JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

Abstract

רצף mRNA תא יחיד עשה התקדמות משמעותית בשנים האחרונות והפך כלי חשוב בתחום הביולוגיה ההתפתחותית. הוא השתמש בהצלחה כדי לזהות אוכלוסיות תאים נדירות, לגלות גנים סמן הרומן, ולפענח מידע התפתחותי מרחבי וזמני. שיטת התאים הבודדת התפתחה גם מתוך הטכנולוגיה המבוססת על המיקרו-פלואידיק C1 לפתרונות מבוססי-droplet בשנתיים האחרונות עד שלוש שנים. כאן השתמשנו בלב כדוגמה כדי להדגים כיצד לפרופיל את התאים מתחלקים העכבר באמצעות השיטה scRNA-Seq מבוסס droplet. בנוסף, אנו משולבים שתי אסטרטגיות לתוך זרימת העבודה כדי לפרופיל דגימות מרובות בניסוי אחד. באמצעות אחת השיטות המשולבות, יש לנו בו פרופיל יותר מ 9,000 תאים משמונה דגימות לב. שיטות אלה יהיו בעלות ערך לתחום הביולוגיה ההתפתחותית על ידי מתן דרך חסכונית לפרופיל בו תאים בודדים מרקעים גנטיים שונים, שלבים התפתחותיים, או מיקומים אנטומיים.

Introduction

הפרופיל של כל תא בודד משתנה בין אוכלוסיות תאים במהלך התפתחות מעובדיות. למרות מולקולרי אחד באתרו היברידיזציה ניתן להשתמש כדי להמחיש את הביטוי של מספר קטן של גנים1, רצף mrna תא יחיד (ScRNA-Seq) מספק גישה משוחדת כדי להמחיש דפוסי ביטוי הגנום רחב של גנים בתאים בודדים. לאחר שפורסם לראשונה ב 20092, scRNA-Seq חלה לחקור רקמות מרובות בשלבים התפתחותיים מרובים בשנים האחרונות3,4,5. כמו כן, כמו אטלס התא האנושי השיקה פרויקטים התפתחותיים שלה ממוקדת לאחרונה, יותר נתונים תא בודד מרקמות עובריים אנושיים צפויים להיווצר בעתיד הקרוב.

הלב כמו האיבר הראשון לפתח משחק תפקיד קריטי בהתפתחות עובריים. הלב מורכב מסוגי תאים מרובים והתפתחות של כל סוג תא מוסדר באופן הדוק באופן זמני ו spatially. במהלך השנים האחרונות, המקור ואת שושלת התאים של תאי לב בשלבים התפתחותיים מוקדם כבר מאופיין6, אשר לספק כלי ניווט שימושי עצום להבנת מחלת לב מולדים פתוגנזה, כמו גם לפיתוח שיטות מתקדמות יותר מבחינה טכנולוגית כדי לעורר התחדשות הקרדיוציט7.

ScRNA-Seq עברה התרחבות מהירה בשנים האחרונות8,9,10. עם שיטות שפותחו לאחרונה, עיצוב וניתוח של ניסויים תא בודד הפך השגה יותר11,12,13,14. השיטה המוצגת כאן היא הליך מסחרי המבוסס על פתרונות ה-droplet (ראה טבלת חומרים)15,16. שיטה זו כוללת לכידת תאים וסטים של חרוזי ברקודים ייחודיים ב-droplet של מי השמן, שתחת שליטה של מערכת בקרי מיקרו-פלואידיג. שיעור הטעינה של התאים בטיפות נמוך מאוד כך שרוב האמולסיות של droplet מכילים תא אחד בלבד17. העיצוב הגאוני של התהליך מגיע מהפרדה בין תאים בודדים לאמולסיות של droplet המתרחשים בו זמנית עם ברקוד, המאפשר ניתוח מקבילי של תאים בודדים באמצעות RNA-Seq באוכלוסיה הטרוגנית.

התאגדות של אסטרטגיות ריבוב היא אחת התוספות החשובות לזרימת העבודה המסורתית תא13,14. תוספת זו שימושית מאוד בסילוק תא doublets, הפחתת עלויות נסיוניות וביטול אפקטים של אצווה18,19. אסטרטגיה בסיס השומנים המבוססת על מבוסס ואסטרטגיה ברקוד מבוסס נוגדן (ראה טבלת חומרים) הם שני שיטות ריבוב משומשים בעיקר. ברקודים ספציפיים משמשים לתווית כל מדגם בשתי השיטות, והדגימות שסומנו מעורבות לאחר מכן עבור לכידת תא בודד, הכנה לספריות ורצף. לאחר מכן, הנתונים ברצף במאגר יכול להיות מופרדים על ידי ניתוח רצפי ברקוד (איור 1)19. עם זאת, הבדלים משמעותיים קיימים בין שתי השיטות. אסטרטגיית barcoding המבוססת על השומנים מבוססת על olig, שעברו שינוי השומנים, אשר לא נמצא יש העדפות סוג תא כלשהו. בעוד אסטרטגיה ברקוד מבוסס הנוגדן יכול רק לזהות את התאים המבטאים את החלבונים אנטיגן19,20. בנוסף, זה לוקח בערך 10 דקות כדי להכתים את השומנים אבל 40 דקות כדי להכתים את הנוגדנים (איור 1). יתרה מזאת, הננו-שינויים המשומנים הינם זולים יותר מאשר מצובי נוגדנים בעלי מניות, אך לא זמין באופן מסחרי בזמן כתיבת מאמר זה. לבסוף, האסטרטגיה המבוססת על השומנים יכול להיות במגה 96 דגימות בניסוי אחד, אבל האסטרטגיה מבוסס נוגדן כרגע יכול רק מאחד 12 דגימות.

מספר התא המומלץ לקולנוע בניסוי בודד צריך להיות נמוך מ 2.5 x 104, אחרת, זה יוביל אחוז גבוה של תאים doublets וזיהום mrna הסביבה הפוטנציאלית. באמצעות אסטרטגיות ריבוב, העלות של תא בודד לכידת, cDNA דור, והכנה הספריה עבור מספר דגימות יופחת לעלות של מדגם אחד אבל העלות רצף יישאר זהה.

Protocol

נוהל בעלי חיים הוא בהתאם לטיפול באוניברסיטת פיטסבורג בעלי חיים מוסדיים והוועדה השימוש (IACUC).

1. עכבר לנתיחה עובריים והשעיה תא יחיד הכנה

הערה: שלב זה עשוי להימשך מספר שעות, בהתאם למספר העוברים לנתח.

  1. כדי לרכוש את E 29.8 לבבות עובריים, המתת החסד עכבר CD1 בהריון על ידי מנהל CO2 . השתמש תער כדי להסיר את השיער לא רצוי באזור הבטן ולחטא את העור עם 70% אתנול.
  2. חותכים את עור הבטן בעזרת מספריים מעוקרים ומנתחים בזהירות את העוברים ומכניסים אותם במהירות לתמיסת מלח (PBS) על הקרח.
  3. לבודד את הלבבות מכל עובר בודד בזהירות בצלחת 10 ס"מ מלא PBS קר תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי באמצעות מלקחיים ומספריים.
    הערה: השאר את ארבעת התאים ללא שינוי על-ידי מבתר את הריאה עם הלב ביחד, לא ישירות לתפוס/למשוך את הלב עם כלי ניתוח.
  4. העברה ~ 10 לבבות לתוך חדש 10 ס מ התבשיל מלא עם החלל הקרים ו מיקרו לנתח את הלבבות לתוך האטריום השמאלי, הפרוזדור הימני, החדר השמאלי, ואת החדר הימני.
    הערה: ההנחה היא כי הדבר מעלה יותר מ-1 x 106 תאים מכל מדגם. אנחנו ממליצים להתחיל עם לפחות 1 x 105 תאים לכל מדגם.
  5. העבר כל אחד 4 רקמות קאמרית לצינור 1.5 mL וחותכים אותם לחתיכות באמצעות מספריים. צנטריפוגה ב 300 x g עבור 3 דקות כדי לאסוף את הרקמות.
  6. לאחר כיבוי supernatant, להוסיף 1 mL של 0.25% טריפסין/EDTA לכל צינור ו מודלת באמבטיה 37 ° c במים עבור 10 דקות. Pipet למעלה ולמטה בעדינות 7-8 פעמים באמצעות P1000.
  7. אם השלב העובריים ישן יותר מאשר E 11.5, להוסיף 1 מ ל 10 מ"ג/mL כגון התערובת A/B והוא מתחזה ב 37 ° c עבור 10-20 דקות. בעדינות למעלה ולמטה עד שרוב התאים הם השנתק.
  8. להעביר את התאים לצינור 15 מ"ל ולהוסיף 8 mL תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) כדי לדלל את האנזימים. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. להשעות את התאים ב 1 מ ל של PBS ולהעביר אותם שפופרת 1.5 mL. לסנן את התאים באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר.
  9. לקחת 15 μL של נפח מכל מדגם ולערבב עם כמות זהה של 0.04% טרי, כחול. טען את זה בתא ספירת תאים וספור את התאים במונה תאים.
    הערה: כדי להפיק תוצאות באיכות גבוהה, הכדאיות של התאים מומלצת להיות גבוהה מ-95%.

2. מרבב תא יחיד ברסינג

הערה: שלב זה מקבל לפחות 40 דקות המשתנה בהתאם למספר הדגימות שעובדו. אזור ספסל נקי שטופלו בפתרון הטיהור RNase נדרש עבור שלבים מראש הגברה (שלב 2.11 עד 3.11), ואזור ספסל נפרד ונקי נדרש עבור שלבים שלאחר הגברה (השלבים לאחר 3.11).

  1. הליך ברקוד מבוסס ליפיד (פרוצדורה אופציונלית 1)
    1. בהתבסס על ריכוז התא, לשמור פחות מ 5 x 105 תאים לכל מדגם. ודא כי ההשעיה התא ללא פסולת ואגרגטים תאים.
    2. הכן 2 μM עוגן/פתרון מלאי ברקוד 2 μM שיתוף עוגן פתרון עבור כל מדגם (טבלה 1).
      הערה: עוגן ושיתוף עוגן הוכשר באדיבות ד ר זאב ג. גרטנר מעבדה. כדי לסנתז אלה שעברו שינוי שומנים באמצעות חומצה גנטית, רצפי DNA היו מצודים עם חומצת שומן על תמיכה מוצקה ומטוהרים על ידי היפוך שלב ביצועים באיכות גבוהה נוזלי (כרומטוגרפיה)18,19.
    3. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולאסוף את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות. להשעות תאים ב 180 μl של PBS.
    4. הוסף 20 μL של עוגן/מלאי ברקוד הפתרון ואת הפיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב. מודקון על הקרח עבור 5 דקות.
    5. הוסף 20 μL של שיתוף עוגן פתרון מניות ו פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לערבב, ולאחר מכן דגירה על קרח עבור 5 דקות נוספות.
    6. הוסף 1 מ ל של PBS קר עם 1% BSA ו צנטריפוגה ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. רוחצים לפחות 2 פעמים עם קרח קר 1% BSA ב-PBS.
    7. לשלב את כל הדגימות יחד לסנן דרך מכשירי 40 יקרומטר תאים. לספור את התאים ולשמור על השעיה התא על הקרח להשתמש בסעיף 3.
  2. הליך ברקוד מבוסס נוגדן (פרוצדורה אופציונלית 2)
    1. צנטריפוגה 1 x 106-2 x 106 תאים עבור כל מדגם (משלב 1.8) ב 300 x g עבור 5 דקות ולהשעות אותם ב 100 μl של מאגר כתמים (טבלה 1) בתוך 1.5 mL לאגד בצינורות נמוך.
    2. הוסף 10 μL בחסימת Fc מגיב ו הריביט עבור 10 דקות ב 4 ° c.
    3. הכנת נוגדנים (ראה טבלת חומרים) על ידי תפרידו ב 14,000 x g עבור 10 דקות ב 2-8 ° c.
    4. הוסף 1 μg של כל אחד oligo מצושל נוגדן כדי 50 μL של תא צביעת מאגר כדי להפוך את הפתרון כתמים נוגדן20. הוסף פתרון אחד מכתים נוגדן לכל שפופרת לדוגמה. המשך 30 דקות ב-4 ° c.
    5. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 mL של PBS, ספין עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c.
    6. הבריכה כל הדגימות בפרופורציות הרצוי 1 מ ל של מאגר כתמים, ספין עבור 5 דקות ב 350 x g ב 4 ° c.
    7. להשעות את התאים ב-PBS בריכוז המתאים (עד 1,500 תאים/μl) ולסנן תאים באמצעות מסננת תא 40 יקרומטר. . המשך מיד לשלב הבא

3. הדור Droplet ו-mRNA שעתוק הפוכה

הערה: שלב זה מקבל כ-90 דקות לתגובה מריבוב אחת.

  1. למדוד את חרוזי ג'ל (ראה טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר עבור 30 דקות. להוציא ריאגנטים מחרוזים ג'ל ב-אמולסיה (לראות טבלת חומרים) ולשמור אותם בטמפרטורה שצוין שלהם.
  2. הכנס את השבב B למחזיק שבב (ראה טבלת חומרים).
  3. לחלק 75 μL של 50% גליצרול פתרון לתוך בארות שאינן בשימוש בשורה 1; 40 μL בשורה 2; 280 μL בשורה 3. אין להוסיף גליצרול בבארות התאוששות בשורה העליונה של השבב.
  4. הכן את המיקס הראשי על הקרח לפי לוח 1. הוסף נפח מתאים של ההשעיה התא ו nuclease-מים חינם לערבב בהתאם לתא ההשעיה נפח הטבלה מחשבון17 ובעדינות פיפטה מיקס. לוותר 75 μL של תערובת התא לתוך המרכז התחתון של המדגם גם בשורה 1 מבלי להציג בועות.
  5. מערבולת את חרוזי ג'ל עבור 30 s באמצעות מתאם מערבולת ובאיטיות לוותר על 40 μL של חרוזי ג'ל לתוך המרכז התחתון של הג חרוז היטב בשורה 2 מבלי להציג בועות.
    הערה: קריטי לחכות 30 s בין הוספת תאים וחרוזי ג'ל כדי למנוע כשל הרטבה.
  6. עבור שמן למחיצות היטב בשורה 3, לוותר 280 μL של מחיצות שמן דרך הקיר צדדי של הבאר.
    הערה: טעינת פחות מ-270 μL של שמן למחיצות יוביל ליצירת אבני חן חריגות.
  7. לצרף את האטם על השבב, לא ללחוץ על האטם ולשמור אותו אופקית כדי למנוע להרטיב את האטם.
  8. לטעון את השבב התאספו עם אטם בבקר כרום ולהפעיל את התא בודד כרום B התוכנית (ראה טבלת חומרים), מיד להמשיך לשלב הבא כאשר התוכנית משלימה.
  9. קח את השבב החוצה ולהשליך את האטם. מקפלים את המכסה בחזרה כדי לחשוף את הבארות ב 45 °, לבדוק את רמת הנוזל כדי לוודא שאין כפכפים קיימים.
  10. באיטיות מאספירין 100 μL של פנינים מהנקודות הנמוכות ביותר של ההתאוששות היטב ולבדוק את אחידות של אבני החן. לחלק אבני חן לתוך תגובת שרשרת פולימראז חדשה (PCR) שפופרת על הקרח עם טיפים הצינורות נגד הקיר צדדי של הצינור.
    הערה: אם השכבה העודפת מימית נצפתה, היא מוצעת להכין מחדש את הדגימות. חשוב מכך, צלם תמונה של התערובת כאשר הפנינים עדיין בקצות הפיפטה. התמונה הזאת יכולה לדעת אם יש כישלון הרטבה, פנינים באופן חלקי, וכפכפים מגיב. הצילום יכול לשמש גם כראיה כדי לקבל החזר מהחברה הכימית עם ריאגנטים החלפת וצ.
  11. לשים את הצינור בתוך הציקלור תרמית ולבצע את התהליך תמלול הפוכה (שולחן 2).
    הערה: עצור כאן או המשך לשלב הבא. ניתן לאחסן את מוצר ה-PCR ב-20 ° c עד שבוע.

4. cDNA הגברה

הערה: שלב זה לוקח כ 150 דקות.

  1. הפוך שעתוק תא בודד הפוכה
    1. להוציא את הגברה cDNA מערכת אבני חן (לראות את שולחן החומרים) ולשמור אותם בטמפרטורה שצוין שלהם.
    2. הוסף 125 μL של סוכן השחזור למדגם בטמפרטורת החדר כדי לרכוש תערובת biphasic. אין לצפות בנוזל אטום ולהימנע מללטף או להווראת התערובת.
    3. לאחר המתנה 60 s, לאט להסיר 125 μL של סוכן השחזור מהחלק התחתון של הצינור.
    4. מערבולת החרוזים המגנטיים (ראה טבלת חומרים) ביסודיות עבור 30 s ומיד להשתמש בו כדי להכין את תערובת החרוזים ניקוי (שולחן 1). ריאגנטים יש להוסיף ברציפות כמפורט.
    5. מערבולת את התערובת לניקוי חרוזים ולהוסיף 200 μL למדגם. מצנעת את התערובת פי 10 ולאחר מכן מדגירה אותו 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    6. הוסף את הריאגנטים ברציפות כפי שרשום בטבלה 1 כדי להכין את הפתרון להתחמק ולאחר מכן cdna כדלקמן.
      1. מניחים את הדגימות על המגנט (בעמדה גבוהה) (ראה טבלת חומרים) עד הפתרון מנקה, ולאחר מכן להסיר את הסופרנטאנט.
      2. הוסף 200 μL של 80% אתנול לתוך הגלולה. לחכות 30 s, ואז להסיר את האתנול.
      3. חזור על השלב 4.1.6.2 עבור 2 פעמים נוספות. צנטריפוגה בקצרה והמקום על המגנט (מיקום נמוך). הסר בזהירות את האתנול הנותר והאוויר יבש במשך פחות מ 2 דקות.
        הערה: לא יעלה על האוויר ייבוש בעבר 2 דקות, אחרת את היעילות הימנעות תפחית.
      4. . הסר את הדגימה מהמגנט הוסף 35.5 μL של תמיסת ופיפטה לערבב 15 פעמים. דגירה 2 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. מניחים את המדגם על המגנט (עמדה גבוהה) עד הפתרון מנקה. העבר 35 μL של המדגם לרצועת צינור חדשה.
        הערה: תהליך טיהור זה משמש גם בשלבים 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 ו6.2.6. שים לב לריכוז של חרוזים מגנטיים וכמות של מאגר EB/מים באולטרטהור המשמש לשימוש בדגימות בכל שלב.
    7. מכמת את הגודל, הריכוז והשלמות של האלוטד cDNA באמצעות מכשיר אלקטרופורזה אוטומטי21 (ראה טבלת חומרים) (איור 2).
  2. הגברה של cDNA
    1. הגברה באמצעות אסטרטגיית הברקוד המבוססת על השומנים (פרוצדורה אופציונלית 1)
      1. הכינו תערובת תגובת הגברה (שולחן 1) על הקרח.
      2. הוסף את תערובת תגובת הגברה כדי 35 μL של דגימות cDNA (משלב 4.1.6.7). , פיפטה את התערובת. וצנטריפוגה בקצרה דגירה התערובת ב ציקלונט תרמית בעקבות הגברה cDNA (שולחן 2).
      3. לאחר vortexing ביסודיות, להוסיף 120 μl של בחירת מגיב ו 100 μl של מים אלקטרופורזה כדי 100 μl של מדגם כדי לרכוש ריכוז 0.6 x של מגיב בחירה (ראה טבלת חומרים). . מצנעת את התערובת 15 פעמים
      4. דגירה עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן למקם את המדגם על מגנט עד הפתרונות להיות ברורים.
        הערה: אנדוסוגני cDNA בשבר החרוזים ומקודדים בקוד מקודד cDNA הוא הסופרנטאנט.
      5. העבר את supernatant לתוך שפופרת 1.5 mL נמוך לאגד עבור ריבוב מקודד cDNA בניית הספרייה בשלב 6.1.
      6. נקה את ה-Dna אנדודוגני על ידי ביצוע השלבים 4.1.6 ו elute אותם עם 40 μL של מאגר EB.
      7. הפעל 1 μL של מטהר cDNA דגימת במכשיר אלקטרופורזה אוטומטי (ראה טבלת חומרים) כדי לנתח/לכמת את cdna.
      8. מחלק 10 μL של cDNA לתוך צינור PCR חדש עבור בניית ספריות אנדוגני.
        הערה: עצור כאן או המשך לשלב הבא. ניתן לאחסן את המדגם הנותר ב-20 ° צ' עד 4 שבועות להפקת ספריות נוספות במידת הצורך.
    2. cDNA הגברה באסטרטגיית ברקוד מבוסס נוגדן (הליך אופציונלי 2)
      1. הוסף 2 ליטר של HTO ו-ADT התוסף מוספים ו 15 μL של cDNA התחל 50 μL של תערובת תגובת הגברה (שולחן 1) ולבצע הגברה cdna עם הגברה cdna הליך (שולחן 2).
      2. השתמש 0.6 x לבחור מגיב להפריד אנדודוגני cDNA (חרוזים שבר) ו ריבוב ברקוד מונה cDNA (ב supernatant). זכור לשמור את הסופרנטאנט כדי לבצע את בניית הספרייה בשלבים בשלב 6.2.
      3. לטהר את התעתיק האנדודוגני באמצעות ביצוע השלבים ב 4.1.6, לבצע בקרת איכות (QC) של הספריות ו-10quot 10 μL לתוך צינור ה-PCR חדש עבור בניית הספרייה אנדוגני.

5. הכנה לספריות אנדוגני

הערה: שלב זה לוקח כ 120 דקות.

  1. שמור ביטוי גנים ריאגנטים בנייה בספרייה מערכת הספרייה (ראה טבלת חומרים) על הטמפרטורה שצוין שלהם, בהתאמה.
  2. הכינו את תערובת הפיצול (טבלה 1) על הקרח, הפיפטה כדי לערבב וצנטריפוגה בקצרה.
  3. הוסף 25 מאגר μL EB ל 10 μL מטוהרים cDNA לדוגמה (משלב 4.2.1.8 או 4.2.2.3) ולאחר מכן להוסיף את התערובת החדשה המוכנה 15 μL הפיצול למדגם, פיפטה את התערובת 15 פעמים על קרח וצנטריפוגה בקצרה.
  4. העבר את המדגם לתוך הציקלור תרמי מקורר ואתחל את תוכנית ה-PCR לצורך פיצול, תיקון סיום ו-A-לעקוב (טבלה 2).
  5. מערבולת לבחור מגיב להשעות חרוזים מגנטיים ברציפות להשתמש 0.6 x ו 0.8 x בחר ריאגנטים לעשות בחירה דו צדדית בגודל על פי מדריך המשתמש17,22. השתמש ב-50 μL של מאגר EB כדי להשתמש ב-DNA.
  6. הכינו תערובת להכנת מתאם (שולחן 1), ואז פיפטה את התערובת ביסודיות וצנטריפוגה בקצרה.
  7. הוסף 50 μL של שילוב מתאם לפני הצורך 50 μL של מדגם, הפיפטה מתערבב שוב 15 פעמים וצנטריפוגה בקצרה. בצע את המיון של המתאם לפי הפרוטוקול ב-ציקלייר תרמי (טבלה 2).
  8. השתמש ב-0.8 x מגיב לטיהור המוצר הקשור ומדגם מטוהר עם 30 μL של מאגר EB (ראה שלב 4.1.6).
  9. הכינו את תערובת ה-PCR לדוגמה (טבלה 1) והוסף 60 μl לדגימה הטהורה. הוסף 10 μL של מדד המדגם למדגם, פיפטה לערבב למעלה ולמטה עבור 5 פעמים ו צנטריפוגה בקצרה, דגירה ב ציקלונט תרמית בעקבות פרוטוקול אינדקס לדוגמה (טבלה 2).
    הערה: עצור כאן או המשך לשלב הבא. אם נעשה שימוש ביותר מבאר אחת, בחרו אינדקס מדגם ספציפי (ראו טבלת חומרים) לכל באר. זכור להקליט את מזהה האינדקס המשמש עבור כל היטב ולהבטיח שאין חפיפה בהפעלת רצף מרובב.
  10. ברציפות להשתמש 0.6 x ו 0.8 x לבחור ריאגנטים לעשות בחירה בגודל דו צדדי לרכוש 35 μL של הספרייה הסלולרית מטוהרים דנ א של ספריית הסלולר17.
  11. QC הספרייה הסלולרית אנדודוגני לפני רצף (איור 2).

6. הכנת ריבוב ברקוד מדגם cDNA ספריות

הערה: שלב זה לוקח לפחות 120 דקות.

  1. לדוגמה הדור ספריית ברקוד עבור אסטרטגיית ריבוב מבוסס ליפיד (פרוצדורה אופציונלית 1)
    1. הוסף 520 μL של מגיב בחירה ו 360 μL של איזופנול כדי לדגום ברקוד cDNA משלב 4.2.1.5 כדי לקבל 3.2 x לבחור ריכוז מגיב. פיפטה את התערובת 10 פעמים, ומכאן בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
    2. הנח את השפופרת על מדף מגנטי והמתן עד שהפתרון יתבהר. . אז תמחק את הסופרנטאנט
    3. השתמש 500 μL של 80% אתנול לשטוף חרוזים פעמיים על מגנט ולחכות 30 s אחרי כל כביסה.
    4. צנטריפוגה בקצרה את החרוזים ואת המקום על מגנט. הסר את אתנול הנותרים עם P10 מיקרופיפטה ולהשאיר חרוזים עבור 2 דקות.
    5. להסיר את הצינור מארון התקשורת מגנט ולהשעות מחדש חרוזים ב 50 μL של מאגר EB. מלטף למעלה ולמטה כדי לערבב ביסודיות. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות.
    6. החזר את הצינורית למגנט והמתן עד שהפתרון יתבהר. להעביר את supernatant (לדוגמה cDNA ברקוד) לצינור PCR חדש. להיזהר לא להעביר חרוזים כלשהם.
    7. לכמת את הריכוז של ברקוד לדוגמה cDNA23.
    8. להכין ברקוד השומנים תערובת הספרייה (שולחן 1), להוסיף 3.5 Ng של cdna ברקוד מטוהרים (משלב 6.1.6) ו nuclease-מים ללא תשלום עבור נפח כולל של 50 μl.
    9. שמור אותו בתוך הציקלייה תרמית בעקבות הספרייה המבוססת על ברקוד PCR (טבלה 2).
    10. השימוש 1.6 x לבחור מגיב כדי לטהר את המוצר PCR ו-DNA עם 25 μL של מאגר EB (ראה שלב 4.1.6).
    11. לכמת את הריכוז הספרייה באמצעות רגישות גבוהה DNA ניתוח שיטה24 מן הדילול הראשוני של 1:5 (איור 2).
  2. לדוגמה הדור ספריית ברקוד עבור האסטרטגיה ריבוב מבוסס נוגדן (הליך אופציונלי 2)
    1. הוסף תוספת של 1.4 x תגובת התגובה של בחירה מגיב לסופרנטאנט המכיל ברקודים לדוגמה שנרכשו משלב 4.2.2.3 כדי לקבל יחס מגיב 2x בחירה.
    2. לשטוף את החרוזים עם 80% אתנול על ידי ביצוע השלבים ב4.1.6 ו-להוריד את cDNA ברקוד עם מים באולטרטהורים.
    3. בצעו את פרוטוקול הבחירה באמצעות מגיב באמצעות 2x בפעם השנייה ובשימוש במים באולטרטהורים.
    4. הכנת ברקוד נוגדן תערובת הספרייה (שולחן 1), ולהוסיף 45 μl של cdna ברקוד מטוהרים מהשלב האחרון.
    5. דגירה ב ציקלונט תרמית בעקבות ספריית ברקוד נוגדנים PCR (שולחן 2)20.
    6. השימוש 1.6 x לבחור מגיב כדי לטהר את המוצר PCR ו להשתמש במדגם מטוהרים עם 30 μl של מים אלקטרופורזה (ראה שלב 4.1.6).

7. רצף הספריות

הערה: מספר פלטפורמות רצף הדור הבא כגון HiSeq 4000 ו-Novהq ניתן להשתמש כדי לסדר את ספריות תעתיק אנדודוגני וספריות ברקוד ריבוב.

  1. השתמש בפלטפורמת רצף הדור הבא של הבחירה כדי לסדר את ספריות תעתיק אנדודוגני וספריות ברקוד ריבוב.
  2. דלל את הספריות בהתאם להמלצות של מומחה בחברה ברצף או במתקן רצף. מינימום 20,000 קריאות לכל תא מומלץ עבור ספריית התעתיק האנדודוגני ו-3000 קורא עבור ספריות ברקודים.

8. ניתוח נתונים

הערה: דה-פלקס נתוני הרצף באמצעות מרחב בסיס המשאבים המבוסס על ענן צמתים או על-ידי הפעלת חבילת bcl2fastq בשרת UNIX.

  1. אנדוגני הטרנס ניתוח נתונים
    1. עם נתוני fastq שנוצר מתוכנה deריבוב, להפעיל "mkfastq" על צינור ניתוח נתונים מסחרית זמין (ראה טבלה של חומרים) כדי להוסיף עוד מולטיפלקס כל ברקוד אבני חן.
    2. הפעל "ספירה" כדי לבצע את היישור, הסינון, ספירת הברקוד וספירת ה-UMI.
    3. לחלופין, הפעל את "aggr" כדי לצבור מספר מסלולים ברצף מניסוי יחיד.
    4. השתמש באפשרות "דפדפן תאים" (ראה טבלת חומרים) כדי להמחיש נתונים, תאים מצרר, זיהוי הגנים מבוטא באופן מהותי, וליצור tsne או ביטוי גנטי מגרשים מפת החום.
    5. באופן אופציונלי, השתמש בפלטפורמה מבוססת היטב של R25 (ראה טבלת חומרים) כדי לנרמל ולשנות את גודל הנתונים, לזהות גנים בעלי התבטאות מהותית וליצור מגרשים של TSNE/umap וביטוי גנים מפות חום (איור 3).
  2. ריבוב ניתוח נתונים ברקוד
    1. ניתוח הנתונים מאסטרטגיית ברקוד מבוסס ליפיד
      1. השתמש בצינור ניתוח נתונים הזמין באופן מסחרי או בחבילת deMULTIplex-ברקודים (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq) כדי להמיר את ברקוד לדוגמה הקבצים fastq למדגם ברקוד מטריקס ספירה.
      2. טען את הברקוד לספירה של מטריקס יחד עם מידע אנדוגני לפלטפורמה מבוססת R (ראה טבלת חומרים) לניתוח שילוב (איור 3).
    2. ניתוח נתונים מאסטרטגיית ברקוד מבוססת נוגדן
      1. השתמש ב-"count" מצינור ניתוח הנתונים הזמין באופן מסחרי כדי למפות את ברקודים על-ידי מתן קובץ ה-CSV של הספריה ותכונת ההפניה לקובץ CSV.
      2. לטעון את הפלט מאוחדת תכונה-מטריצה ברקוד, אשר מכיל ביטוי גנים ספירות לצד התכונות ברקוד על כל ברקוד התא, על פלטפורמה מבוססת R עבור ניתוח במורד הזרם.

תוצאות

במחקר זה, השתמשנו הלב העובריים העכבר כדוגמה להפגין כיצד מופרדים רצף mRNA תא יחיד בוצע כדי לעבד את דגימות שונות מחלקים נפרדים של איבר בו. E 29.8 CD1 לבבות העכבר היו מבודדים לגזור באטריום שמאל (LA), הימני אטריום (RA), החדר השמאלי (LV) ואת החדר הימני (RV). ואת התאים החדרית היו לאחר מכן ברקו ?...

Discussion

במחקר זה, הדגמנו פרוטוקול כדי לנתח פרופילים תא יחיד הטרנססקריפט. כמו כן, סיפקנו שתי שיטות אופציונליות לדוגמיות של מולטיפלקס בזרימת העבודה scRNA-Seq. שתי השיטות הוכיחו להיות ריאלי במעבדות שונות סיפק פתרונות כדי להפעיל את הניסוי חסכוני ואצווה ללא אפקט תא יחיד18,26....

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgements

אנו מודים לדוד מ. פטרסון וכריסטופר ס. מק מ ד ר זאב ג. גרטנר מעבדה עבור האספקה האדיבה שלהם של ריאגנטים barcoding מבוסס ליפיד והצעות על שלבים ניסיוניים ניתוח נתונים. עבודה זו נוסדה על ידי המכון הלאומי לבריאות (HL13347202).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x Chip Holder10x Genomics120252 330019
10x Chromium Controller10x Genomics120223
10x Magnetic Separator10x Genomics120250 230003
10x Vortex Adapter10x Genomics330002, 120251
10x Vortex Clip10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation SystemAgilentG2991AA
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode OligoIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA25 nmol
Buffer EBQiagen19086
CD1 miceChales RiverStrain Code 022ordered pregnant mice
Centrifuge 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Genomics1000094Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads10x Genomics2000059Store at -80 °C
Collagenase ASigma/Millipore10103578001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase BSigma/Millipore11088807001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 MagnetTheromo Scientific12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United StatesFisher Scientific26140079Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μlTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μlTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)BioLegend422301Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Nuclease-Free Water (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube stripsEppendorf951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesiumCorning Cellgro21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)Sigma-AldrichSRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettesFisher Scientific05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Template Switch Oligo10x Genomics3000228Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 AntibodyBioLegend1558010.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 AntibodyBioLegend1558030.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 AntibodyBioLegend1558050.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primerIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redFisher Scientific25200-056
Universal I5Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol

References

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
  22. . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
  23. . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
  24. . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155mRNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved