마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

요약

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

초록

단 세포 mRNA 염기서열 분석은 지난 몇 년 동안 중요한 진전을 이루었으며 발달 생물학 분야에서 중요한 도구가 되었습니다. 그것은 성공적으로 희귀 한 세포 집단을 식별 하는 데 사용 되었습니다., 새로운 마커 유전자를 발견, 공간 및 시간 개발 정보를 디코딩. 단일 셀 방법은 또한 지난 2 ~ 3 년 동안 미세 유체 기반 Fluidigm C1 기술에서 액적 기반 솔루션으로 진화했습니다. 여기에서 우리는 액적 기반 scRNA-Seq 방법을 사용하여 마우스 배아 조직 세포를 프로파일업하는 방법을 입증하기 위해 예를 들어 심장을 사용했다. 또한 워크플로우에 두 가지 전략을 통합하여 단일 실험에서 여러 샘플을 프로파일로 프로파일합니다. 통합된 방법 중 하나를 사용하여 8개의 심장 샘플에서 9,000개 이상의 세포를 동시에 프로파일화했습니다. 이 방법은 다른 유전 적 배경, 발달 단계 또는 해부학 적 위치에서 단일 세포를 동시에 프로파일러딩하는 비용 효율적인 방법을 제공함으로써 발달 생물학 분야에 가치가있을 것입니다.

서문

각 단하나 세포의 전사 단면도는 배아 발달 도중 세포 인구 사이에서 변화합니다. 단일 분자가 소수의 유전자^1의발현을 시각화하는데 사용될 수 있지만, 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq)은 단일 세포에서 유전자의 게놈 전체 발현 패턴을 예시하는 편견없는 접근법을 제공한다. 2009년에 처음 발표된 후^2,scRNA-Seq는 최근 몇 년 동안^다발성발달 단계에서 다중 조직을 연구하기 위해^3,4,5. 또한, 인간 세포 아틀라스가 최근 발달 중심 프로젝트를 시작함에 따라 인간 배아 조직에서 더 많은 단일 세포 데이터가 가까운 장래에 생성 될 것으로 예상됩니다.

개발하는 첫번째 기관으로 심혼은 배아 발달에 있는 중요한 역할을 합니다. 심혼은 다중 세포 모형으로 이루어져 있고 각 세포 모형의 발달은 단단히 시간적으로 그리고 공간적으로 통제됩니다. 지난 몇 년 동안, 초기 발달 단계에서 심장 세포의 기원과 세포 혈통은 선천성 심장 질환 병인을 이해하는 데 엄청난 유용한 탐색 도구를 제공하는^6을특징으로하며, 심근 세포 재생을 자극하는 보다 기술적으로 진보 된 방법을 개발하기위한^7.

scRNA-Seq는 최근^8,9,10에서급속한 확장을 겪고있다. 새로 개발 된 방법으로, 단일 세포 실험의 설계 및 분석은 더 달성^{될 11,12,13,14.} 여기서 제시된 방법은 액적 용액에 기초한 상업적 절차(재료표참조)^15,16. 이 방법은 미세 유체 제어 기제어 시스템의 제어하에 오일-물 에멀젼 액적에 고유한 바코드 비드 세트를 캡처하는 기능을 제공합니다. 액적으로 의한 세포 로딩속도는 매우 낮기 때문에 대부분의 액적 에멀젼은 하나의^{셀(17)만을}함유하고 있다. 절차의 독창적 인 디자인은 이질적인 집단에 RNA-Seq를 사용하여 개별 세포의 병렬 분석을 가능하게하는 바코드와 동시에 발생하는 액적 에멀젼으로 단일 세포 분리에서 비롯됩니다.

멀티플렉싱 전략의 편입은 기존의 단일 셀^{워크플로우(13,14)에}중요한 추가 사항 중 하나이다. 이 추가는 셀 더블을 폐기하고, 실험 비용을 절감하고, 배치 효과^18,19를제거하는 데 매우 유용합니다. 지질 기반 바코드 전략 및 항체 기반 바코드 전략(재료 표참조)은 주로 사용되는 두 가지 다중화 방법입니다. 특정 바코드는 두 가지 방법으로 각 샘플에 라벨을 부착하는 데 사용되며, 표지된 샘플은 단일 셀 캡처, 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 혼합됩니다. 그 후, 풀링된 시퀀싱 데이터는 바코드 시퀀스를 분석하여 분리될 수있다(도 1)^19. 그러나 두 메서드 간에는 상당한 차이가 있습니다. 지질 기반 바코드 전략은 지질 변형 올리고뉴클레오티드를 기반으로 하며, 이는 어떤 세포 유형 선호도가 없는 것으로 밝혀졌다. 항체 기반 바코드 전략은 항원 단백질을 발현하는 세포만을 검출할 수 있는^반면,20. 또한, 지질을 염색하는 데 약 10분이 걸리지만 항체를 염색하는 데는 40분이 걸린다(도1). 더욱이, 지질 변형 올리고뉴클레오티드는 항체-컨쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드보다 저렴하지만 이 기사를 쓰는 시점에서 시판되지 않는다. 마지막으로, 지질 기반 전략은 한 실험에서 96개의 샘플을 다중화할 수 있지만, 항체 기반 전략은 현재 12개의 샘플만 멀티플렉스할 수 있다.

단일 실험에서 멀티플렉스에 대한 권장 세포 수는 2.5 x 10^4보다낮아야 하며, 그렇지 않으면 세포 배더의 높은 비율과 잠재적인 주변 mRNA 오염으로 이어질 것이다. 멀티플렉싱 전략을 통해 단일 세포 캡처, cDNA 생성 및 여러 샘플에 대한 라이브러리 준비 비용은 하나의 샘플 비용으로 감소되지만 시퀀싱 비용은 동일하게 유지됩니다.

프로토콜

동물 절차는 피츠버그 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 따라.

1. 마우스 배아 심장 해부 및 단세포 현탁액 준비

참고: 이 단계는 해부할 배아의 수에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

1. E18.5 배아 심장을 획득하려면,_CO2 투여에 의해 임신한 CD1 마우스를 안락사시한다. 면도기를 사용하여 복부 부위의 원치 않는 모발을 제거하고 70% 에탄올로 피부를 소독하십시오.
2. 멸균 된 가위를 사용하여 복부의 피부를 자르고 조심스럽게 배아를 해부하고 얼음에 차가운 인산완충 식염수 (PBS)에 신속하게 넣습니다.
3. 집게와 가위를 사용하여 입체 현미경으로 차가운 PBS로 채워진 10cm 접시에 각 개별 배아에서 조심스럽게 마음을 분리하십시오.
   참고 : 함께 심장으로 폐를 해부하여 네 개의 챔버를 그대로 유지하고 직접 잡기 / 수술 기구와 심장을 당기지 마십시오.
4. ~ 10cm의 하트를 차가운 PBS로 채워진 새로운 10cm 접시로 옮기고 심장을 왼쪽 심방, 오른쪽 심방, 좌심실 및 우심실로 미세 해부합니다.
   참고: 이것은 각 샘플에서 1 x 10⁶ 셀 이상을 산출하는 것으로 가정됩니다. 샘플당 적어도 1 x 10⁵ 셀로 시작하는 것이 좋습니다.
5. 4 개의 챔버 조직을 각각 1.5 mL 튜브로 옮기고 가위를 사용하여 조각으로 자릅니다. 300 x g에서 3 분 동안 원심 분리기를 사용하여 조직을 수집합니다.
6. 상급물을 흡입한 후, 각 튜브에 0.25% 트립신/EDTA의 1 mL을 추가하고 P1000 파이펫을 사용하여 7-8회 부드럽게 7-8회 파이프를 위아래로 37°C 수조에 배양합니다.
7. 배아 단계가 E11.5보다 오래된 경우, 10 mg/mL 콜라게나아제 A/B 혼합물 1mL를 넣고 37°C에서 10-20분 동안 배양합니다.
8. 세포를 15 mL 튜브로 옮기고 8 mL 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)을 추가하여 효소를 희석시다. 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운. PBS의 1 mL에서 세포를 일시 중단하고 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
9. 각 샘플에서 15 μL의 부피를 취하고 동일한 양의 0.04% 트라이판 블루와 혼합합니다. 셀 카운트 챔버에이것을로드하고 세포 카운터에서 세포를 계산합니다.
   참고: 고품질 결과를 생성하려면 세포 생존가능성이 95% 이상이어야 합니다.

2. 단일 셀 멀티플렉싱 바코드

참고: 이 단계는 처리된 샘플 수에 따라 40분 이상 소요됩니다. RNase 제염 용액으로 처리된 클린 벤치 영역은 사전 증폭 단계(단계 2.11 ~ 3.11)에 필요하며, 증폭 후 단계(3.11 이후 단계)에는 별도의 클린 벤치 영역이 필요합니다.

1. 지질 기반 바코드 절차(선택적 절차 1)
   1. 세포 농도에 따라 샘플당 5 x 10⁵ 셀 미만을 유지하십시오. 셀 서스펜션에 이물질과 셀 응집체가 없는지 확인합니다.
   2. 각 샘플에 대해 2 μM 앵커/바코드 스톡 솔루션과 2 μM 공동 앵커 스톡 솔루션을준비합니다(표 1).
      참고: 앵커와 공동 앵커는 Zev J. Gartner 박사의 친절한 재능이 있었습니다. 이러한 지질 변형 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해, DNA 서열은 고체 지지체상에 지방산과 공액화하고 역상 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제되었다(HPLC)^18,19.
   3. PBS로 세포를 두 번 세척하고 5 분 동안 300 x g에서 세포를 수집합니다.
   4. 앵커/바코드 스톡 솔루션 20 μL을 추가하고 파이펫을 위아래로 부드럽게 섞어 보냅니다. 얼음에 5분 동안 배양합니다.
   5. 20 μL의 공동 앵커 스톡 용액을 추가하고 파이펫을 위아래로 부드럽게 섞은 다음 얼음에 5 분 동안 배양하십시오.
   6. 4°C에서 5분 동안 300 x g에서 1% BSA및 원심분리기로 1 mL의 차가운 PBS를 추가합니다. PBS에서 얼음 감기 1% BSA로 적어도 2번 더 씻으시면 됩니다.
   7. 모든 샘플을 함께 결합하고 40 μm 셀 스트레이너를 통해 필터링합니다. 세포를 세고 3절에서 사용할 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
2. 항체 기반 바코드 처리(선택적 절차 2)
   1. 원심분리기 1 x 10^6-2x 10^{6 세포각} 샘플(단계 1.8로부터)에서 300 x g에서 5분 동안 100 μL의 염색 완충액(표1)에서1.5 mL 저결합 튜브에 이를 중단한다.
   2. 10 μL Fc 차단 시약을 넣고 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
   3. 2-8 °C에서 10 분 동안 14,000 x g에서 원심 분리하여 항체 (재료 표참조)를 준비하십시오.
   4. 각 올리고-컨쥬게이트 항체의 1 μg를 세포 염색 완충액 50 μL에 첨가하여 항체 염색 용액^20을만든다. 각 샘플 튜브에 하나의 항체 염색 용액을 추가합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
   5. PBS 1 mL로 세포를 3 회 씻고 4 °C에서 350 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
   6. 염색 버퍼의 1 mL에서 원하는 비율로 모든 샘플을 풀링하고 4 °C에서 350 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.
   7. 적절한 농도(최대 1,500개의 세포/μL)로 PBS에서 세포를 재중단하고 40 μm 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 즉시 다음 단계로 진행합니다.

3. 액적 생성 및 mRNA 역전사

참고: 이 단계는 한 번의 다중 반응에 대해 약 90분이 소요됩니다.

1. 젤 비드(재료 표 참조)를실온에서 30분 동안 평형화합니다. 젤 비드 인 에멀젼 (GEMs) 키트 (재료 표참조)에서 시약을 꺼내 서 표시된 온도로 유지하십시오.
2. 칩 B를 칩 홀더에 조립합니다(재료 표참조).
3. 75 μL의 50% 글리세롤 용액을 1열의 미사용 웰에 분배하는 단계; 행 2에서 40 μL; 행 3에서 280 μL. 칩의 상단 행에 있는 복구 웰에 글리세롤을 추가하지 마십시오.
4. 표 1에따라 얼음에 마스터 믹스를 준비합니다. 세포 현탁액 및 뉴클레아제 프리 물의 적절한 부피를 첨가하여 셀 서스펜션 부피 계산기^표(17)에 따라 혼합을 마스터하고 혼합물을 부드럽게 피펫한다. 기포를 도입하지 않고 1열에서 세포 혼합물 75 μL을 시료의 바닥 중앙에 잘 분배한다.
5. 와류 를 사용하여 30 s용 젤 비드를 소용돌이 를 사용하여 천천히 40 μL의 젤 비드를 거품을 도입하지 않고 2 열에서 겔 비드의 바닥 중심으로 잘 분배한다.
   참고 : 젖은 실패를 피하기 위해 세포와 젤 구슬을 추가하는 사이에 30 s를 기다리는 것이 중요합니다.
6. 3열의 잘 분할 오일을 위해, 웰의 측벽을 통해 분할 오일의 280 μL을 분배한다.
   참고: 분할 오일의 270μL 미만을 적재하면 비정상적인 GEM 생성이 발생할 수 있습니다.
7. 개스킷을 칩에 부착하고 개스킷을 누르지 말고 개스킷에 젖지 않도록 수평으로 유지하십시오.
8. 크롬 컨트롤러에 개스킷으로 조립된 칩을 로드하고 크롬 단일 셀 B 프로그램(재료 표참조)을 실행하고 프로그램이 완료되면 즉시 다음 단계로 진행합니다.
9. 칩을 꺼내 개스킷을 폐기하십시오. 뚜껑을 다시 접어 웰을 45°에서 노출하고 액체 레벨을 확인하여 막신이 없는지 확인합니다.
10. 복구의 가장 낮은 지점에서 100 μL의 GEM을 천천히 흡인하고 GEMs의 균일성을 확인합니다. GeMs를 새로운 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 분배하고 파이프의 측측벽에 파이펫 팁을 제공합니다.
    참고: 과잉 수성 층이 관찰되면 샘플을 다시 준비하는 것이 좋습니다. 중요한 것은 GEM이 여전히 파이펫 팁에있을 때 혼합물의 사진을 찍는 것입니다. 이 그림은 습윤 실패, 부분적으로 유화 된 GEM 및 시약 막힘이 있는지 알 수 있습니다. 사진은 또한 대체 시약 및 칩으로 시약 회사로부터 상환을 받을 증거로 사용될 수 있습니다.
11. 튜브를 열 사이클러에 넣고 역전사 절차를 수행한다(표2).
    참고: 여기에서 중지하거나 다음 단계로 진행합니다. PCR 제품은 최대 1주일 동안 -20°C에서 보관할 수 있습니다.

4. cDNA 증폭

참고: 이 단계는 약 150분 정도 걸립니다.

1. 포스트 단일 셀 역 전사 정리
   1. GEMs 키트에서 cDNA 증폭 시약을 꺼내서 (재료 표참조) 표시된 온도에서 보관하십시오.
   2. 실온에서 시료에 125 μL의 회수제를 첨가하여 이파성 혼합물을 획득한다. 불투명한 액체를 관찰하지 말고 혼합물을 피펫팅하거나 소용돌이치지 않아야 합니다.
   3. 60s를 기다린 후 튜브 바닥에서 125 μL의 회수제를 천천히 제거하십시오.
   4. 소용돌이 자기 비드 (재료표참조) 30 s에 대 한 철저 하 게 사용 하 고 즉시 구슬 정화 혼합물을 준비 하는 데 사용(표 1). 시약은 나열된 대로 순차적으로 추가되어야 합니다.
   5. 구슬 정화 혼합물을 소용돌이시키고 샘플에 200 μL을 추가합니다. 혼합물을 10 회 피펫 한 다음 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
   6. 표 1에 열거된 바와 같이 순차적으로 시약을 첨가하여 용출 용액을 준비하고 cDNA를 다음과 같이 용출한다.
      1. 용액이 지워질 때까지 샘플을 자석(높은 위치)에 놓은 다음 상급자를 제거합니다.
      2. 펠릿에 80% 에탄올 200 μL을 넣습니다. 30s 를 기다린 다음 에탄올을 제거하십시오.
      3. 4.1.6.2단계를 다른 2회 반복합니다. 원심 분리기를 짧게 자석 (낮은 위치)에 놓습니다. 남은 에탄올을 조심스럽게 제거하고 2분 이내에 공기 건조시.
         참고 : 그렇지 않으면 용출 효율이 감소 할 것이다, 2 분 이상 공기 건조를 초과하지 마십시오.
      4. 자석에서 샘플을 제거합니다. 용출 용액과 파이펫을 35.5 μL 추가하여 15회 혼합합니다. 실온에서 2 분 동안 배양하십시오.
      5. 용액이 지워질 때까지 샘플을 자석(높은 위치)에 놓습니다. 시료의 35 μL을 새로운 튜브 스트립으로 옮김.
         참고: 이 정제 절차는 4.2.1.6 단계, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 및 6.2.6 단계에서도 사용됩니다. 각 단계에서 샘플을 용출하는 데 사용되는 자기 비드의 농도와 EB 버퍼 / 초순수의 양에주의를 기울이세요.
   7. 자동화된 전기 영동^{계측기(21)를} 사용하여 용출 된 cDNA의 크기, 농도 및 무결성을 정량화합니다 (재료 표참조)(그림2).
2. cDNA의 증폭
   1. 지질 기반 바코드 전략을 이용한 cDNA 증폭(선택적 절차 1)
      1. 증폭 반응 혼합물(표 1)을얼음에 준비합니다.
      2. 증폭 반응 혼합물을 cDNA 샘플의 35 μL에 첨가합니다(단계 4.1.6.7). 파이펫 믹스, 원심분리기를 짧게. cDNA 증폭 절차에 따라 열 사이클러에 혼합물을 배양한다(표2).
      3. 철저하게 소용돌이를 한 후, 선택 시약 120 μL과 100 μL의 초순수를 100 μL의 시료에 추가하여 선택된 시약의 0.6배 농도를 획득합니다(재료 표참조). 혼합물을 15회 피펫.
      4. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 용액이 명확해질 때까지 샘플을 자석에 놓습니다.
         참고: 비드 분획 및 다중화 바코드 cDNA의 내인성 cDNA는 상수에 있다.
      5. 6.1 단계에서 다중화 바코드 cDNA 라이브러리 구성을 위해 상급을 1.5 mL 로우 바인드 튜브로 옮김.
      6. 내인성 cDNA를 4.1.6의 단계에 따라 세척하고 EB 완충액 40 μL로 용해시다.
      7. 자동 전기 영동 계측기에서 정제된 cDNA 샘플 1μL을 실행하여 cDNA를 분석/정량화합니다.
      8. Aliquot 10 μL의 cDNA를 내인성 라이브러리 시공을 위한 새로운 PCR 튜브로.
         참고: 여기에서 중지하거나 다음 단계로 진행합니다. 나머지 샘플은 최대 4주 동안 -20°C에 저장하여 필요한 경우 추가 라이브러리를 생성할 수 있습니다.
   2. 항체 기반 바코드 전략에서 cDNA 증폭 (선택적 절차 2)
      1. HTO 및 ADT 첨가제 프라이머 2pmol및 cDNA 프라이머 15 μL을 증폭 반응 혼합물 의 50 μL에 첨가하고(표 1)cDNA 증폭 절차(표 2)를수행한다.
      2. 0.6x 선택 시약을 사용하여 내인성 cDNA(비드 분획) 및 멀티플렉싱 바코드 cDNA(상수)를 분리합니다. 6.2 단계에서 바코드 라이브러리 구성을 수행하기 위해 상급체를 저장하는 것을 기억하십시오.
      3. 4.1.6의 단계에 따라 내인성 전사체 cDNA를 정화 및 용해시키고, 내인성 라이브러리 시공을 위한 새로운 PCR 튜브로 라이브러리 및 알리쿼트 10 μL의 품질 관리(QC)를 수행한다.

5. 내인성 성적증명서 자료실 준비

참고: 이 단계는 약 120분 이걸립니다.

1. 라이브러리 키트로부터 유전자 발현 라이브러리 시공 시약을 각각 표시된 온도에서 유지합니다(재료 표참조).
2. 조각화혼합물(표 1)을얼음, 파이펫에 넣고 잠시 섞어 원심분리기를 준비한다.
3. 10 μL 정제 된 cDNA 샘플 (단계 4.2.1.8 또는 4.2.2.3)에 25 μL EB 버퍼를 추가 한 다음 새로 준비 된 15 μL 조각화 혼합물을 샘플에 추가하고 혼합물을 얼음과 원심 분리기에 15 회 피펫을 잠시 첨가합니다.
4. 샘플을 미리 냉각된 열 사이클러로 전송하고 조각화, 최종 수리 및 A-tailing을 위한 PCR 프로그램을시작합니다(표 2).
5. 소용돌이 는 자기 비드를 현탁하고 연속적으로 0.6x 및 0.8x 선택 시약을 사용하여 사용자^{가이드(17) 및22에}따라 양면 크기 선택을 한다. 50 μL의 EB 버퍼를 사용하여 DNA를 용출합니다.
6. 어댑터 결찰 혼합물(표 1)을준비한 다음 혼합물을 철저히 피펫하고 잠시 원심 분리기를 준비합니다.
7. 50 μL의 어댑터 결찰 혼합물을 50 μL의 샘플에 넣고, 파이펫을 다시 15회 혼합하고 원심분리기를 간략하게 섞습니다. 열 사이클러에서 프로토콜에 따라 어댑터 결찰을 수행합니다(표2).
8. 0.8x 선택 시약을 사용하여 결찰 생성물을 정화하고 정제된 샘플을 EB 완충액 30 μL로 용해시다(단계 4.1.6 참조).
9. 샘플 인덱스 PCR 혼합물을 준비하고(표 1)정제된 샘플에 60 μL을 첨가한다. 샘플에 10 μL의 샘플 인덱스를 추가하고, 파이펫을 5회 동안 위아래로 혼합하고, 원심분리기를 짧게, 샘플 인덱스 프로토콜에 따라 열 사이클러에서 배양한다(표2).
   참고: 여기에서 중지하거나 다음 단계로 진행합니다. 두 개 이상의 웰을 사용하는 경우 각 웰에 대해 하나의 특정 샘플 인덱스(재료 표참조)를 선택합니다. 각 웰에 사용되는 인덱스 ID를 기록하고 다중 시퀀싱 실행에서 겹치지 않도록 해야 합니다.
10. 연속적으로 0.6x 및 0.8x 선택 시약을 사용하여 양면 크기 선택을 하여 정제된 내인성 세포 라이브러리 DNA^17의35 μL을 획득한다.
11. QC는 시퀀싱 전에 내인성 세포 라이브러리를(그림 2).

6. 멀티플렉싱 샘플 바코드 cDNA 라이브러리 의 준비

참고: 이 단계는 최소 120분 이내입니다.

1. 지질 기반 멀티플렉싱 전략을 위한 샘플 바코드 라이브러리 생성(선택적 절차 1)
   1. 4.2.1.5단계에서 바코드 cDNA를 샘플링하여 3.2배 선택 시약 농도를 얻기 위해 선택 시약 520 μL과 이소프로판 360 μL을 시료로 추가합니다. 혼합물을 10회 파이펫하고 실온에서 5분 동안 배양한다.
   2. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 지워질 때까지 기다립니다. 그런 다음 상급을 버리십시오.
   3. 80% 에탄올 500 μL을 사용하여 자석에 구슬을 두 번 씻고 세척 할 때마다 30s를 기다립니다.
   4. 구슬을 잠시 원심분리하고 자석위에 놓습니다. P10 마이크로파이펫으로 남은 에탄올을 제거하고 구슬을 2분 동안 둡니다.
   5. 자석 랙에서 튜브를 제거하고 EB 버퍼의 50 μL에서 구슬을 다시 일시 중단합니다. 위아래로 파이펫을 사용하여 철저히 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.
   6. 튜브를 자석으로 되돌리고 용액이 지워지때까지 기다립니다. 상급체(샘플 바코드 cDNA)를 새 PCR 튜브로 전송합니다. 구슬을 옮기지 않도록 주의하십시오.
   7. 샘플 바코드 cDNA^23의농도를 정량화합니다.
   8. 지질 바코드 라이브러리혼합물(표 1)을준비하고, 총 부피 50 μl에 대해 정제된 바코드 cDNA 3.5 ng(단계 6.1.6)와 뉴클레아제 불포함 물을 첨가한다.
   9. 지질 기반 바코드 라이브러리 PCR(표2)에따라 열 사이클러에 보관하십시오.
   10. 1.6x 선택 시약을 사용하여 PCR 제품을 정화하고 25 μL의 EB 버퍼로 DNA를 용해하십시오(단계 4.1.6 참조).
   11. 1:5의 초기 희석으로부터 고감도 DNA 분석 방법^24를 이용하여 라이브러리 농도를 정량화하였다(도2).
2. 항체 기반 멀티플렉싱 전략을 위한 시료 바코드 라이브러리 생성(선택적 절차 2)
   1. 4.2.2.3 단계에서 획득한 샘플 바코드를 포함하는 상급물질에 선택 시약의 1.4배 반응 량을 추가하여 2배 선택 시약 비율을 얻습니다.
   2. 4.1.6의 단계를 수행하여 80 % 에탄올로 구슬을 씻고 바코드 된 cDNA를 초순수로 용해시다.
   3. 2x 선택 시약으로 선택 프로토콜을 두 번째로 수행하고 초순수를 사용하여 용해하십시오.
   4. 항체 바코드 라이브러리혼합물(표 1)을준비하고 마지막 단계에서 정제된 바코드 cDNA 45 μL을 첨가한다.
   5. 항체 바코드 라이브러리 PCR(표2)^20에이어 열 사이클러로 인큐베이팅한다.
   6. 1.6x 선택 시약을 사용하여 PCR 제품을 정화하고 30 μL의 초순수로 정제된 시료를 용해하십시오(4.1.6단계 참조).

7. 라이브러리 시퀀싱

참고: HiSeq 4000 및 NovaSeq와 같은 여러 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 내인성 전사체 라이브러리 및 멀티플렉싱 바코드 라이브러리를 시퀀싱할 수 있습니다.

1. 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 내인성 전사체 라이브러리 와 멀티플렉싱 바코드 라이브러리를 시퀀싱합니다.
2. 시퀀싱 회사 또는 시퀀싱 시설의 전문가의 권장 사항에 따라 라이브러리를 희석합니다. 내인성 전사체 라이브러리에는 셀당 최소 20,000개의 읽기가 권장되고 바코드 라이브러리에는 3000개의 읽기가 권장됩니다.

8. 데이터 분석

참고: 클라우드 기반 리소스 BaseSpace를 사용하거나 UNIX 서버에서 bcl2fastq 패키지를 실행하여 시퀀싱 데이터를 다중화합니다.

1. 내인성 전사체 데이터 분석
   1. 디멀티플렉싱 소프트웨어에서 생성된 fastq 데이터를 사용하여 상용 데이터 분석 파이프라인에서 "mkfastq"를 실행하여 각 GEM 바코드를 더 세분화합니다.
   2. "개수"를 실행하여 정렬, 필터링, 바코드 계수 및 UMI 계수를 수행합니다.
   3. 선택적으로 "aggr"을 실행하여 단일 실험에서 여러 시퀀싱 레인을 집계합니다.
   4. "셀 브라우저"(재료 표참조)를 사용하여 데이터를 시각화하고, 클러스터 셀을 시각화하고, 차별화된 유전자를 식별하고, tSNE 또는 유전자 발현 히트맵 플롯을 생성합니다.
   5. 선택적으로, 잘 유지된 R-기반^{플랫폼(25)을} 사용하여 데이터를 정규화 및 배율화하고, 차별화된 발현 유전자를 식별하고, tSNE/UMAP 플롯 및 유전자 발현 히트맵을 생성한다(그림3).
2. 멀티플렉싱 바코드 데이터 분석
   1. 지질 기반 바코드 전략의 데이터 분석
      1. 시판되는 데이터 분석 파이프라인 또는 deMULTIplex R패키지(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)를사용하여 샘플 바코드 FASTQ 파일을 샘플 바코드 UMI 카운트 매트릭스로 변환합니다.
      2. 통합 분석을 위해 내인성 전사체 데이터와 함께 바코드 UMI 카운트 매트릭스를 R 기반 플랫폼(재료 표참조)에 로드합니다(그림3).
   2. 항체 기반 바코드 전략의 데이터 분석
      1. 시판되는 데이터 분석 파이프라인의 "개수"를 사용하여 라이브러리 CSV 파일 및 해시태그 기능 참조 CSV 파일을 제공하여 바코드를 매핑합니다.
      2. 각 셀 바코드에 대한 피처 바코드 수와 함께 유전자 발현 수를 포함하는 출력 통합 기능 바코드 매트릭스를 다운스트림 분석을 위한 R 기반 플랫폼에 로드합니다.

결과

이 연구에서, 우리는 다중화 된 단일 세포 mRNA 염기서열 분석이 기관의 별도의 부분에서 다른 샘플을 동시에 처리하기 위해 수행된 방법을 전시하기 위해 예로 마우스 배아 심장을 사용했습니다. E18.5 CD1 마우스 하트는 좌측 심방(LA), 우측 심방(RA), 좌심실(LV) 및 우심실(RV)으로 분리및 해부되었다. 심방 및 심실 세포는 지질 기반 바코드 절차를 사용하여 독립적으로 바코드?...

토론

본 연구에서, 우리는 단일 세포 전사 프로파일을 분석하는 프로토콜을 입증했다. 우리는 또한 scRNA-Seq 워크플로우에서 멀티플렉스 샘플에 두 가지 선택적 방법을 제공했습니다. 두 방법 모두 다양한 실험실에서 실현 가능한 것으로 입증되었으며 비용 효율적이고 배치 효과가없는 단일 세포 실험^18,26을실행하는 솔루션을 제공했습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween-20	Bio-Rad	1610781
10x Chip Holder	10x Genomics	120252 330019
10x Chromium Controller	10x Genomics	120223
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250 230003
10x Vortex Adapter	10x Genomics	330002, 120251
10x Vortex Clip	10x Genomics	120253 230002
4200 TapeStation System	Agilent	G2991AA
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626	University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode Oligo	Integrated DNA Technologies	Single-stranded DNA	25 nmol
Buffer EB	Qiagen	19086
CD1 mice	Chales River	Strain Code 022	ordered pregnant mice
Centrifuge 5424R	Appendorf	2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns	10x Genomics	1000073	Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns	10x Genomics	120262	Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns	10x Genomics	1000094	Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v3	10x Genomics	1000095	Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads	10x Genomics	2000059	Store at -80 °C
Collagenase A	Sigma/Millipore	10103578001	Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase B	Sigma/Millipore	11088807001	Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5582	University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mL	Eppendorf	022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mL	Eppendorf	022431048
Dynabeads MyOne SILANE	10x Genomics	2000048	Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 Magnet	Theromo Scientific	12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)	Sigma	E7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning Cellgro	14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning Cellgro	14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United States	Fisher Scientific	26140079	Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μl	Theromo Scientific	4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μl	Theromo Scientific	4661000N
Flowmi Cell Strainer	Sigma	BAH136800040	Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)	Ricca Chemical Company	3290-32
HBSS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)	BioLegend	422301	Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA)	Fisher Scientific	A464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)	Fisher Scientific	NC0295239	Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)	Integrated DNA Technologies	Single-stranded DNA	100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)	Thermo Fisher Scientific	12090-015
MasterCycler Pro	Eppendorf	950W
Nuclease-Free Water (Ambion)	Thermo Fisher Scientific	AM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips	Eppendorf	951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesium	Corning Cellgro	21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)	Sigma-Aldrich	SRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettes	Fisher Scientific	05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)	Beckman Coulter	B23318 (60ml)
Template Switch Oligo	10x Genomics	3000228	Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser	10x Genomics		https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger	10x Genomics		https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3	satijalab		https://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tip	USA Scientific	1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tip	USA Scientific	1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tip	USA Scientific	1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 Antibody	BioLegend	155801	0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 Antibody	BioLegend	155803	0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 Antibody	BioLegend	155805	0.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primer	Integrated DNA Technologies	Single-stranded DNA	100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4%	Fisher Scientific	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Fisher Scientific	25200-056
Universal I5	Integrated DNA Technologies	Single-stranded DNA	100 nmol