Drosophila Larvalarında Oenositlerin Diseksiyonu ve Lipid Damlacık Boyaması

Özet

Burada, lipit damlacılığa özgü floresan boya olan BODIPY 493/503 kullanılarak Drosophila larvalarında oenositlerin diseksiyon ve lipid damlacık boyama sıyrıklarının diseksiyonu ve lipid damlacık boyaması için ayrıntılı yöntemler sunulmuştur.

Özet

Lipidler hayvan gelişimi ve fizyolojik homeostaz için gereklidir. Lipid metabolizmasının disregülasyonu obezite ve yağlı karaciğer gibi çeşitli gelişimsel bozukluklar ve hastalıklarla sonuçlanır. Genellikle, lipid damlacıkları saklanır, hangi hücrelerde çok fonksiyonlu lipid depolama organelleri olan. Lipid damlacıkları farklı dokularda ve farklı koşullar altında boyut ve sayı değişir. Bu lipid damlacıkları sıkıca biyogenez ve bozulma nın düzenlenmesi ile kontrol edildiği bildirilmiştir. Drosophila melanogasterolarak , oenosit lipid metabolizması için önemli bir dokudur ve son zamanlarda strese yanıt lipid seferberliği ile ilgili bir insan karaciğer analog olarak tespit edilmiştir. Ancak, oenositlerde lipid damlacık metabolizmasının düzenlenmesinin altında yatan mekanizmalar zor olmaya devam etmektedir. Bu sorunu çözmek için, geliştirme sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamik değişiklikleri doğrudan görselleştirmek için güvenilir ve hassas bir yöntem geliştirmek son derece önemlidir. Lipofilik BODIPY 493/503 yararlanarak, bir lipid damlacık özgü floresan boya, burada açıklanan diseksiyon ve açlık yanıt olarak Drosophila larvaların oenositler sonraki lipid damlacık boyama için ayrıntılı bir protokoldür. Bu konfokal mikroskopi ile çeşitli koşullar altında lipid damlacık dinamikleri nitel analizi için izin verir. Ayrıca, bu hızlı ve son derece tekrarlanabilir yöntem de oenositler ve diğer dokularda lipid damlacık metabolizması içeren yeni genetik faktörlerin girintisi için genetik ekranlarda kullanılabilir.

Giriş

Lipidler hücre hayatta kalmak için gereklidir. Hücre zarı sistemlerinin ayrılmaz bileşenleri olarak geleneksel rolüne ek olarak, lipidler de enerji kaynağı ve tek tek hayvanların yaşam döngüleri boyunca transdüksiyon sinyal önemli işlevleri oynamak^1. Bu nedenle, lipid metabolizması hücrelerde fizyolojik hemostaz korumak için sıkı düzenlemelere uygun olmalıdır. Lipid metabolizmasının disregülasyonunun diyabet ve yağlı karaciğer gibi çeşitli hastalıklara neden olduğu bilinmektedir. Lipid metabolizmasının hayvan sağlığındaki büyük önemine rağmen, lipid metabolizması regülasyonunun altında yatan mekanizmalar büyük ölçüde bilinmemektedir.

Drosophila, profesör Thomas H. Morgan'ın genetik ve diğer temel biyolojik soruları içeren çalışmalarda kullanmaya başlamasından bu yana yıllardır yaygın olarak kullanılmaktadır². Son birkaç on yıl içinde, ortaya çıkan kanıtlar Drosophila obezite gibi birçok lipid metabolizması ile ilişkili hastalıkların çalışmada mükemmel bir model organizma olduğunu^{göstermiştir,}gibi¹,³. Özellikle, Drosophila insanlar ile son derece korunmuş metabolik genleri paylaşır ve lipid metabolizması için benzer ilgili doku / organ ve hücre tipleri sahip.

Örneğin, Drosophilayağ vücut , hangi triasilgliserit depolama sorumludur, insan yağ dokusuna benzer işlevleri. Son zamanlarda, insan karaciğerine fonksiyonel bir analog olduğu bildirilen özel hepatosit benzeri hücreler (yani, oenositler), meyve sinekler yağ asidi ve hidrokarbon metabolizması dahil olduğu gösterilmiştir bir küme^4,5. Memeli karaciğerlerinde olduğu gibi, oenositler hem larva hem de erişkin Drosophilalipid damlacık oluşumunu aktive ederek açlık yanıt , oenositlerde lipid damlacık birikimi ile sonuçlanan^4,6,7,8. Anatomik olarak, oenositler sıkıca abdominal hemisegment başına yaklaşık altı hücre kümeleri lateral epidermisin bazal iç yüzeyine bağlı, hangi epidermis oenosit kümeleri izole etmek için uygulanamaz hale getirir. Bu nedenle, diseksiyon ve boyama sırasında oenositler epidermis bağlı olmalıdır.

Lipidler lipid damlacıkları şeklinde depolanır, hangi hücrelerde tek katmanlı membranlar ile organeller olan⁹. Lipid damlacıkları farklı türler arasında hemen hemen tüm hücre tiplerinde var¹⁰. Lipid damlacık dinamiği, büyüklüğü ve sayısı da dahil olmak üzere, çevresel strese yanıt olarak değişir. Bu strese yanıt olarak metabolik durumun bir yansıması olarak kabul edilir, yaşlanma ve açlık gibi^7,8. Bu nedenle, gelişim sırasında ve stresli koşullar altında oenositlerde lipid damlacık dinamiklerini nitel olarak belirlemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem geliştirmek büyük önem taşımaktadır. Özellikle, üçüncü instar larva, oenositler beslenen koşullar altında az veya hiç saptanabilir lipid damlacıkları içeren, ancak beslenme yoksunluğu sonra çok sayıda büyük lipid damlacıkları içerir⁴. Bu yöntemin etkinliğini doğrulamak için, aç koşullar altında oenositlerde lipid damlacık boyama gerçekleştirmek için önerilmektedir.

Şu anda, birkaç lipophilic boyalar lipid damlacıkları boyama için kullanılabilir, nonfloresan boyalar Sudan Siyah ve Yağ Red O ve floresan boyalar Nil Kırmızı ve BODIPY 493/503¹¹gibi . Sudan Siyah ve Petrol Red O yaygın doku kolesteril esterleri ve triasilgliseroller için kullanılan ve kolayca ışık mikroskopisi ile tespit edilebilir. Ancak, nispeten yüksek arka plan boyama ve nispeten düşük çözünürlük lipid damlacık dinamikleri nitel analizinde uygulamaları için iki sınırlayıcı faktörlerdir. Floresan olmayan boyaların sınırlamalarını aşmak için Nil Kırmızısı ve BODIPY 493/503 lipid damlacık boyamaiçin ideal bir ikame olarak kullanılmaktadır. Bu Nil Kırmızı da bazı unesterified kolesterol tespit edebilirsiniz bildirilmiştir, hangi BODIPY yapar 493/503 hücresel lipid damlacıkları için daha spesifik bir boya, bir ölçüde^12,13,14.

Her şeyden önce, oenositlerde lipid damlacıklarının hızlı ve hassas analizi ihtiyacını karşılamak için, bu protokol leke boyası olarak BODIPY 493/503 kullanarak fiksatif tabanlı lipid damlacık özgü boyama uygulanabilir ve son derece tekrarlanabilir bir yöntem sunar. Bu raporda, oenositler kesilir ve BODIPY 493/503 oenositlerde lipid damlacık boyama için kullanılır, hangi lipid damlacıkları konfokal mikroskopi ile tespit edilir. Bu yordamın kolaylığı ve karşılanabilirliği, akış sitometrisi gibi diğer uygulamalarda modifikasyon ve daha fazla kullanım için idealdir.

Protokol

1. Yumurta Yumurtlama

1. Yumurta yumurtlamak için standart mısır unu gıda hazırlayın.
   NOT: Burada kullanılan standart mısır unu için tarifi ve pişirme prosedürü için, daha önce yayınlanan ayrıntıları¹⁵bakın .
2. 50 mL'lik bir santrifüj tüpe 4 g aktif kurumaya 6 mL distile su ekleyerek taze maya macunu hazırlayın. Karıştırmak ve bir hamur yapmak için bir spatula kullanın.
3. Mısır unu gıdaşişeiçine doldurarak yumurta yumurtlama şişeleri yapmak ve bir spatula ile mısır unu gıda yüzeyine maya ezmesi yaklaşık 1 g yayıldı.
4. İstenilen genotiplerin sineklerini bir yumurtlayan şişeye yerleştirin ve 25 °C sabit sıcaklık ve %60 nem ile bir kuvöze yerleştirin.
   NOT: İdeal haçlar genellikle 150 bakire sinek ve en az 75 erkek oluşur. Yumurta yumurtlayan şişelerin üzerine ışık geçirmez bir kutu yerleştirerek sinekleri karanlıkta tutmak üreme hızını artıracaktır.
5. Yumurta toplama önce, sinekler dişi oviducts saklanan kalan tüm eski yumurta ların kaldırılmasına izin vermek için 1 saat için yumurtlayın.
6. Sinekler 1 saat için yeni bir yumurta yumurtlama şişesinde yumurtlamak ve şişe den yetişkinler kaldırmak sağlar.
   NOT: Tam olarak kontrol edilen bir gelişim aşamasında larva elde etmek için gelişim aralığını en aza indirmek için yumurta yumurtlama süresini kontrol edin.
7. Yumurtaların 12 h/12 h ışık/karanlık döngüsü ile 25 °C'de kuvözdeki üçüncü instar larvasına 84 saat boyunca gelişmesine izin verin.

2. Larvalar için Açlık Tedavisi

NOT: Yukarıda belirtildiği gibi, üçüncü instar larvalarda, normal beslenme koşullarında oenositlerde az veya hiç saptanabilir lipid damlacıkları vardır, ancak açlık gibi stres koşulları altında oenositlerde çok sayıda büyük lipid damlacıkları indüklenebilir. Bu yöntemi daha fazla doğrulamak için, oenositlerde lipid damlacık biyogenezini indüklemek için bu larvaları pretreat etmek gerekir. Burada, 12 saat, 24 saat ve 36 saat lik bir açlık süresi paradigma olarak seçilmiştir. Özellikle, açlık kısa bir süre (örneğin, 3 saat) oenositlerde saptanabilir lipid damlacıkları neden etmek için yeterlidir. Açlık süresi belirli deneysel hedeflere ve ayarlara göre değişebilir.

1. Açlık ve kontrol tedavileri için oda olun.
   1. Açlık işleme odaları için: 6 cm Petri kabına uygun büyüklükte bir filtre kağıdı ve 1 mL PBS pipetini filtre kağıdına yerleştirin.
   2. Kontrol tedavi odaları için: Petri kabına 5 mL Bloomington standart mısır unu yiyeceği yerleştirin.
2. Hala gıda burrowing ve PBS 5 mL dolu bir Petri kabına aktarmak larva içeren gıda üst tabakası yavaşça kazmak için bir spatula kullanın. Larvalardan herhangi bir gıda kontaminasyonunu gidermek ve mümkün olduğunca temiz hale getirmek için PBS'deki larvaları hafifçe karıştırın.
3. Aynı yaklaşık boyutta 40 üçüncü instar larvaları toplamak için küçük bir paintbrush kullanın. Her biri 20 larva içeren bir açlık veya kontrol odasına rastgele sıralayın.
4. Odaları %60 nem oranıyla 25 °C'de kuvöze yerleştirin ve 12 saat, 24 saat ve 36 saat tedavi için geliştirmeye izin verin.
   NOT: Açlık odasındaki larvalar için, larva dehidratasyonını önlemek için her 12 saatte bir 1 mL PBS ekleyin.

3. Oenositdisedonu

1. Uygun yaş larvaları (12 saat, 24 saat veya 36 saat) almak için küçük bir fırça kullanın, ardından bunları 5 mL buz gibi PBS ile dolu yeni bir Petri kabına aktarın.
   NOT: Herhangi bir gıda kontaminasyonu kaldırmak için bir kontrol odasında larva ile uğraşırken adım 2.2 tekrarlayın.
2. Bir diseksiyon plakasını buz gibi PBS ile doldurun ve larvaları yavaşça diseksiyon plakasına aktarmak için çerkes kullanın. Aşağıdaki diseksiyon adımı için diseksiyon plakasını stereo mikroskop altına koyun.
   NOT: Buz gibi sıcaklık larvaların hareketlerini yavaşlatır ve diseksiyonu kolaylaştırır.
3. Larva ventral tarafını yukarı ve dorsal tarafı aşağı doğru çevirin ve forceps kullanarak nazikçe yerinde tutun. Ön uçta farinks ve arka uçta spiracle ile başka bir pin olsa bir diseksiyon pin yerleştirerek diseksiyon plakası için larva güvenli.
   NOT: Sırt tarafı en kolay trakea dorsal gövdeleri varlığı ile tanımlanır.
4. Vannas bahar makası kullanın (uzunlamasına) anterior dan arka sonuna epidermis yoluyla eğim .(uzunlamasına).
5. Forceps kullanarak epidermisin iç dokusunu çıkarın.
   NOT: Epidermisin iç yüzeyinde lokalize olan oenositlerin zarar görmesini önlemek için trakeal dalları çıkarılırken dikkatli olunmalıdır.
6. Forceps ile, diseksiyon pimleri almak ve buz üzerinde PBS dolu bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüp içine epidermis aktarın.
7. Yukarıda açıklanan prosedürü izleyerek diğer larvaları incelemeye devam edin.

4. Lipid Damlacık Boyama

1. Bir rotator üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika (RT) için fiksasyon tampon diseksiyon epidermis inkübül.
   NOT: Fiksasyon tamponu PBS'de %4 paraformaldehit (PFA) içerir.
2. Sabitleme tamponunu çıkarın ve ardından hızlı bir yıkama. Hızlı bir yıkama yapmak için, PFA'nın çıkarılmasından sonra tüpe RT'de 1 mL PBS ekleyin, dokuları nazikçe yeniden askıya alın ve PBS'yi atın.
   DİkKAT: Fiksasyon tamponu, insan sağlığına zararlı PfA içerir. Fiksasyon tamponunu tehlikeli atık olarak düzgün bir şekilde bertaraf etmek önemlidir.
3. Mümkün olan tüm PFA kalıntısını temizlemek için numuneleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile 3 kat yıkayın.
4. Epidermisin imal inkübesini BODIPY 493/503 (1 μg/mL; bkz. Malzeme Tablosu)30 dk boyunca RT'de bir rotator üzerinde kuluçkaya yatırın.
   NOT: Bu adımdan itibaren, numuneleri ışıktan korumak ve olası fotoğraf beyazlatma işlemini en aza indirmek için mikrosantrifüj tüpünü bir parça alüminyum folyo ile sarın.
5. BODIPY 493/503 boyama çözeltisini çıkarın ve artık boyaları tamamen çıkarmak için numuneleri pbs ile her biri 10 dakika boyunca 3x yıkayın.

5. Montaj ve Görüntüleme

1. Temiz bir mikroskop slaytına 6 μL montaj ortamı yerleştirin.
   NOT: Montaj ortamı, antifade özelliklerine göre daha uzun algılama süresi için kullanılır.
2. Bir epidermis almak ve hafifçe bir silme ile artık PBS kaldırmak için forseps kullanın.
3. Epidermisin montaj ortamına yerleştirin ve oryantasyonunu oenositleri içeren iç yüzeyinin altta, dış yüzeyinin üstte olması için ayarlayın.
4. Yavaşça epidermisin üzerine bir kapak kayması yerleştirin.
   NOT: Gerekirse kapak altından sızan ekstra montaj ortamını bir mendille çıkarın. Görüntülemeyi kolaylaştırmak için, mikroskoptaki slaytı gözlemlerken oenosit kümesinin tek bir düzlemde kolayca görüntülenebilmeleri için coverslip'i pİşplerle hafifçe aşağı doğru itin. Alternatif olarak, dokuları monte ederken tüm epidermisin yuvarlanmasını önlemek için epidermisin orta hattan iki yarı epidermisin içine kesilmesi uygulanabilir.
5. Mühür kapağının kenarlarına açık oje uygulayın.
6. Bir ışık geçirmez örnek kutusuna slaytlar koyun ve 5-10 dakika sürebilir RT, kuruoje izin verin.
7. Mikroskobik analize devam edin. En aza indirgenmiş arka planile temiz ve hassas sinyaller elde etmek için konfokal mikroskop (optimize GFP veya FITC filtre ayarları, uyarma = 488 nm, emisyon = 503 nm ile 63x büyütme) kullanarak görüntü alın.

Sonuçlar

Bu işlemin başarılı bir şekilde yürütülmesi, oenositlerde lipid damlacıklarının sayısını ve boyutunu ortaya çıkaran açık lipid damlacıklarının boyanması ile sonuçlanmalıdır. Şekil 1A,A',A'' farklı gelişim evrelerinde normal beslenme larvalarının oenositlerinde az sayıda saptanabilir lipid damlacıkları (yeşil nokta) olduğunu göstermektedir. Şekil 1B,B',B'' 12 h...

Tartışmalar

Yukarıda özetlenenler arasında, bu protokolde birkaç kritik adım vardır ve yumurtlama süresi bunlardan biridir. Bir lipid-mobilize doku olarak, oenosit beslenme durumuna son derece^{duyarlıdır 6,8}. Uzun süre yumurtlama süreleri kargalarva ve artan gıda rekabetine neden olabilir, yanlış sonuçlara yol açabilir. Bu protokolde kullanılan 1 saatlik yumurta yumurtlama süresi larvaların beslenme rekabeti olmadan gelişmesini sağlar. Daha uzun yumurtlam...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Corning	430829	50 mL
6 cm Petri dish	Thermo Fisher	150326	6 cm
Agar			For fly food
Aluminum foil	N/A	N/A	Protect smaple from light
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Lipid droplet staining dye
Confocal microscope	Leica	Leica TSC SP5	Confocal imaging
Corn syrup			For fly food
Cornmeal			For fly food
Coverslip	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin	N/A	N/A
Dissection plate	N/A	N/A
Filter paper	N/A	N/A	Diameter: 11 cm
Fixation buffer	N/A	N/A	4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS
Forcep	Dumont	11252-30	#5
Incubator	Jiangnan	SPX-380	For fly culture
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Microscopy slide	Citoglas	10127105P-G
Mounting medium	VECTASHIELDAntifade Mounting Medium	H-1000	Antifade mounting medium
Nail polish	PanEra	AAPR419	Seal the coverslip
Paintbrush	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
Scissor	Smartdata Medical	SR81	Vannas spring scissor
Soy flour			For fly food
Spatula	N/A	N/A
Standard cornmeal food	N/A	N/A	Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope	Leica	Leica S6E	For tissue dissection
Wipe paper	N/A	N/A
Yeast			For fly food
yw	Kept as lab stock	N/A	Drosophila