Перфузия и инфляция мышиного легкого для гистологии опухолей

Резюме

Целью данного метода является представление простого и эффективного метода перфузии, инфляции и фиксации легких мыши для исследования патологии опухоли легких и оценки метастазов в легкие.

Аннотация

Способность оценивать гистологию легких имеет решающее значение для областей исследований рака легких и метастазов рака. Не менее важно проводить некропсию быстро и эффективно из исследований, не жертвуя качеством закупаемых тканей. Цель этого протокола состоит в том, чтобы представить метод быстрого окутывания, надувания и фиксации легких мыши для гистологического анализа ниже по течению. Этот метод не стандартизирует инфляцию легких; таким образом, он не требует каких-либо специальных процедур или оборудования, а вместо этого просто прививает фиксатор непосредственно через трахею после перфузии через сердце. Это позволяет достаточно оценить размер опухоли, гистологию и скоринг. Это также позволяет для сбора замороженных тканей до фиксации легочной ткани. Этот метод ограничен в том, что он не позволяет позднее морфометрической количественной оценки легких; однако, это более чем достаточно для анализа опухоли легких с генетически модифицированных моделей мыши (GEMMs), сингенеических моделей, а также ксенотрансплантатной опухоли и метастазирования исследований.

Введение

Различные мыши модели онкогенеза легких и метастазов рака в легкие существуют, начиная от сложных GEMMs к канцерогенным моделям сингенеических и ксенотрансплантных моделей, где раковые клетки вводят через интракардию, интраторакальные, хвостовой вены, или другие методы для создания опухолей в легких. Все эти модели имеют общую потребность в гистологической оценке гистологии легких и патологии. Таким образом, необходимо иметь надежный, но быстрый метод для выполнения некропсии мышей при перфузации легких, чтобы удалить избыток крови, и надувание и фиксация легких, чтобы четко визуализировать архитектуру легких. Скорость является важнейшим компонентом этой процедуры, как это может быть необходимо для сбора легких от десятков мышей в одной точке времени. Эта процедура может быть выполнена менее чем за 6 минут на мышь.

Хотя эта процедура более чем достаточна для оценки гистологии опухоли, она не рекомендуется для тех, кто хочет выполнить стереологию или морфометрические измерения легких. Такие измерения требуют стандартизации инфляции легких, а также расчета абсолютной площади поверхности легких, абсолютного объема и альвеолярного размера и^{числа 1.} Этот метод также не является оптимальным для некоторых подходов к визуализации. Например, визуализация легких с помощью КТ для экз-виво морфометрического анализа требует, чтобы легкие оставались заполненными воздухом^2. Когда сохранение воздушного пространства и размеров являются главной заботой, рекомендуется исправить легкие перфузии обезвоживания^{методы 3,4}. Одной из самых больших проблем этой модели является возможность разрыва альвеолярных стен, уменьшая ее использование в исследованиях эмфиземы; однако, рекомендуемая процедура фиксации легких для изучения эмфиземы по-прежнему очень похожа, так как рекомендуется исправить легкие либо путем внутритрахеальной закапывания 10% формалина (по аналогии с протоколом, описанным здесь) при постоянном давлении жидкости или путем фиксации^{на месте 5.}

Преимущество описанной процедуры здесь заключается в том, что она не требует постоянного давления жидкости, вместо этого раздувая легкие, пока они полностью не расширились, тем самым уменьшая время, необходимое для процедуры. Описанная здесь процедура очень напоминает методы, рекомендованные арсеналом Общества токсикологической патологии, где был сформирован подкомитет для рекомендации лучших методов фиксации легких для токсикологических исследований. Большинство ученых в рамках этого подкомитета рекомендовал фиксации легких путем интратрахеальной прививки шприцем, хотя были различные рекомендации о времени, когда легкое осталось в^{фиксатор 6}. Таким образом, в то время как различные методы инфляции легких и фиксации существуют, метод, описанный в настоящем предлагается в качестве оптимального метода для быстрого раздувания и фиксации легких для вниз по течению гистологической оценки опухоли.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Алабамы в Бирмингеме.

1. Экспериментальный протокол

1. Пожертвуйте мышью с помощью утвержденного метода IACUC. Здесь мы использовали вывих шейки матки мыши, анестезированной 5% изофлюраном. Используйте соответствующую мышь для исследования; здесь мы используем 8-недельную мышь FVB
2. Используя хирургические ножницы, сделайте горизонтальный разрез диаметром 3,5-5 мм в середине нижней части живота. Затем вставьте хирургические ножницы в небольшое отверстие, созданное из разреза, и вырежьте вертикально вверх по центру средней линии чуть ниже шеи мыши.
3. Потяните кожу назад пальцами и осмотрите подмышки лимфатических узлов.
4. Используя хирургические ножницы, сделайте боковой разрез диаметром 3,5 мм, чтобы открыть брюшную полость, а затем разрежьте в передней части до нижней части грудной клетки. Осмотрите органы брюшной полости: печень, селезенку, почки и т.д.
5. С плоской хирургических ножниц, или с помощью типсов, переместить печень подвергать диафрагмы. Осмотрите диафрагму на рост опухоли или метастазы. Затем аккуратно перерезайте диафрагму с правой стороны оператора, что позволит ей расшириться. Аккуратно вырезать диафрагму справа налево, чтобы разоблачить грудной полости и легких. Будьте осторожны, чтобы не сократить легкие.
6. Разрежьте боковой экстрим левой грудной клетки (справа оператора) для осмотра левой доли легких.
7. Аккуратно переместите правую долей легкого в сторону и разрежьте боковой экстрим правой грудной клетки и удалите грудную клетку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление грудной клетки является необязательным, хотя удаление позволяет более четкое представление о более поздней инфляции легких.
   1. Если требуется свежая или замороженная легочная ткань, используйте гемостатические типсы, чтобы зажать бронховую левую долей и повторно зарезать левое легкое с помощью хирургических ножниц до перфузии.
8. Используя типсы, чтобы поднять ткань, покрывающую трахею, отрезать любые лишние ткани. Затем аккуратно вырезать тонкую ткань подкладка трахеи подвергать дыхательных путей.
9. Прорезать почечную артерию хирургическими ножницами.
10. Чтобы окусать легкие, используйте шприц 3 мл с иглой 22 G для введения 1x PBS с 10 U/mL гепарином в правый желудочек сердца. Медленно пронизыв легкие со стороны pbs/heparin со стороны примерно 300 мкл/с. Легкие часто становятся белыми. 2,5 мл PBS обычно используются на этом этапе.
11. Для инфляции легких используйте шприц 3 мл с иглой 22 Г, на этот раз параллельно трахее. Вставьте иглу в трахею и ввимите 10% формалин со скоростью потока не более 200 мкл/с до тех пор, пока легкие полностью не раздуты. После того, как легкие надуты, формалин будет обратно из трахеи. Держите иглу на месте еще несколько секунд, а затем снять.
    1. (По желанию) Перед снятием иглы и легких инфляции, использовать шовную нить, чтобы связать трахеи. Для достижения этой цели используйте 4 дюйма швового потока, удерживая точку нити небольшой парой типсов. Поместите нить на спинной стороне трахеи и вытащить, чтобы сделать петлю вокруг иглы. Затем сделайте сверху узел вокруг иглы. Вытяните узел плотно, снимите иглу с трахеи, закройте узел.
12. Используйте типсы, чтобы поднять сердце, вставить хирургические ножницы прямо за легкими, и сократить соединительной ткани при подъеме сердца, чтобы перерезать легкие.
13. Вырежьте сердце, чтобы удалить его из легких.
14. Поместите легкие кассету с надписью мыши ID или исследование ID. Поместите кассету в 10% буферных формалин и исправить на 24-48 ч. Легкие могут быть оставлены в фиксаторе в течение года при желании.
15. Перенесите кассету, содержащую легкие, на 70% этанол и приступайте к обработке для гистологии.

Результаты

Вышеупомянутый протокол позволяет быстро перфузии, инфляции и фиксации легких мыши. Цифры, показанные ниже, отражают важность каждого шага. На рисунке 1 изображены окрашенные легкие, которые были пронизаны PBS и легких, в которых шаг перфузии был пропущен или легкие не см?...

Обсуждение

Описанная выше процедура перфузии, инфляции и фиксации легких мыши идеально подходит для быстрой и эффективной подготовки легких мыши к гистологии опухоли легких и анализу патологии. Процедура не требует специального оборудования и может быть выполнена менее чем за 6 минут на мышь. Пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% buffered formalin	Fisher	23-245685
22 G Needle	BD	305155
3 mL syringe	BD	309656
70% Ethanol	Decon	2405
Forceps	Harvard Apparatus	72-8595
Heparin	Fisher	H19
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning	21-030-CV
Surgical scissors	Harvard Apparatus	72-8428