JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представили мультиплексированный метод секвенирования одноклеточного мРНК для профилирования экспрессии генов в эмбриональных тканях мыши. Метод секвенирования одноклеточной мРНК на основе капельных одноклеточных мРНК (scRNA-Seq) в сочетании со стратегиями мультиплексирования может профилировать отдельные ячейки из нескольких образцов одновременно, что значительно снижает затраты на реагенты и сводит к минимуму экспериментальные пакетные эффекты.

Аннотация

Одноклеточная мРНК секвенирование добилась значительного прогресса за последние несколько лет и стала важным инструментом в области биологии развития. Он был успешно использован для выявления редких популяций клеток, обнаружить новые гены маркера, и расшифровать пространственную и височную информацию о развитии. Метод одноклеточных также эволюционировал от микрофлюидной основанной технологии Fluidigm C1 к растворам на основе капель в последних 2 до 3 летах. Здесь мы использовали сердце в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как профиль мыши эмбриональных клеток ткани с помощью капли на основе метода scRNA-Seq. Кроме того, мы интегрировали две стратегии в рабочий процесс для профилирование нескольких образцов в одном эксперименте. Используя один из интегрированных методов, мы одновременно профилировали более 9000 клеток из восьми образцов сердца. Эти методы будут полезны для области биологии развития, предоставляя экономически эффективный способ одновременного профиля одиночных клеток из различных генетических слоев, стадий развития, или анатомических местах.

Введение

Транскрипционный профиль каждой одной клетки варьируется среди клеточных популяций во время эмбрионального развития. Хотя одномолекулярная гибридизация на месте может быть использована для визуализации экспрессии небольшого числа генов1,секвенирование мРНК одной клетки (scRNA-Seq) обеспечивает беспристрастный подход к иллюстрации геномных экспрессионных моделей генов в одиночных клетках. После того, как он был впервые опубликован в 2009 году2, scRNA-Seq был применен для изучения нескольких тканей на нескольких стадиях развития в последние годы3,4,5. Кроме того, в связи с тем, что в последнее время атлас клеток человека приступил к осуществлению своих проектов, ориентированных на развитие, ожидается, что в ближайшем будущем будет получено больше данных о одиночных клетках из эмбриональных тканей человека.

Сердце как первый орган, развиваемый, играет решающую роль в эмбриональном развитии. Сердце состоит из нескольких типов клеток и развитие каждого типа клеток жестко регулируется временно и пространственно. За последние несколько лет, происхождение и клеточная линия сердечных клеток на ранних стадиях развития были охарактеризованы6, которые обеспечивают огромный полезный инструмент навигации для понимания врожденного патогенеза порока сердца, а также для разработки более технологически передовых методов для стимулирования кардиомиоцитов регенерации7.

scRNA-Seq претерпел быстрое расширение в последние годы8,9,10. С недавно разработанными методами, проектирование и анализ экспериментов с одноклеточными стали более достижимыми11,12,13,14. Представленный здесь метод представляет собой коммерческую процедуру, основанную на растворах капель (см. Таблицу Материалов)15,16. Этот метод имеет захват клеток и наборы уникально штрих-кодированных бусин в масляной воде эмульсии капли под контролем микрофлюидной системы контроллера. Скорость загрузки клеток в капли крайне низка, так что большинство эмульсий капель содержат только одну ячейку17. Гениальный дизайн процедуры происходит от разделения одной клетки на эмульсии капель, происходящих одновременно с баркодированием, что позволяет параллельный анализ отдельных клеток с помощью РНК-Сек на неоднородной популяции.

Включение мультиплексирования стратегии является одним из важных дополнений к традиционной одноклеточной рабочего процесса13,14. Это дополнение очень полезно в отбрасывая дублеты клеток, снижение экспериментальных затрат, и устранение пакетных эффектов18,19. Липидная стратегия баркодирования и стратегия баркодирования на основе антител (см. Таблица материалов)являются двумя в основном используемыми методами мультиплексирования. Специфические штрих-коды используются для обозначения каждого образца в обоих методах, а маркированные образцы затем смешиваются для захвата одной ячейки, подготовки библиотеки и секвенирования. После этого объединенные данные секвенирования могут быть разделены путем анализа последовательностей штрих-кодов(рисунок 1)19. Однако между этими двумя методами существуют значительные различия. Стратегия баркодирования на основе липидов основана на липидных модифицированных олигонуклеотидах, которые не имеют каких-либо предпочтений типа клеток. В то время как антитела на основе штрихкодирования стратегия может обнаружить только клетки, выражающие антигенов белков19,20. Кроме того, это занимает около 10 минут, чтобы испачкать липиды, но 40 минут, чтобы испачкать антитела(Рисунок 1). Кроме того, липидно-модифицированные олигонуклеотиды дешевле, чем антитела-конъюгированные олигонуклеотиды, но не коммерчески доступны на момент написания этой статьи. Наконец, на основе липидов стратегия может мультиплекс 96 образцов в одном эксперименте, но антитела на основе стратегии в настоящее время может только мультиплекс 12 образцов.

Рекомендуемый номер ячейки в мультиплекс в одном эксперименте должен быть ниже, чем 2,5 х 104, в противном случае, это приведет к высокому проценту клеточных дублетов и потенциального загрязнения окружающей среды мРНК. Благодаря стратегиям мультиплексирования стоимость захвата одной ячейки, генерации кДНК и подготовки библиотеки для нескольких образцов будет снижена до стоимости одного образца, но стоимость секвенирования останется прежней.

протокол

Процедура использования животных проводится в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Питтсбурга (IACUC).

1. Мышь эмбрионального сердца Рассечение и одноклеточной подвески Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может занять несколько часов в зависимости от количества эмбрионов для вскрытия.

  1. Чтобы приобрести E18.5 эмбриональных сердец, эвтаназии беременной мыши CD1 со стороны CO2 администрации. Используйте бритву, чтобы удалить нежелательные волосы в области живота и дезинфицировать кожу с 70% этанола.
  2. Вырежьте кожу живота стерилизованные ножницы и тщательно вскрыть эмбрионы и быстро положить их в холодный фосфат-буферный солей (PBS) на льду.
  3. Изолировать сердца от каждого отдельного эмбриона тщательно в 10 см блюдо заполнено холодной PBS под стереоскопическим микроскопом с помощью щипцы и ножницы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите четыре камеры нетронутыми, вскрывая легких с сердцем вместе и не поймать непосредственно / тянуть сердце с хирургическими инструментами.
  4. Перенесите 10 сердец в новую 10-сантиметровую тарелку, наполненную холодным PBS, и микро-вскрыть сердца в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек и правый желудочек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это предполагается дать более 1 х 106 клеток из каждого образца. Мы рекомендуем начать с по крайней мере 1 х 105 клеток на образец.
  5. Перенесите каждую из 4 камерных тканей в трубку 1,5 мл и нарежьте их на куски ножницами. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, чтобы собрать ткани.
  6. После аспирации супернатанта, добавить 1 мл 0,25% трипсин / EDTA к каждой трубке и инкубировать в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение 10 мин. Pipet вверх и вниз мягко 7-8 раз с помощью пипетки P1000.
  7. Если эмбриональная стадия старше E11.5, добавьте 1 мл коллагенеза A/B смеси 10 мг/мл и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10-20 мин. Мягко пайпетик вверх и вниз, пока большинство клеток не будут разобщены.
  8. Перенесите клетки в трубку 15 мл и добавьте сбалансированный солевой раствор Хэнка 8 мл (HBSS), чтобы разбавить ферменты. Спин вниз клетки на 300 х г в течение 5 мин. Приостановить клетки в 1 мл PBS и передать их в 1,5 мл трубки. Фильтр клетки через 40 мкм ячейки ситечко.
  9. Возьмите 15 qL объема из каждого образца и смешать с тем же количеством 0,04% trypan синий. Загрузите это на камеру подсчета клеток и посчитайте клетки в клеточном счетчике.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения высококачественных результатов, жизнеспособность клеток рекомендуется быть выше, чем 95%.

2. Баркодирование одноклеточного мультиплексирования

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает не менее 40 минут, которая варьируется в зависимости от количества обработанных образцов. Для предусилительных шагов (шаг 2,11 - 3,11) требуется чистая скамейка, обработанная раствором RNase (шаг 2.11 - 3.11), а для постусилительных ступеней (шаги после 3.11) требуется отдельная чистая скамейка.

  1. Процедура баркодирования на основе липидов (необязательная процедура 1)
    1. Основываясь на концентрации клеток, держите менее 5 х 105 клеток на образец. Убедитесь, что подвеска ячейки свободна от мусора и клеточных агрегатов.
    2. Подготовьте 2 мкм якорь / штрих-код фондового раствора и 2 ММ совместно якорный стокрешение решение для каждого образца(Таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Якорь и со-якорь были любезно одаренных д-р Зев J. Gartner лаборатории. Для синтеза этих липидо-модифицированных олигонуклеотидов, последовательности ДНК были спряжены с жирными кислотами на твердой поддержке и очищены обратной фазы высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC)18,19.
    3. Вымойте клетки дважды с PBS и собирать клетки на 300 х г в течение 5 мин. Приостановить клетки в 180 Л Л PBS.
    4. Добавить 20 злящих якорных /штрих-кодового стокового раствора и пипетки вверх и вниз осторожно перемешать. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
    5. Добавьте 20 кЛ со-якорного стокового раствора и пипетку вверх и вниз осторожно перемешать, затем инкубировать на льду еще 5 минут.
    6. Добавьте 1 мл холодного PBS с 1% BSA и центрифугу на 300 х г в течение 5 минут при 4 градусах По Цельсия. Вымойте по крайней мере еще 2 раза с холодным 1% BSA в PBS.
    7. Объедините все образцы вместе и фильтрчерез через 40 мкм ячейки ситечко. Подсчитайте клетки и держите суспензию клетки на льду для использования в разделе 3.
  2. Процедура баркодирования на основе антител (необязательная процедура 2)
    1. Centrifuge 1 х 10-2х 106 ячеек для каждого образца (от шага 1.8) на 300 х г в течение 5 мин и приостановить их в 100 зл иокра буфера (Таблица 1) в 1,5 мл низких связывания труб.
    2. Добавьте 10 qL Fc блокирующий реагент и инкубировать в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
    3. Приготовьте антитела (см. Таблицу Материалов) путем центрифуга при 14 000 х г в течение 10 мин при 2-8 градусах Цельсия.
    4. Добавьте 1 мкг каждого олиго-конъюгированного антитела до 50 злител ковчеге клеточного окрашивающего буфера, чтобы сделать антитело окрашивающимраствором 20. Добавьте один антитело окрашивая раствор к каждому образцу трубки. Инкубировать в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
    5. Вымойте клетки 3 раза с 1 мл PBS, спина в течение 5 минут при 350 х г при 4 C.
    6. Объедините все образцы в желаемых пропорциях в 1 мл окрашивающего буфера, вращайте 5 мин при 350 х г при 4 градусах Цельсия.
    7. Повторное перетаскивание клеток в PbS в соответствующей концентрации (до 1500 ячеек/Зл) и фильтрация клеток через 40 мкм-ситеч. Немедленно переходите к следующему шагу.

3. Поколение капель и мРНК Обратная транскрипция

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 90 минут для одной реакции мультиплексированной.

  1. Уравновесите гелевой шарик (см. Таблицу Материалов)до комнатной температуры в течение 30 мин. Выняйте реагенты из комплекта геля-в-эмульсии (GEMs) (см. Таблица материалов)и держите их при указанной температуре.
  2. Соберите чип B в держатель чипа (см. Таблица материалов).
  3. Распределить 75 л 50% глицерола раствора в неиспользованные скважины в строке 1; 40 зл в строке 2; 280 л в строке 3. Не добавляйте глицерол в любые восстановительные скважины в верхнем ряду чипа.
  4. Подготовка мастер смесь на льду в соответствии с таблицей 1. Добавить соответствующий объем клеточной подвески и безнучей воды, чтобы освоить смесь в соответствии с таблицей калькулятора объема суспензии ячейки17 и мягко пипетка смесь. Распределите 75 л клеточной смеси в нижний центр образца хорошо в строке 1 без введения пузырьков.
  5. Vortex гель бусы для 30 s с помощью адаптера вихря и медленно распределять 40 л гелевого шарика в нижний центр геля шарик хорошо в строке 2 без введения пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно ждать 30 s между добавлением клеток и гелевых бусин, чтобы избежать смачивания отказа.
  6. Для разделительной скважины в ряду 3, распределять 280 л раздела нефти через боковую стенку скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузка менее 270 л раздельного масла приведет к аномальной генерации ГЭМ.
  7. Прикрепите прокладку на чип, не нажимать на прокладку и держать его горизонтальным, чтобы избежать смачивания прокладки.
  8. Загрузите собранный чип прокладкой в контроллерх хрома и запустите хромовую одноклеточную программу B (см. Таблица Материалов),немедленно переходите к следующему шагу, когда программа завершится.
  9. Выньте чип и отбросьте прокладку. Сложите крышку назад, чтобы выставить скважины на 45 ", проверьте уровень жидкости, чтобы убедиться, что нет забивает присутствуют.
  10. Медленно аспирируйте 100 л ГЭС из самых низких точек восстановления скважины и проверяйте единообразие ГЭМ. Распределите ГЭМ в новую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) трубку на льду с наконечниками пипетки против боковины трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если наблюдается избыток вавного слоя, предлагается повторно подготовить образцы. Важно, сфотографировать смесь, когда GEMs все еще находятся в пипетки советы. Эта картина может сказать, если есть смачивания отказа, частично эмульгированных GEMs, и реагент забивает. Фотография также может быть использована в качестве доказательства для получения возмещения от компании реагентов с заменой реагентов и чипов.
  11. Положите трубку в тепловой цикл и выполнить обратную процедуру транскрипции(таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Продукт ПЦР может храниться при -20 градусов по Цельсию в течение недели.

4. усиление кДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 150 минут.

  1. Опубликовать одноэлементную реверсивную очистку транскрипции
    1. Выняйте реагенты усиления кДНК из комплекта ГЭМ (см. Таблица материалов)и держите их при указанной температуре.
    2. Добавьте 125 л восстановительного агента в образец при комнатной температуре, чтобы приобрести двухфазатической смеси. Нет непрозрачной жидкости следует соблюдать и избегать трубача или вихря смеси.
    3. После ожидания 60 с, медленно удалить 125 Л рекуперации агента из нижней части трубки.
    4. Vortex магнитные бусы (см. Таблица материалов) тщательно в течение 30 с и сразу же использовать его для подготовки смеси очистки бисера (Таблица 1). Реагенты должны быть добавлены последовательно, как указано в списке.
    5. Vortex смесь очистки бисера и добавить 200 зл. Пипетка смесь 10 раз, затем инкубировать его в течение 10 минут при комнатной температуре.
    6. Добавить реагенты последовательно, как указано в таблице 1, чтобы подготовить раствор elution и elute кДНК следующим образом.
      1. Поместите образцы на магнит (высокое положение) (см. Таблица материалов)до тех пор, пока раствор не расчистит, а затем удалите супернатант.
      2. Добавьте 200 л 80% этанола в гранулы. Подождите 30 с, затем удалите этанол.
      3. Повторите шаг 4.1.6.2 еще 2 раза. Центрифуга кратко и место на магнит (низкое положение). Аккуратно удалите оставшийся этанол и воздух сухим менее чем на 2 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: НЕ превышать сушки воздуха прошлом 2 мин, в противном случае эффективность elution будет снижаться.
      4. Удалите образец из магнита. Добавьте 35,5 л раствора элютации и пипетку, чтобы перемешать 15 раз. Инкубировать 2 мин при комнатной температуре.
      5. Поместите образец на магнит (высокое положение) до тех пор, пока раствор не прояснит. Перенесите 35 зл и того, что образец перейдет на новую прокладку трубки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура очистки также используется в шагах 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 и 6.2.6. Обратите внимание на концентрацию магнитных бусин и объем буфера EB / ультрачистая вода, используемая для elute образцов на каждом шагу.
    7. Количественная оценка размера, концентрации и целостности элютированной кДНК с помощью автоматизированного электрофорасисного прибора21 (см. Таблица материалов)(рисунок 2).
  2. Усиление кДНК
    1. cDNA усиление с использованием липидной стратегии баркодирования (необязательная процедура 1)
      1. Приготовьте усилительную реакционную смесь(Таблица 1) на льду.
      2. Добавьте смесь реакции усиления к 35 ql образцов кДНК (от шага 4.1.6.7). Пипетка смесь, и центрифуга кратко. Инкубировать смесь в термальных циклизаторпосленых после процедуры усиления кДНК(Таблица 2).
      3. После тщательного вихря добавьте 120 л избранного реагента и 100 л ультрачистой воды к 100 л образца, чтобы приобрести 0,6-ю концентрацию выбранного реагента (см. Таблица Материалов). Пипетка смесь в течение 15 раз.
      4. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем поместить образец на магнит, пока растворы не станут ясными.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эндогенные кДНК в бисере фракции и мультиплексирования штрих-кодом cDNA находится в супернатанте.
      5. Передача супернатанта в 1,5 мл низкой связывания трубки для мультиплексирования штрих-кодом кДНК библиотеки строительства на шаг 6.1.
      6. Очистите эндогенную кДНК, выдвинув за шагом в 4.1.6 и украсите их с помощью 40 qL буфера EB.
      7. Выполнить 1 Зл очищенного образца кДНК на автоматизированном инструменте электрофореза (см. Таблица материалов)для анализа / количественной оценки кДНК.
      8. Aliquot 10 qL кДНК в новую трубку ПЦР для эндогенного строительства библиотеки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Оставшаяся выборка может храниться в -20 градусов по Цельсию в течение 4 недель для создания дополнительных библиотек, если это необходимо.
    2. cDNA усиление в антитела на основе штрихкодирования стратегии (необязательная процедура 2)
      1. Добавьте 2 мпмола HTO и ADT добавочные грунтовки и 15 Зл кЛ грунтовок к ДНК до 50 зл и реакции смеси(Таблица 1) и выполнить усиление кДНК с процедурой усиления кДНК(Таблица 2).
      2. Используйте 0.6x выберите реагент для отделения эндогенной кДНК (фракция бисера) и мультиплексирования штрих-кода cDNA (в супернатанте). Не забудьте сохранить супернатант для выполнения штрихкодирования строительство библиотеки в шаге 6.2.
      3. Очистите и украсьте эндогенную транскрипт cDNA, следуя шагам в 4.1.6, выполните контроль качества (КК) библиотек и aliquot 10 qL в новую трубку ПЦР для строительства эндогенной библиотеки.

5. Подготовка эндогенной библиотеки стенограммы

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает около 120 минут.

  1. Храните реагенты строительства библиотеки экспрессии генов из библиотечного комплекта (см. Таблица Материалов)при указанной температуре, соответственно.
  2. Подготовка фрагментации смеси (Таблица 1) на льду, пипетка для смешивания и центрифуги кратко.
  3. Добавьте 25 буфера EB в 10 qL очищенную кДНК-образец (от шага 4.2.1.8 или 4.2.2.3), а затем добавьте недавно подготовленную смесь фрагментации 15 л в образец, пипетку смесь 15 раз на льду и центрифуге кратко.
  4. Передача образца в предварительно охлажденный тепловой циклик и инициировать программу ПЦР для фрагментации, конечный ремонт и A-хвост (Таблица 2).
  5. Vortex выбрать реагент приостановить магнитные бусы и последовательно использовать 0,6x и 0,8x выбрать реагенты, чтобы сделать двусторонний выбор размера в соответствии с руководством пользователя17,22. Используйте 50 зл буфера EB, чтобы увязать ДНК.
  6. Подготовка адаптер перевязки смеси (Таблица 1), затем пипетка смесь тщательно и центрифуги кратко.
  7. Добавьте 50 кЛ перевязочной смеси до 50 зл и плода образца, пипетку снова перемешать в течение 15 раз и ненадолго центрифугу. Выполните перевязку адаптера в рамках протокола в тепловом циклическом цикле(таблица 2).
  8. Используйте 0.8x выберите реагент для очистки ligation продукта и elute очищенный образец с 30 qL буфера EB (см. шаг 4.1.6).
  9. Подготовьте образец индекса ПЦР смеси(таблица 1) и добавьте 60 зл. Добавьте в образец 10 злицитов, пипетку перемешать и опустить в течение 5 раз и ненадолго центрифуги, инкубировать в тепловом циклическом цикле после протокола индекса выборки(таблица 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остановитесь здесь или перейдите к следующему шагу. Если используется несколько скважин, выберите один конкретный индекс выборки (см. Таблица материалов)для каждой скважины. Не забудьте записать идентификатор индекса, используемый для каждой скважины, и убедитесь, что в мультиплексном секвенировании не будет перекрытия.
  10. Последовательно используйте 0,6x и 0.8x избранные реагенты, чтобы сделать двусторонний выбор размера, чтобы приобрести 35 зл и l очищенной эндогенной клеточной ДНК17.
  11. КК эндогенной клеточной библиотеки до секвенирования (Рисунок 2).

6. Подготовка мультиплексирования Образец штрих-кода кДНК библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает не менее 120 минут.

  1. Образец генерации библиотеки штрих-кодов для стратегии мультиплексирования на основе липидов (необязательная процедура 1)
    1. Добавьте 520 qL избранного реагента и 360 л изопропанола в образец штрих-кода cDNA от шага 4.2.1.5, чтобы получить 3,2x выбрать концентрацию реагента. Пипетка смесь 10 раз и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут.
    2. Поместите трубку на магнитную стойку и ждите, пока решение прояснит. Затем отбросьте супернатант.
    3. Используйте 500 л 80% этанола, чтобы дважды мыть бисер на магните и ждать 30 с после каждой стирки.
    4. Кратко центрифуга бисера и место на магните. Удалите оставшийся этанол с микропайпетом P10 и оставьте бисер на 2 мин.
    5. Снимите трубку с магнитной стойки и переприостановите шарики в 50 злику буфера EB. Pipet вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать. Инкубировать при комнатной температуре 2 мин.
    6. Верните трубку к магниту и ждите, пока раствор прояснит. Передача супернатанта (образца штрих-кода cDNA) в новую трубку ПЦР. Будьте осторожны, чтобы не передавать любые бусы.
    7. Количественная концентрация образца штрих-кода cDNA23.
    8. Подготовка липидных штрих-кодов библиотечной смеси(таблица 1), добавить 3,5 нг очищенной штрих-кодом кДНК (от шага 6.1.6) и безнуса, воды для общего объема 50 л.
    9. Держите его в тепловой циклпосле после липидной основе бардид библиотеки ПЦР(Таблица 2).
    10. Используйте реагент 1.6x select для очистки продукта ПЦР и выяснения ДНК с 25 qL буфера EB (см. шаг 4.1.6).
    11. Количественная концентрация библиотеки с использованием метода анализа ДНК высокой чувствительности24 от первоначального разбавления 1:5(Рисунок 2).
  2. Образец генерации библиотеки штрих-кодов для стратегии мультиплексирования на основе антител (необязательная процедура 2)
    1. Добавьте дополнительный 1,4-x объем реакции выбранного реагента в супернатант, содержащий пробные штрих-коды, приобретенные с шага 4.2.2.3, чтобы получить коэффициент реагента 2x select.
    2. Вымойте бисер с 80% этанола, следуя шагам в 4.1.6 и увядите штрих-кодированной кДНК с ультрачистой водой.
    3. Выполните протокол отбора с 2x выбрать реагент во второй раз и elute использованием ультрачистой воды.
    4. Подготовка антитела штрих-код библиотечной смеси (Таблица 1), и добавить 45 зл и l очищенной штрих-кодированной кДНК с последнего шага.
    5. Инкубировать в тепловой циклпосле после антитела баркод библиотеки ПЦР (Таблица 2)20.
    6. Используйте реагент 1.6x select для очистки продукта ПЦР и ущелья очищенного образца с 30 зл и пилите ультрачистую воду (см. шаг 4.1.6).

7. Секвенирование библиотеки

ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько платформ секвенирования следующего поколения, такие как HiSeq 4000 и NovaSeq, могут быть использованы для секвенирования эндогенных библиотек транскриптов и мультиплексирующих библиотек штрих-кодов.

  1. Используйте платформу секвенирования следующего поколения для секвенирования эндогенных библиотек транскриптов и библиотек штрих-кодов мультиплексирования.
  2. Разбавить библиотеки в соответствии с рекомендациями эксперта в компании по секвенированию или объекте секвенирования. Минимум 20 000 считываний на ячейку рекомендуется для эндогенной библиотеки стенограммы и 3000 считываний для библиотек штрих-кодов.

8. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Де-мультиплексданные данные по секвенированию с помощью облачного ресурса BaseSpace или при запуске пакета bcl2fastq на сервере UNIX.

  1. Анализ данных эндогенного транскриптома
    1. С данными fastq, генерируемыми из программного обеспечения demultiplexing, запустите "mkfastq" на коммерчески доступном конвейере анализа данных (см. Таблица материалов)для дальнейшего демультиплекса каждого штрих-кода GEMs.
    2. Выполнить "счет" для выполнения выравнивания, фильтрации, подсчета штрих-кодов и подсчета UMI.
    3. Дополнительно запустите "aggr" для агрегирования нескольких полос последовательности из одного эксперимента.
    4. Используйте "клеточный браузер" (см. Таблицу Материалов)для визуализации данных, кластерных клеток, выявления дифференциально выраженных генов и генерации графиков тепловой карты tSNE или экспрессии генов.
    5. Дополнительно, используйте ухоженные R-платформы25 (см. Таблица материалов) для нормализации и масштабирования данных, выявления дифференциально выраженных генов, а также генерации tSNE / UMAP участков и генной экспрессии тепловых карт (Рисунок 3).
  2. Анализ данных штрих-кодов мультиплексирования
    1. Анализ данных из стратегии баркодирования на основе липидов
      1. Используйте коммерчески доступный конвейер анализа данных или пакет deMULTIplex R(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)для преобразования образцовых штрих-кодов файлов FAST в матрицу подсчета проб штрих-кода.
      2. Загрузите матрицу подсчета штрих-кодов ВМЕСТЕ с эндогенными транскриптомными данными на платформу на основе R (см. Таблица материалов)для интеграционного анализа(рисунок 3).
    2. Анализ данных, полученных в ходе стратегии баркодирования на основе антител
      1. Используйте "счет" из коммерчески доступного конвейера анализа данных для картирования штрих-кодов, предоставляя файл CSV библиотеки и функцию хэштега CSV file.
      2. Загрузите на платформу R-основанной платформы для анализа вниз по течению матрицу, содержащую количество экспрессии генов, рядом с штрих-кодом функции для каждого штрих-кода клетки.

Результаты

В этом исследовании мы использовали эмбриональное сердце мыши в качестве примера, чтобы показать, как мультиплексированное секвенирование одноклеточной мРНК было выполнено для обработки различных образцов из отдельных частей органа одновременно. Сердца мыши E18.5 CD1 ?...

Обсуждение

В этом исследовании мы продемонстрировали протокол для анализа одноклеточных транскрипционных профилей. Мы также предоставили два дополнительных метода для мультиплексных образцов в рабочем процессе scRNA-Seq. Оба метода оказались осуществимыми в различных лабораториях и предоставили ...

Раскрытие информации

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Благодарности

Мы благодарим Дэвида М. Паттерсона и Кристофера С. Макгинниса из лаборатории доктора Зев Дж. Гартнера за их добрые поставки липидных баркодирующих реагентов и предложения по экспериментальным шагам и анализу данных. Эта работа была основана Национальными институтами здравоохранения (HL13347202).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x Chip Holder10x Genomics120252 330019
10x Chromium Controller10x Genomics120223
10x Magnetic Separator10x Genomics120250 230003
10x Vortex Adapter10x Genomics330002, 120251
10x Vortex Clip10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation SystemAgilentG2991AA
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode OligoIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA25 nmol
Buffer EBQiagen19086
CD1 miceChales RiverStrain Code 022ordered pregnant mice
Centrifuge 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Genomics1000094Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads10x Genomics2000059Store at -80 °C
Collagenase ASigma/Millipore10103578001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase BSigma/Millipore11088807001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 MagnetTheromo Scientific12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United StatesFisher Scientific26140079Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μlTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μlTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)BioLegend422301Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Nuclease-Free Water (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube stripsEppendorf951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesiumCorning Cellgro21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)Sigma-AldrichSRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettesFisher Scientific05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Template Switch Oligo10x Genomics3000228Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 AntibodyBioLegend1558010.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 AntibodyBioLegend1558030.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 AntibodyBioLegend1558050.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primerIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redFisher Scientific25200-056
Universal I5Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol

Ссылки

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
  22. . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
  23. . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
  24. . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены