לחיתוך וליפיד Droplet כתמים של Oenocytes בתוך דרוזופילה הזחלים

Summary

הציגו כאן הן שיטות מפורטות לחיתוך וליפיד droplet כתמים של oenocytes ב הזחלים Drosophila ילה באמצעות BODIPY 493/503, שומנים בצבעי פלורסנט ספציפי לשומנים.

Abstract

שומנים חיוניים להתפתחות בעלי חיים והומאוסטזיס פיזיולוגי. דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים מביא לפגמים התפתחותיים שונים ומחלות, כגון השמנת יתר ושומן בכבד. בדרך כלל, שומנים מאוחסנים טיפות שומנים בדם, אשר הם שומנים משולבים אחסון השומנים בתאים. טיפות ליפיד משתנות בגודל ובמספר ברקמות שונות ובתנאים שונים. זה דווח כי טיפות השומנים מבוקרת היטב באמצעות רגולציה של biogenesis שלה השפלה. ב Drosophila ילה melanogaster, oenocyte היא רקמה חשובה עבור חילוף החומרים לשומנים והוא זוהה לאחרונה בתור הכבד האנושי אנלוגי לגבי הגיוס השומנים בתגובה ללחץ. עם זאת, המנגנונים המשמשים את הוויסות של מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes להישאר חמקמק. כדי לפתור בעיה זו, הוא בעל חשיבות עליונה כדי לפתח שיטה אמינה ורגישה כדי להמחיש ישירות שינויי שומנים דינמיים oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. ניצול של ליפופילית BODIPY 493/503, השומנים droplet ספציפי לצבוע פלורסנט, תיאר כאן הוא פרוטוקול מפורט עבור הניתוח והoenocytes השומנים הבאים מכתים בתוך הזחלים של דרוזופילה בתגובה לרעב. זה מאפשר ניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה השומנים בתנאים שונים על ידי קונפוקלית יקרוסקופיה. יתר על כן, זו שיטה מהירה ומאוד הניתנת לכימות יכול לשמש גם במסכים גנטיים עבור משיניים גורמים גנטיים הרומן מעורבים מטבוליזם droplet השומנים ב oenocytes ורקמות אחרות.

Introduction

שומנים חיוניים להישרדות התא. בנוסף התפקיד המסורתי שלהם כמו רכיבים בלתי נפרד של מערכות קרום התאית, שומנים גם לשחק פונקציות מכריע אספקת אנרגיה ו איתות התמרה ברחבי מחזורי חיים של חיות בודדות¹. כך, חילוף החומרים של השומנים חייב להתאים תקנות קפדנית כדי לשמור על הומוסטאזיס פיסיולוגיים בתאים. ידוע כי דיסרגולציה של מטבוליזם השומנים תוצאות מחלות שונות, כגון סוכרת ושומן בכבד. למרות החשיבות הרבה של חילוף החומרים לשומנים בבריאות בעלי חיים, המנגנונים הבסיסיים רגולציה מטבוליזם להישאר במידה רבה לא ידוע.

דרוזופילה שימש באופן נרחב במשך שנים מאז פרופ ' תומס ה. מורגן התחיל להשתמש בהם במחקרים הכרוכים בגנטיקה ושאלות אחרות ביולוגיות בסיסיות². בעשורים האחרונים, ראיות מתפתחות הראו כי drosophila ילה היא אורגניזם מודל מצוין במחקר של מחלות מטבוליזם רבים הקשורים להשמנת יתר, כגון השמנה^1,3. במיוחד, מניות Drosophila ילה שמרו באופן מאוד גנים מטבוליים עם בני אדם ובעלי הרקמות הרלוונטיות דומה/איברים סוגי תאים עבור חילוף החומרים השומנים.

לדוגמה, הגוף השמן של דרוסופילה, האחראי על האחסון הטריליגליליד, מתפקד בדומה לרקמת השומן האנושית. לאחרונה, אשכול של תאים המקצועית כמו hepatocyte (כלומר, oenocytes), אשר דווחו להיות אנלוגי פונקציונלי לכבד האדם, הוכחו להיות מעורבים בחומצות שומן ומטבוליזם פחמימנים של פירות זבובים^4,5. בדומה למקרה של יונקים כבדים, oenocytes להגיב לרעב על ידי הפעלת היווצרות droplet השומנים בשני הזחל ומבוגרים drosophila ילה, וכתוצאה מכך הצטברות droplet השומנים ב oenocytes^4,6,7,8. מבחינה אנטומית, oenocytes הם מחוברים היטב את המשטח הפנימי הבסיס של האפידרמיס לרוחב באשכולות של כ שישה תאים לכל פלח הבטן, מה שהופך אותו מאוד מסוגל לבודד אשכולות oenocyte מן האפידרמיס. כך, oenocytes חייב להיות מחובר האפידרמיס במהלך ניתוח וכתמים.

שומנים מאוחסנים בצורה של טיפות שומנים בדם, אשר אורגלים עם ממברנות שכבה אחת בתאים⁹. טיפות השומנים להתקיים כמעט כל סוגי התאים על פני זנים שונים¹⁰. השומנים הדינמיקה droplet, כולל גודלו ומספר, שינוי בתגובה לגורמי הסביבה. הדבר נחשב כהשתקפות של מצב חילוף החומרים בתגובה למתח, כגון הזדקנות ורעב^7,8. לכן, זה חשוב מאוד לפתח שיטה אפשרית ואמינה כדי לקבוע את השומנים droplet הדינמיקה oenocytes במהלך הפיתוח ובתנאים מלחיצים. בפרט, הזחלים הoenocytes השלישי, מכילים מעטים או לא לגילוי טיפות שומנים תחת התנאים האכילים, אבל הם מכילים רבים טיפות השומנים גדול לאחר מחסור בתזונה⁴. כדי לאמת את האפקטיביות של שיטה זו, הוא הציע לבצע כתמים droplet השומנים ב oenocytes תחת תנאים מורעבים.

כיום, מספר צבעים ליפופילית זמינים לצביעת טיפות שומנים בדם, כגון צבעי פלורסנט בסודאן שחור ושמן אדום וצבעי פלורסנט הנילוס אדום BODIPY 493/503¹¹. סודן שחור, שמן אדום O משמשים בדרך כלל עבור cholesteryl אסטרים רקמות triacylglycerols ניתן לזהות בקלות על ידי מיקרוסקופ אור. עם זאת, כתמים ברקע גבוה יחסית ברזולוציה נמוכה יחסית הם שני גורמים מגבילים עבור היישומים שלה בניתוח איכותני של שומנים בדינמיקה droplet. כדי להתגבר על מגבלות של צבעי פלורסנט, הנילוס אדום ו BODIPY 493/503 מנוצלים כתחליף אידיאלי עבור כתמים droplet השומנים. זה דווח כי הנילוס אדום יכול גם לזהות כמה כולסטרול שאינו מתאים, מה שהופך bodipy 493/503 צבע ספציפי יותר עבור טיפות השומנים הסלולר, במידה מסוימת^12,13,14.

מעל לכל, כדי למלא את הצורך בניתוח מהיר ורגיש של טיפות שומנים בדם ב oenocytes, פרוטוקול זה מציג שיטה אפשרית ומאוד הניתן לשימוש של fixative מבוססי שומנים באופן ספציפי droplet-ספציפיים באמצעות BODIPY 493/503 כמו צבע הכתם. בדו ח זה, oenocytes הם גזור, ו bodipy 493/503 משמש לצביעת droplet השומנים בoenocytes, שבו טיפות שומנים מזוהים על ידי מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. הקלות והנוחות ביותר של הליך זה הופכים אותו לאידיאלי עבור שינוי ושימוש נוסף ביישומים אחרים, כגון הזרימה cy, try.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הנחת ביצים

1. הכינו את האוכל הרגיל לארוחות מקורנות להנחת ביצים.
   הערה: לקבלת מתכון והליך בישול עבור מזון רגיל הארוחה תירס בשימוש כאן, לראות את הפרטים שפורסמו בעבר¹⁵.
2. הכנת שמרים טריים להדביק על ידי הוספת 6 מ ל של מים מזוקקים 4 גרם שמרים מיובשים פעילים ב 50 mL צנטריפוגלי צינור. השתמש במרית כדי לערבב ולבצע הדבקה.
3. הפוך בקבוקי הנחת ביצים על ידי מילוי מזון הארוחה תירס לתוך הבקבוקים ולהתפשט כ 1 גרם שמרים להדביק על פני השטח של אוכל תירס עם מרית.
4. מניחים את הזבובים של הגנוטיפים הרצויים בבקבוק הנחת ביצים ומניחים אותו בחממה עם טמפרטורה קבועה של 25 ° c ולחות של 60%.
   הערה: צלבים אידיאליים בדרך כלל מורכב של 150 בתולה זבובים לפחות 75 זכרים. שמירה על זבובים בחושך על ידי הצבת קופסת אור על הבקבוקים הטלת ביצה יגדיל את שיעור רבייה.
5. לפני איסוף ביצים, לאפשר לזבובים להטיל ביצים 1 h כדי לאפשר הסרת כל הביצים הישנות שנשארות מאוחסנים ההטלה הנשי.
6. תן לזבובים להטיל ביצים בבקבוק חדש להנחת ביצים עבור 1 h ולהסיר את המבוגרים מן הבקבוק.
   הערה: שלוט בזמן הנחת הביצה כדי למזער את הטווח ההתפתחותי על מנת להשיג זחלים בשלב התפתחותי בולט בדיוק.
7. לאפשר את הביצים לפתח עבור 84 h לתוך הזחלים השלישי באינקובטור בחממה ב 25 ° c עם מחזור אור/12 h 12 h/כהות.

2. הרעב טיפול הזחלים

הערה: כפי שהוזכר לעיל, ב הזחלים השלישי, יש מעט או לא ניתן לגילוי טיפות שומנים בoenocytes תחת תנאי האכלה נורמלית, אבל טיפות שומנים גדולים רבים יכול להיגרם oenocytes תחת תנאי לחץ, כגון רעב. כדי לוודא עוד שיטה זו, יש צורך לטפל הזחלים האלה כדי לגרום לשומנים droplet biogenesis ב oenocytes. כאן, קורס זמן הרעבה של 12 h, 24 שעות, ו 36 h נבחר כפרדיגמה. בפרט, תקופה קצרה של רעב (למשל, 3 שעות) הוא מספיק כדי לזרז טיפות השומנים לגילוי ב oenocytes. משך הרעב עשוי להשתנות בהתאם למטרות ולהגדרות נסיוניות ספציפיות.

1. הופכים את הלשכה. לרעב ולטיפול בשליטה
   1. לחדרי הטיפול ברעב: מניחים נייר מסנן בגודל מתאים בצלחת פטרי של 6 ס"מ ובפיפטה 1 מ ל של PBS על נייר הסינון.
   2. לחדרי טיפול בשליטה: מקום 5 מ ל של בלומינגטון מזון רגיל לארוחה בצלחת פטרי.
2. השתמשו במרית כדי לחפור בעדינות את שכבת המזון העליונה המכילה זחלים שעדיין חופרים במזון ומעבירים אותם לצלחת פטרי המלאה ב -5 מ ל של PBS. מערבבים בעדינות את הזחלים ב-PBS כדי להסיר כל זיהום מזון מן הזחלים ולעשות את זה נקי ככל האפשר.
3. השתמש במכחול קטן כדי לאסוף 40 הזחלים השלישי של באותו גודל משוער. למיין אותם אקראית לתוך הרעבה או תא בקרה, עם 20 הזחלים כל אחד.
4. מניחים את התאים בחממה ב -25 ° c עם 60% לחות ומאפשרים פיתוח של 12 שעות, 24 שעות, ו 36 h של טיפול.
   הערה: עבור הזחלים בחדר הרעב, להוסיף 1 מ ל של PBS כל 12 h כדי למנוע התייבשות הזחלים.

3. חיתוך הOenocytes

1. השתמש במכחול קטן כדי לקטוף הזחלים של הגיל המתאים (12 h, 24 שעות, או 36 h לאחר הטיפול), ואז להעביר אותם לצלחת פטרי חדשה מלאה 5 מ ל של PBS קר קרח לשטוף.
   הערה: חזור על השלב 2.2 כאשר התמודדות עם הזחלים בחדר הבקרה כדי להסיר את כל זיהום המזון.
2. למלא צלחת הניתוח עם PBS קר קרח ולהשתמש מלקחיים כדי להעביר הזחלים בעדינות לתוך לוחית הניתוח. שים את לוחית הניתוח תחת מיקרוסקופ סטריאו לשלב הניתוח הבא.
   הערה: טמפרטורת הקרח הקרה תסייע לתנועות. איטיות של הזחלים ולהקל על הניתוח
3. להפוך את הזחלים בצד העמוק למעלה ולמטה למטה בעדינות להחזיק במקום באמצעות מלקחיים. יש לאבטח את הזחלים במשטח הניתוח על-ידי הצבת סיכת חיתוך למרות הלוע בקצה הקדמי וסיכה נוספת בקצה האחורי.
   הערה: הצד השני מזוהה בקלות על ידי נוכחות של הגזעים הצדדיים של קנה הנשימה.
4. השתמש במספריים של Vannas האביב כדי לפרוץ (longitudinally) דרך האפידרמיס מן הקדמי אל הקצה האחורי.
5. להסיר את הרקמה הפנימית של האפידרמיס באמצעות מלקחיים.
   הערה: יש לנקוט זהירות בעת הסרת ענפי הקנה כדי למנוע נזק לoenocytes, אשר מותאמים למשטח הפנימי של האפידרמיס.
6. עם מלקחיים, לאחזר את סיכות לחיתוך ולהעביר את האפידרמיס לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL ממולא PBS על הקרח.
7. המשיכו לנתח זחלים אחרים בעקבות ההליך המתואר לעיל.

4. שומנים בצביעת Droplet

1. דגירה את האפידרמיס בגזור ב בופה קיבעון עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על מסובבי.
   הערה: מאגר הקיבעון מכיל 4% פאראפורמלדהיד (בארה ב) ב-PBS.
2. הסר את מאגר הקיבעון, ואחריו כביסה מהירה. כדי לבצע כביסה מהירה, להוסיף 1 מ ל PBS ב RT לתוך הצינור לאחר הסרת התחתית, בעדינות להשהות את הרקמות, ולמחוק את ה-PBS.
   זהירות: מאגר הקיבעון מכיל את התחום הה, המזיק לבריאות האדם. חשוב להיפטר כראוי את מאגר הקיבעון כפסולת מסוכנת.
3. לשטוף את הדגימות 3x עבור 5 דקות כל אחד עם PBS לשטוף את כל שאריות הכדורגלן האפשרי.
4. דגירה את האפידרמיס עם BODIPY 493/503 (1 μg/mL; ראה טבלה של חומרים) עבור 30 דקות ב-RT על מסובבי.
   הערה: משלב זה ואילך, לעטוף את שפופרת מיקרוצנטריפוגה עם פיסת רדיד אלומיניום כדי להגן על דגימות מהאור ולמזער את התמונה האפשרי הלבנת.
5. הסר את הפתרון BODIPY 493/503 כתמים ולשטוף את דגימות 3x עבור 10 דקות כל אחד עם PBS כדי להסיר לחלוטין צבעים שיורית.

5. הרכבה והדמיה

1. מקום 6 μL של הרכבה בינונית על שקופית נקייה של מיקרוסקופ.
   הערה: אמצעי הרכבה משמש לזמן זיהוי ארוך יותר המבוסס על מאפייני העמעום שלו.
2. מלקחיים להשתמש כדי להרים את האפידרמיס אחד בעדינות להסיר את שרידי PBS עם מחיקה.
3. מניחים את האפידרמיס בתוך המדיום הגובר ומתאימים את האוריינטציה שלו כך שהמשטח הפנימי שלו המכיל את הoenocytes הוא בתחתית והמשטח החיצוני שלו הוא על החלק העליון.
4. בעדינות למקם שמיכות על האפידרמיס.
   הערה: להסיר כל מדיום הרכבה נוספת דולף מתחת הכיסויים עם מחיקה, במידת הצורך. כדי להקל על הדמיה, בעדינות לדחוף למטה על coverslip עם מלקחיים כך כאשר התבוננות השקופית דרך המיקרוסקופ, האשכול oenocyte יכול להיות בקלות הדמיה במישור אחד בודד. לחילופין, זה מעשית לחתוך את האפידרמיס לתוך שני למחצה האפידרמיס דרך קו האמצע כדי למנוע גלגול של האפידרמיס כולו כאשר הרכבה הרקמות.
5. החל לק ברור ציפורניים סביב קצות שמיכות כדי לאטום.
6. שימו את השקופיות בתיבה לדוגמא לאור הזכוכית ואפשר לק הציפורן להתייבש ב RT, אשר עשוי להימשך 5-10 דקות.
7. . המשיכי בניתוח מיקרוסקופי צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית (הגדלה של 63 x עם הגדרות מסנן gfp או fitc אופטימיזציה, עירור = 488 nm, פליטה = 503 nm) כדי לרכוש אותות נקיים ורגישים עם רקע ממוזער.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

ביצוע מוצלח של הליך זה צריך לגרום טיפות שומנים ברורים מכתים שחושף את מספר וגודל של טיפות השומנים ב oenocytes. איור 1a, A ', a ' ' מראה כי יש כמה טיפות השומנים לזיהוי (נקודות ירוקות) בoenocytes של הזחלים האכלה נורמלית במהלך שלבים התפתחותיים שונים. איו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

בין המפורטים לעיל, קיימים מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול זה, כאשר הביצה מניחה את תקופת הזמן להיות אחת מאלה. כרקמה מoenocyte ליפיד, מדובר ברגישות גבוהה למצב תזונה^6,8. פרקי זמן ממושכים להנחת ביצים עלולים לגרום לזחלים מוארכים ולתחרות מזון מוגברת, המובילה לתוצאות לא מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Corning	430829	50 mL
6 cm Petri dish	Thermo Fisher	150326	6 cm
Agar			For fly food
Aluminum foil	N/A	N/A	Protect smaple from light
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Lipid droplet staining dye
Confocal microscope	Leica	Leica TSC SP5	Confocal imaging
Corn syrup			For fly food
Cornmeal			For fly food
Coverslip	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin	N/A	N/A
Dissection plate	N/A	N/A
Filter paper	N/A	N/A	Diameter: 11 cm
Fixation buffer	N/A	N/A	4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS
Forcep	Dumont	11252-30	#5
Incubator	Jiangnan	SPX-380	For fly culture
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Microscopy slide	Citoglas	10127105P-G
Mounting medium	VECTASHIELDAntifade Mounting Medium	H-1000	Antifade mounting medium
Nail polish	PanEra	AAPR419	Seal the coverslip
Paintbrush	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
Scissor	Smartdata Medical	SR81	Vannas spring scissor
Soy flour			For fly food
Spatula	N/A	N/A
Standard cornmeal food	N/A	N/A	Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope	Leica	Leica S6E	For tissue dissection
Wipe paper	N/A	N/A
Yeast			For fly food
yw	Kept as lab stock	N/A	Drosophila