Рассечение и Липид капли пятно Эноцитов в Drosophila Larvae

Резюме

Представлены здесь подробные методы для вскрытия и липидных капель окрашивания эноцитов в личинки Drosophila с использованием BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей.

Аннотация

Липиды имеют важное значение для развития животных и физиологического гомеостаза. Дисрегуляция липидного обмена приводит к различным дефектам развития и заболеваниям, таким как ожирение и жировая печень. Как правило, липиды хранятся в липидных каплях, которые являются многофункциональными органеллами хранения липидов в клетках. Липидные капли различаются по размеру и количеству в разных тканях и при разных условиях. Сообщалось, что липидные капли жестко контролируются путем регулирования его биогенеза и деградации. В Drosophila melanogaster, эноцит является важной тканью для метаболизма липидов и недавно был определен в качестве аналога печени человека в отношении липидной мобилизации в ответ на стресс. Тем не менее, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидных капель в эноцитах остаются неуловимыми. Для решения этой проблемы крайне важно разработать надежный и чувствительный метод для непосредственной визуализации липидных капель динамических изменений в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. Воспользовавшись липофильной BODIPY 493/503, липидные капли конкретных флуоресцентных красителей, описанный здесь подробный протокол для вскрытия и последующего липидных капель окрашивания в эноциты личинки Дрозофилы в ответ на голод. Это позволяет качественно анализировать динамику липидных капель в различных условиях с помощью конфокальной микроскопии. Кроме того, этот быстрый и высоко воспроизводимый метод может также быть использован в генетических экранах для инидентификации новых генетических факторов, связанных с метаболизмом липидных капель в эноцитах и других тканях.

Введение

Липиды имеют важное значение для выживания клеток. В дополнение к своей традиционной роли в качестве интегральных компонентов клеточных мембранных систем, липиды также играют важнейшие функции в энергоснабжении и сигнализации трансдукции на протяжении всего жизненного цикла отдельных животных¹. Таким образом, метаболизм липидов должен соответствовать строгим правилам для поддержания физиологического гемостаза в клетках. Известно, что дисрегуляция липидного обмена приводит к различным заболеваниям, таким как диабет и жировая печень. Несмотря на большое значение метаболизма липидов в здоровье животных, механизмы, лежащие в основе регулирования метаболизма липидов, остаются в значительной степени неизвестными.

Дрозофила широко используется в течение многих лет, так как профессор Томас Х. Морган начал использовать их в исследованиях, связанных с генетикой и другими основными биологическими вопросами². В последние несколько десятилетий, новые данные показали, что Drosophila является отличной моделью организма в изучении многих липидных метаболизма связанных заболеваний, таких как ожирение^1,3. В частности, Drosophila делит высоки сохраненные метаболически гены с людьми и обладают подобными уместными тканями/органами и типами клетки для метаболизма липидов.

Например, жировое тело Дрозофилы,которое отвечает за хранение триацилглицерида, функционирует аналогично жировой ткани человека. В последнее время, кластер специализированных гепатоцитов, как клетки (т.е., эноциты), которые, как сообщается, функциональный аналог печени человека, было показано, что участвует в жирных кислот и углеводородного метаболизма у плодовых мушек^4,5. Как и в случае с печенью млекопитающих, эноциты реагируют на голод, активируя образование липидных капель как у личинок, так и у взрослых дрозофил,что приводит к накоплению липидных капель в эноцитах^4,6,8. Анатомически, эноциты плотно прикреплены к базальной внутренней поверхности боковой эпидермиса в кластерах примерно шесть клеток на гемиссегмент брюшной полости, что делает его невыполнимым, чтобы изолировать ээноциты кластеров от эпидермиса. Таким образом, эноциты должны быть прикреплены к эпидермису во время вскрытия и окрашивания.

Липиды хранятся в виде липидных капель, которые являются органеллами с однослойными мембранами в клетках^9. Липидные капли существуют почти во всех типах клеток различных видов^10. Динамика капель Липид, включая ее размер и количество, меняется в ответ на экологические стрессы. Это рассматривается как отражение метаболического статуса в ответ на стресс, такие как старение и голод^7,8. Поэтому очень важно разработать осуществимый и надежный метод для качественного определения динамики липидных капель в эноцитах во время разработки и в стрессовых условиях. В частности, в третьем instar личинок, эноциты содержат мало или нет обнаруживаемых липидных капель при кормах, но они содержат многочисленные большие липидные капли после лишения питания⁴. Для проверки эффективности этого метода, предлагается для выполнения липидных капель окрашивания в эноциты в голодных условиях.

В настоящее время несколько липофильных красителей доступны для липидных капель окрашивания, таких как нефторные красители Судан Черный и Масло Красный O и флуоресцентные красители Нила Красный и BODIPY 493/503¹¹. Судан Черный и Масло Красный O обычно используются для ткани холестерина эстеры и triacylglycerols и могут быть легко обнаружены с помощью световой микроскопии. Тем не менее, относительно высокое окрашивание фона и относительно низкое разрешение являются двумя ограничивающими факторами для его применения в качественном анализе динамики липидных капель. Для преодоления ограничений нефлуоресцентных красителей, Нил Красный и BODIPY 493/503 используются в качестве идеальной замены для липидных капель окрашивания. Было сообщено, что Нил Красный может также обнаружить некоторые unesterified холестерина, что делает BODIPY 493/503 более специфический краситель для клеточных капель липидов, в некоторой степени^12,13,14.

Прежде всего, для выполнения необходимости быстрого и чувствительного анализа липидных капель в эноцитах, этот протокол представляет собой осуществимый и высоко воспроизводимый метод фиксаторской основе липидных капель конкретных окрашивания с помощью BODIPY 493/503 как пятно красителя. В этом отчете, эноциты вскрыты, и BODIPY 493/503 используется для липидных капель окрашивания в эноциты, в которых липидные капли обнаруживаются с помощью конфокальной микроскопии. Простота и доступность этой процедуры делают ее идеальной для модификации и дальнейшего использования в других приложениях, таких как цитометрия потока.

протокол

1. Укладка яиц

1. Приготовьте стандартную пищу из кукурузной муки для откладки яиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для рецепта и процедуры приготовления стандартных продуктов кукурузноймуки, используемой здесь, см.
2. Подготовка свежих дрожжей пасты, добавив 6 мл дистиллированной воды до 4 г активных сушеных дрожжей в 50 мл центробежной трубки. Используйте шпатель, чтобы смешать и сделать пасту.
3. Сделать яйцекладка бутылки, заполнив кукурузную муку пищи в бутылки и распространение примерно 1 г дрожжевой пасты на поверхность кукурузной муки пищи с помощью шпателя.
4. Поместите мухи желаемых генотипов в яйцекладут бутылку и поместите его в инкубатор с постоянной температурой 25 градусов по Цельсию и влажностью 60%.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные кресты обычно состоят из 150 девственных мух и не менее 75 самцов. Ведение мух в темноте, поместив светонепроницаемый ящик над яйцекладкой бутылки увеличит скорость воспроизведения.
5. Перед сбором яиц, пусть мухи откладывают яйца на 1 ч, чтобы удалить все старые яйца, которые остаются храниться в женских яйцеклетки.
6. Пусть мухи откладывают яйца в новой яйцекладке бутылку на 1 ч и удалить взрослых из бутылки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контролируйте время откладки яиц, чтобы свести к минимуму диапазон развития, чтобы получить личинки в точно контролируемой стадии развития.
7. Разрешить яйца развиваться для 84 ч в третий instar личинок в инкубаторе на 25 градусов по Цельсию с 12 ч / 12 ч свет / темный цикл.

2. Голодное лечение для лирван

ПРИМЕЧАНИЕ: Как уже упоминалось выше, в третьем instar личинок, Есть несколько или нет обнаруживаемых липидных капель в эноцитах в нормальных условиях кормления, но многочисленные большие липидные капли могут быть вызваны в эноциты в условиях стресса, таких как голод. Для дальнейшей проверки этого метода, необходимо предварительно обработать эти личинки, чтобы вызвать биогенеза липидных капель в эноцитах. Здесь, время голода12h, 24 h, и 36 h было выбрано как парадигма. В частности, достаточно короткого периода голодания (например, 3 ч), чтобы вызвать обнаруживаемые липидные капли в эноцитах. Продолжительность голода может варьироваться в зависимости от конкретных экспериментальных целей и параметров.

1. Сделать камеры для голода и контроля лечения.
   1. Для обработки голодания камеры: поместите фильтровальную бумагу соответствующего размера в 6 см Петри блюдо и пипетка 1 мл PBS на фильтровальную бумагу.
   2. Для контрольной обработки камер: поместите 5 мл стандартной кукурузной муки Блумингтона в чашку Петри.
2. Используйте шпатель, чтобы аккуратно выкопать верхний слой пищи, содержащей личинки, которые все еще роются в пище и передать их в чашку Петри заполнены 5 мл PBS. Аккуратно перемешать личинки в PBS, чтобы удалить любое загрязнение пищевых продуктов из личинок и сделать его как можно более чистым.
3. Используйте небольшую кисть, чтобы собрать 40 третьих личинок instar того же приблизительного размера. Сортировать их случайным образом в голод или контрольной камеры, с 20 личинок каждый.
4. Поместите камеры в инкубатор при 25 градусах Цельсия с 60% влажностью и дайте развиваться 12 ч, 24 ч и 36 ч лечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для личинок в камере голодания, добавить 1 мл PBS каждые 12 ч, чтобы избежать обезвоживания личинок.

3. Рассечение эноцитов

1. Используйте небольшую кисть, чтобы выбрать личинки соответствующего возраста (12 ч, 24 ч, или 36 ч после лечения), а затем передать их в новое блюдо Петри заполнены 5 мл ледяной PBS для мытья.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 2.2 при работе с личинками в камере управления, чтобы удалить любое загрязнение пищевых продуктов.
2. Заполните пластину вскрытия с ледяной PBS и использовать щипцы, чтобы мягко передать личинки в вскрытие пластины. Положите пластину вскрытия под стерео микроскопом для следующего шага вскрытия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температура льда поможет замедлить движения личинок и облегчить рассечение.
3. Включите личинки вентральной стороны вверх и дорсальный стороны вниз и осторожно удерживайте на месте с помощью щипцы. Закрепите личинки к пластине вскрытия, поместив рассечение штифт, хотя глотки на передней части и другой контактный через спиракль на задней части.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее легко определить дорсальную сторону по наличию торцев трахеи.
4. Используйте весенние ножницы Vannas, чтобы резцы (продольный) через эпидермис от передней до заднего конца.
5. Удалите внутреннюю ткань эпидермиса с помощью щипц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При удалении ветвей трахеи необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать повреждения эноцитов, которые локализуются на внутренней поверхности эпидермиса.
6. С щипками, получить рассечение булавки и передать эпидермиса в 1,5 мл микроцентрифуг трубки заполнены PBS на льду.
7. Продолжайте вскрывать других личинок после описанной выше процедуры.

4. Липид капли окрашивания

1. Инкубация вскрытого эпидермиса в фиксированном буфере30 мин при комнатной температуре (RT) на ротаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер фиксации содержит 4% параформальдегида (PFA) в PBS.
2. Удалите буфер фиксации, а затем быстро промыть. Для быстрой стирки добавьте 1 мл PBS на RT в трубку после удаления PFA, аккуратно перенапрягит ткани и отбросьте PBS.
   ПРЕДЕКТО: Буфер фиксации содержит PFA, который вреден для здоровья человека. Важно правильно утилизировать буфер фиксации в качестве опасных отходов.
3. Вымойте образцы 3x в течение 5 минут каждый с PBS, чтобы вымыть все возможные остатки PFA.
4. Инкубировать эпидермис с BODIPY 493/503 (1 мкг/мл; см. Таблица материалов) в течение 30 минут на RT на ротаторе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: С этого шага вперед, оберните микроцентрифугтрубки с куском алюминиевой фольги, чтобы защитить образцы от света и свести к минимуму возможное фото-отбеливание.
5. Удалите раствор окрашивания BODIPY 493/503 и вымойте образцы по 3x в течение 10 минут каждый с помощью PBS, чтобы полностью удалить остаточные красители.

5. Монтаж и визуализация

1. Поместите 6 зл и земли на чистый слайд микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажная среда используется в течение более длительного времени обнаружения на основе его антифадейных свойств.
2. Используйте щипцы, чтобы забрать один эпидермис и осторожно удалить остаточные PBS с салфеткой.
3. Поместите эпидермис в монтажную среду и отрегулируйте его ориентацию так, чтобы его внутренняя поверхность, содержащая эноциты, находилась на дне, а ее внешняя поверхность находилась на верхней части.
4. Аккуратно поместите крышку на эпидермис.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите любой дополнительный монтаж среды утечки из-под крышки с салфеткой, если это необходимо. Чтобы облегчить визуализацию, аккуратно нажимайте на крышку с помощью щипц, чтобы при наблюдении за слайдом через микроскоп, эноцитное скопление можно легко собразить в одной плоскости. Кроме того, это практически возможно, чтобы сократить эпидермис в два полуэпидермиса через среднюю линию, чтобы избежать свертывания всего эпидермиса при монтаже тканей.
5. Нанесите четкий лак для ногтей по краям крышки для уплотнения.
6. Положите слайды в светонепроницаемый образец коробки и дайте лак для ногтей, чтобы высохнуть на RT, который может занять 5-10 минут.
7. Продолжить микроскопический анализ. Возьмите изображения с помощью конфокального микроскопа (увеличение 63x с оптимизированными настройками фильтра GFP или FITC, возбуждение 488 нм, эмиссия 503 нм) для получения чистых и чувствительных сигналов с минимизированным фоном.

Результаты

Успешное выполнение этой процедуры должно привести к четкой липидных капель окрашивания, что показывает количество и размер липидных капель в эноциты. Рисунок 1A,A',''' показывает, что Есть несколько обнаруживаемых липидных капель (зеленых точе?...

Обсуждение

Среди тех, изложенных выше, Есть несколько важных шагов в этом протоколе, с яйцом отложить период времени является одним из них. Как липид-мобилизационная ткань, эноцит очень чувствителен к состоянию питания^6,8. Длительные периоды откладки яиц могут приве?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL centrifuge tube	Corning	430829	50 mL
6 cm Petri dish	Thermo Fisher	150326	6 cm
Agar			For fly food
Aluminum foil	N/A	N/A	Protect smaple from light
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Lipid droplet staining dye
Confocal microscope	Leica	Leica TSC SP5	Confocal imaging
Corn syrup			For fly food
Cornmeal			For fly food
Coverslip	Citoglas	10212424C	20 × 20 mm, 0.13-0.17 thick
Dissection pin	N/A	N/A
Dissection plate	N/A	N/A
Filter paper	N/A	N/A	Diameter: 11 cm
Fixation buffer	N/A	N/A	4% Paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS
Forcep	Dumont	11252-30	#5
Incubator	Jiangnan	SPX-380	For fly culture
Microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
Microscopy slide	Citoglas	10127105P-G
Mounting medium	VECTASHIELDAntifade Mounting Medium	H-1000	Antifade mounting medium
Nail polish	PanEra	AAPR419	Seal the coverslip
Paintbrush	N/A	N/A
PBS	N/A	N/A	1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4, pH 7.4)
Rotator	Kylin-Bell Lab Instruments	WH-986
Scissor	Smartdata Medical	SR81	Vannas spring scissor
Soy flour			For fly food
Spatula	N/A	N/A
Standard cornmeal food	N/A	N/A	Accoding to Bloomington standard cornmeal food recipe
Stereo microscope	Leica	Leica S6E	For tissue dissection
Wipe paper	N/A	N/A
Yeast			For fly food
yw	Kept as lab stock	N/A	Drosophila