Dissection et coloration des gouttelettes lipidiques des oenocytes dans les larves de Drosophila

Résumé

Présentés ici sont des méthodes détaillées pour la dissection et la coloration gouttelette de lipide des ovocytes dans les larves de Drosophila à l'aide de BODIPY 493/503, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques.

Résumé

Les lipides sont essentiels au développement des animaux et à l'homéostasie physiologique. La dysrégulation du métabolisme lipidique entraîne divers défauts et maladies du développement, tels que l'obésité et le foie gras. Habituellement, les lipides sont stockés dans des gouttelettes lipidiques, qui sont les organites multifonctionnels de stockage de lipides dans les cellules. Les gouttelettes lipidiques varient en taille et en nombre dans différents tissus et dans des conditions différentes. Il a été rapporté que les gouttelettes lipidiques sont étroitement contrôlées par la régulation de sa biogenèse et de la dégradation. Dans Drosophila melanogaster, l'oenocyte est un tissu important pour le métabolisme des lipides et a été récemment identifié comme un analogue du foie humain en ce qui concerne la mobilisation des lipides en réponse au stress. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la régulation du métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes restent insaisissables. Pour résoudre ce problème, il est de la plus haute importance de développer une méthode fiable et sensible pour visualiser directement les changements dynamiques des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. Profitant du BODIPY 493/503 lipophile, un colorant fluorescent spécifique aux gouttelettes lipidiques, décrit ici, est un protocole détaillé pour la dissection et la coloration subséquente des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes des larves de Drosophila en réponse à la famine. Cela permet une analyse qualitative de la dynamique des gouttelettes lipidiques dans diverses conditions par microscopie confocale. En outre, cette méthode rapide et hautement reproductible peut également être utilisée dans les écrans génétiques pour l'indentification de nouveaux facteurs génétiques impliquant le métabolisme des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes et autres tissus.

Introduction

Les lipides sont essentiels à la survie cellulaire. En plus de leur rôle traditionnel en tant que composants intégrals des systèmes de membrane cellulaire, les lipides jouent également des fonctions cruciales dans l'approvisionnement en énergie et la transmission de signalisation tout au long des cycles de vie des animaux individuels¹. Ainsi, le métabolisme des lipides doit se conformer à des règlements stricts pour maintenir l'hémostasie physiologique dans les cellules. On sait que la dysrégulation du métabolisme des lipides entraîne diverses maladies, comme le diabète et le foie gras. En dépit de la grande importance du métabolisme de lipide dans la santé animale, les mécanismes sous-jacents à la régulation de métabolisme de lipide restent largement inconnus.

Drosophila a été largement utilisé pendant des années depuis le professeur Thomas H. Morgan a commencé à les utiliser dans des études impliquant la génétique et d'autres questions biologiques de base². Au cours des dernières décennies, de nouvelles preuves ont montré que Drosophila est un excellent organisme modèle dans l'étude de nombreuses maladies associées au métabolisme des lipides, telles que l'obésité^1,3. En particulier, Drosophila partage des gènes métaboliques hautement conservés avec les humains et possède des tissus/organes et des types cellulaires pertinents similaires pour le métabolisme des lipides.

Par exemple, le corps gras de Drosophila, qui est responsable du stockage du triacylglycéride, fonctionne comme un tissu adipeux humain. Récemment, un groupe de cellules spécialisées de l'hépatocyte (c.-à-d., les oenocytes), qui ont été rapportés pour être un analogue fonctionnel au foie humain, ont été montrés pour être impliqués dans l'acide gras et le métabolisme d'hydrocarbures dans les mouches de fruit^4,5. Semblable au cas dans les foies de mammifères, les oenocytes répondent à la famine en activant la formation de gouttelettes lipidiques dans la drosophilelarvaire et adulte Drosophila , résultant en l'accumulation de gouttelettes lipidiques dans les ovocytes^4,6,7,8. Anatomiquement, les oenocytes sont étroitement attachés à la surface interne basale de l'épiderme latéral en grappes d'environ six cellules par hémisegment abdominal, ce qui rend impossible d'isoler les amas d'oenocytes de l'épiderme. Ainsi, les oenocytes doivent être attachés à l'épiderme pendant la dissection et la coloration.

Les lipides sont stockés sous forme de gouttelettes lipidiques, qui sont des organites avec des membranes à une seule couche dans les cellules⁹. Les gouttelettes lipidiques existent dans presque tous les types de cellules à travers différentes espèces¹⁰. La dynamique des gouttelettes lipidiques, y compris sa taille et son nombre, change en réponse aux facteurs de stress environnementaux. Ceci est considéré comme un reflet de l'état métabolique en réponse au stress, comme le vieillissement et la famine^7,8. Par conséquent, il est d'une grande importance de développer une méthode faisable et fiable pour déterminer qualitativement la dynamique des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes pendant le développement et dans des conditions stressantes. En particulier, dans la troisième larve instar, les ovocytes contiennent peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans des conditions nourries, mais ils contiennent de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques après la privation de nutrition⁴. Pour vérifier l'efficacité de cette méthode, il est suggéré d'effectuer la coloration des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes dans des conditions affamées.

Actuellement, plusieurs colorants lipophiles sont disponibles pour les gouttelettes lipidiques de coloration, tels que les colorants non fluorescents Soudan Noir et Huile Rouge O et colorants fluorescents Nile Red et BODIPY 493/503¹¹. Soudan Noir et Huile Rouge O sont couramment utilisés pour les esters de cholesteryl tissu et triacylglycérols et peuvent être facilement détectés par microscopie légère. Cependant, la coloration de fond relativement élevée et la résolution relativement basse sont deux facteurs limitants pour ses applications dans l'analyse qualitative de la dynamique de gouttelette de lipide. Pour surmonter les limites des colorants non fluorescents, Nile Red et BODIPY 493/503 sont utilisés comme substituts idéaux pour la coloration des gouttelettes lipidiques. Il a été rapporté que le rouge du Nil peut également détecter un certain cholestérol non stérilisé, ce qui rend BODIPY 493/503 un colorant plus spécifique pour les gouttelettes lipidiques cellulaires, dans une certaine mesure^12,13,14.

Par-dessus tout, pour répondre à un besoin d'analyse rapide et sensible des gouttelettes lipidiques dans les ovocytes, ce protocole présente une méthode faisable et hautement reproductible de coloration à base fixative de gouttelettes lipidiques spécifiques utilisant BODIPY 493/503 comme colorant de tache. Dans ce rapport, les oenocytes sont disséqués, et BODIPY 493/503 est employé pour la coloration de gouttelette de lipide dans les oenocytes, dans lesquels des gouttelettes de lipide sont détectées par microscopie confocale. La facilité et l'abordabilité de cette procédure le rendent idéal pour la modification et l'utilisation ultérieure dans d'autres applications, telles que la cytométrie de flux.

Protocole

1. Pontde d'oeufs

1. Préparer les aliments de semoule de maïs standard pour la ponte.
   REMARQUE: Pour la recette et la procédure de cuisson pour les aliments de semoule de maïs standard utilisés ici, voir les détails précédemment^{publiés 15}.
2. Préparer la pâte de levure fraîche en ajoutant 6 ml d'eau distillée à 4 g de levure séchée active dans un tube centrifuge de 50 ml. À l'emploi d'une spatule, mélanger et faire une pâte.
3. Faire des bouteilles de ponte en remplissant les aliments de semoule de maïs dans les bouteilles et étaler environ 1 g de pâte de levure sur la surface de la nourriture de semoule de maïs avec une spatule.
4. Placez les mouches des génotypes désirés dans une bouteille de ponte et placez-les dans un incubateur avec une température constante de 25 oC et une humidité de 60 %.
   REMARQUE: Les croisements idéaux se composent généralement de 150 mouches vierges et d'au moins 75 mâles. Garder les mouches dans l'obscurité en plaçant une boîte à l'épreuve de la lumière sur les bouteilles de ponte augmentera le taux de reproduction.
5. Avant la collecte des œufs, laisser les mouches pondre des œufs pendant 1 h pour permettre l'enlèvement de tous les vieux œufs qui restent stockés dans les oviductes femelles.
6. Laisser les mouches pondre des œufs dans une nouvelle bouteille de ponte pendant 1 h et retirer les adultes de la bouteille.
   REMARQUE: Contrôler le temps de ponte afin de minimiser l'aire de développement afin d'obtenir des larves à un stade de développement contrôlé avec précision.
7. Laisser les œufs se développer pendant 84 h dans la troisième larve instar de l'incubateur à 25 oC avec un cycle clair/foncé de 12 h/12 h.

2. Traitement de la famine pour les larves

REMARQUE: Comme mentionné ci-dessus, dans les troisièmes larves instar, il ya peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans les ovocytes dans des conditions d'alimentation normales, mais de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques peuvent être induites dans les ovocytes dans des conditions de stress, comme la famine. Pour vérifier davantage cette méthode, il est nécessaire de précéder ces larves pour induire la biogenèse des gouttelettes lipidiques dans les oenocytes. Ici, un cours de temps de famine de 12 h, 24 h et 36 h a été choisi comme paradigme. En particulier, une courte période de famine (p. ex., 3 h) est suffisante pour induire des gouttelettes lipidiques détectables dans les ovocytes. La durée de la famine peut varier selon des objectifs et des paramètres expérimentaux spécifiques.

1. Faites des chambres pour la famine et contrôlez les traitements.
   1. Pour les chambres de traitement de la famine : placez un papier filtre de taille appropriée dans un plat Petri de 6 cm et une pipette de 1 ml de PBS sur le papier filtre.
   2. Pour les chambres de traitement de contrôle : placez 5 ml d'aliments de semoule de maïs Standard Bloomington dans le plat Petri.
2. Utilisez une spatule pour déterrer délicatement la couche supérieure d'aliments contenant des larves qui s'enfouissent encore dans la nourriture et transférez-les dans un plat Petri rempli de 5 ml de PBS. Remuer délicatement les larves dans le PBS pour éliminer toute contamination alimentaire des larves et les rendre aussi propres que possible.
3. Utilisez un petit pinceau pour recueillir 40 larves instar tiers de la même taille approximative. Triez-les au hasard dans une chambre de famine ou de contrôle, avec 20 larves chacune.
4. Placez les chambres dans l'incubateur à 25 oC avec 60 % d'humidité et laissez le développement pendant 12 h, 24 h et 36 h de traitement.
   REMARQUE: Pour les larves dans la chambre de famine, ajouter 1 ml de PBS toutes les 12 h pour éviter la déshydratation des larves.

3. Dissection des oenocytes

1. Utilisez un petit pinceau pour cueillir des larves de l'âge approprié (12 h, 24 h ou 36 h après le traitement), puis transférez-les dans un nouveau plat Petri rempli de 5 ml de PBS glacé à laver.
   REMARQUE: Répétez l'étape 2.2 lorsque vous traitez avec des larves dans une chambre de contrôle pour éliminer toute contamination alimentaire.
2. Remplissez une plaque de dissection de PBS glacé et utilisez des forceps pour transférer délicatement les larves dans la plaque de dissection. Placez la plaque de dissection sous un microscope stéréo pour l'étape suivante de dissection.
   REMARQUE: La température glaciale aidera à ralentir les mouvements des larves et facilitera la dissection.
3. Tourner le côté ventral des larves vers le haut et le côté dorsal vers le bas et maintenir doucement en place à l'aide de forceps. Fixer les larves à la plaque de dissection en plaçant une goupille de dissection si le pharynx à l'extrémité antérieure et une autre broche à travers le spiracle à l'extrémité postérieure.
   REMARQUE: Le côté dorsal est plus facilement identifié par la présence des troncs dorsaux de la trachée.
4. Utilisez des ciseaux de printemps Vannas pour inciser (longitudinalement) à travers l'épiderme de l'antérieure à l'extrémité postérieure.
5. Enlever le tissu interne de l'épiderme à l'aide de forceps.
   REMARQUE: Il faut faire preuve de prudence lors de l'enlèvement des branches trachéales afin d'éviter des dommages aux œnocytes, qui sont localisés à la surface interne de l'épiderme.
6. Avec les forceps, récupérer les goupilles de dissection et transférer l'épiderme dans un tube microcentrifuge de 1,5 ml rempli de PBS sur la glace.
7. Continuer à disséquer d'autres larves suivant la procédure décrite ci-dessus.

4. Taches de gouttelettes de lipide

1. Incuber l'épiderme disséqué dans le tampon de fixation pendant 30 min à température ambiante (RT) sur un rotateur.
   REMARQUE: Le tampon de fixation contient 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans PBS.
2. Retirez le tampon de fixation, suivi d'un lavage rapide. Pour effectuer un lavage rapide, ajouter 1 mL de PBS à RT dans le tube après l'élimination de PFA, resuspendre doucement les tissus, et jeter le PBS.
   MISE EN GARDE: Le tampon de fixation contient PFA, qui est nocif pour la santé humaine. Il est important d'éliminer correctement le tampon de fixation en tant que déchets dangereux.
3. Laver les échantillons 3x pendant 5 min chacun avec PBS pour laver tous les résidus possibles de PFA.
4. Incuber l'épiderme avec BODIPY 493/503 (1 g/mL; voir Table of Materials) pendant 30 min à RT sur un rotateur.
   REMARQUE: À partir de cette étape, enveloppez le tube de microcentrifuge avec un morceau de papier d'aluminium pour protéger les échantillons de la lumière et minimiser le possible photo-blanchiment.
5. Retirez la solution de coloration BODIPY 493/503 et lavez les échantillons 3x pendant 10 min chacun avec PBS pour enlever complètement les colorants résiduels.

5. Montage et imagerie

1. Placer 6 'L de support de montage sur une lame de microscope propre.
   REMARQUE: Le support de montage est utilisé pour un temps de détection plus long en fonction de ses propriétés antifondues.
2. Utilisez des forceps pour ramasser un épiderme et retirez délicatement le PBS résiduel à l'utilisation d'une lingette.
3. Placez l'épiderme dans le milieu de montage et ajustez son orientation de sorte que sa surface interne contenant les ovocytes soit sur le fond et sa surface externe est sur le dessus.
4. Placez délicatement une feuille de couverture sur l'épiderme.
   REMARQUE: Retirez tout support de montage supplémentaire qui fuit sous la glissière de couverture avec une lingette, si nécessaire. Pour faciliter l'imagerie, poussez doucement vers le bas sur le bordereau avec des forceps de sorte que lors de l'observation de la diapositive à travers le microscope, l'amas d'oenocytes peut être facilement représenté dans un seul plan. Alternativement, il est possible de couper l'épiderme en deux semi-épiderme à travers la ligne médiane pour éviter le roulement de l'épiderme entier lors du montage des tissus.
5. Appliquer le vernis à ongles clair sur les bords de la glissière de couverture pour sceller.
6. Mettez les diapositives dans une boîte d'échantillon imperméable et laissez le vernis à ongles sécher à RT, ce qui peut prendre 5-10 min.
7. Procédez à l'analyse microscopique. Prenez des images à l'aide d'un microscope confocal (grossissement de 63x avec des réglages optimisés de filtre GFP ou FITC, excitation 488 nm, émission de 503 nm) pour acquérir des signaux propres et sensibles avec un fond réduit au minimum.

Résultats

L'exécution réussie de cette procédure devrait avoir comme conséquence la coloration claire de gouttelettes de lipide qui indique le nombre et la taille des gouttelettes de lipide dans les oenocytes. Figure 1A,A',A', A'' montre qu'il y a peu de gouttelettes lipidiques détectables (points verts) dans les oenocytes des larves d'alimentation normales à différents stades de développement. Figure 1B,B'...

Discussion

Parmi ceux décrits ci-dessus, il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole, avec la période de ponte d'oeufs étant l'un de ces. En tant que tissu mobilisateur de lipides, l'oenocyte est très sensible au statut nutritionnel^6,8. Des périodes prolongées de ponte peuvent entraîner une augmentation de la concurrence alimentaire avec les larves et les aliments, ce qui entraîne des résultats inexacts. La période de 1 h de pont utilisée dans ce protoco...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Corning	430829	50 mL
6 cm Petri dish	Thermo Fisher	150326	6 cm
Agar			For fly food
Aluminum foil	N/A	N/A	Protect smaple from light
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Lipid droplet staining dye
Confocal microscope	Leica	Leica TSC SP5	Confocal imaging
Corn syrup			For fly food
Cornmeal			For fly food
Coverslip	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin	N/A	N/A
Dissection plate	N/A	N/A
Filter paper	N/A	N/A	Diameter: 11 cm
Fixation buffer	N/A	N/A	4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS
Forcep	Dumont	11252-30	#5
Incubator	Jiangnan	SPX-380	For fly culture
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Microscopy slide	Citoglas	10127105P-G
Mounting medium	VECTASHIELDAntifade Mounting Medium	H-1000	Antifade mounting medium
Nail polish	PanEra	AAPR419	Seal the coverslip
Paintbrush	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
Scissor	Smartdata Medical	SR81	Vannas spring scissor
Soy flour			For fly food
Spatula	N/A	N/A
Standard cornmeal food	N/A	N/A	Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope	Leica	Leica S6E	For tissue dissection
Wipe paper	N/A	N/A
Yeast			For fly food
yw	Kept as lab stock	N/A	Drosophila