を覆う組織を持ち上げ、余分な組織を切り取る。その後、気管を裏打ちする薄い組織をそっと切り、気道を露出させる。
9. 外科用はさみで腎動脈を切り抜ける。
10. 肺を浸透させるために、22G針の3 mLシリンジを使用して、心臓の右心室に10 U/mLヘパリンを含む1x PBSを注入する。PBS/ヘパリンで約300μL/秒でゆっくりと肺を透過します。肺は頻繁に白くなります。このステップでは、通常、2.5 mL の PBS が使用されます。
11. 肺膨張のために、22G針を用いた3mLシリンジを使用し、今度は気管に平行に保持した。針を気管に入れ、肺が完全に膨張するまで流量が〜200μL/s以下の10%ホルマリンを注入します。肺が膨張すると、ホルマリンは気管から逆流します。針を数秒間所定の位置に保持し、引き出します。
    1. (オプション)針と肺の膨張を引き出す前に、縫合糸を使って気管を締め出してください。これを達成するには、小さな鉗子で糸のポイントを保持する縫合糸の4インチを使用してください。気管の裏側に糸を置き、引き抜いて針の周りにループを作ります。次に針の周りにオーバーハンドの結び目を作ります。結び目をしっかりと引っ張り、気管から針を取り除き、結び目を閉じます。
12. 鉗子を使って心臓を持ち上げ、肺の真後ろに外科用のはさみを挿入し、心臓を持ち上げて肺を切除しながら結合組織を切断する。
13. 肺からそれを取り除くために心臓をカットします。
14. 肺にマウスIDまたは研究IDでラベル付けされたカセットを置き、カセットを10%緩衝ホルマリンに入れ、24〜48時間固定します。肺は、必要に応じて1年以上固定剤に残すことができます。
15. 肺を含むカセットを70%エタノールに移し、占いの処理に進みます。

結果

上記のプロトコルはマウス肺の速い潅流、膨張および固定を可能にする。以下の図は、各ステップの重要性を表しています。 図1 は、灌流ステップがスキップされたか、肺が正しく穿フューする失敗したPBSおよび肺と浸透したH&E染色された肺を示している。示されているように、不十分な浸透性肺の過剰な血液は理想的な構造学よりも少なく、肺アーキテクチャを完全?...

ディスカッション

マウス肺の灌流、膨張、および固定のために上記の手順は、肺腫瘍組織学および病理解析のためのマウス肺の迅速かつ効率的な調製に最適である。この手順は特別な装置を必要とせず、マウス1個につき6分以内に実行できます。この手順では、インフレや一定の流体圧力に固定体積は必要ありません。この手順は標準化されていないため、肺の立体学的または形態測定を行うことを望む人に?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428