JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada fare embriyonik dokularında gen ekspresyonunu profillemek için çok katlı tek hücreli mRNA dizileme yöntemi ni sunduk. Damlacık tabanlı tek hücreli mRNA dizileme (scRNA-Seq) yöntem çoklama stratejileri ile birlikte aynı anda birden fazla örnekten tek hücre profili olabilir, hangi önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve deneysel toplu etkileri en aza indirir.

Özet

Tek hücreli mRNA dizilimi son birkaç yılda önemli ilerlemeler kaydetmiştir ve gelişim biyolojisi alanında önemli bir araç haline gelmiştir. Nadir hücre popülasyonlarını belirlemek, yeni işaretgenleri keşfetmek ve mekansal ve zamansal gelişimsel bilgileri çözmek için başarıyla kullanılmıştır. Tek hücreli yöntem de son iki ila üç yıl içinde damlacık tabanlı çözümler mikroakışkan bazlı Fluidigm C1 teknolojisi gelişti. Burada damlacık tabanlı scRNA-Seq yöntemini kullanarak fare embriyonik doku hücrelerinin profilini göstermek için bir örnek olarak kalp kullanılır. Buna ek olarak, tek bir deneyde birden fazla örneği profillemek için iş akışına iki strateji entegre ettik. Entegre yöntemlerden birini kullanarak, aynı anda sekiz kalp örneğinden 9.000'den fazla hücrenin profilini çıkarmış olduk. Bu yöntemler, farklı genetik geçmişlerden, gelişim evrelerinden veya anatomik konumlardan tek hücreleri aynı anda profillemek için uygun maliyetli bir yol sağlayarak gelişimbiyolojisi alanında değerli olacaktır.

Giriş

Her bir hücrenin transkripsiyon profili embriyonik gelişim sırasında hücre popülasyonları arasında değişir. Tek moleküler in situ hibridizasyon genlerin az sayıda ekspresyonu görselleştirmek için kullanılabilir rağmen1, tek hücreli mRNA sıralama (scRNA-Seq) tek hücrelerde genlerin genom çapında ifade desenleri göstermek için tarafsız bir yaklaşım sağlar. İlk olarak 2009 yılında yayınlandıktan sonra2, scRNA-Seq son yıllarda birden fazla gelişim aşamasında birden fazla doku çalışması için uygulanmıştır3,4,5. Ayrıca, insan hücre atlası son zamanlarda gelişimodaklı projelerini başlattığı için, yakın gelecekte insan embriyonik dokularından daha fazla tek hücre verisi oluşturulması beklenmektedir.

Geliştirmek için ilk organ olarak kalp embriyonik gelişiminde kritik bir rol oynar. Kalp birden fazla hücre tiplerinden oluşur ve her hücre tipinin gelişimi zamansal ve mekansal olarak sıkı bir şekilde düzenlenir. Son birkaç yıl içinde, erken gelişim aşamalarında kardiyak hücrelerin kökeni ve hücre soyu karakterize edilmiştir6, konjenital kalp hastalığı patogenezini anlamak için muazzam bir yararlı navigasyon aracı sağlamak, hem de kardiyomiyosit rejenerasyon teşvik etmek için daha teknolojik olarak gelişmiş yöntemler geliştirmek için7.

ScRNA-Seq son yıllarda hızlı bir genişleme uğramıştır8,9,10. Yeni geliştirilen yöntemlerle, tek hücreli deneylerin tasarımı ve analizi daha ulaşılabilir hale gelmiştir11,12,13,14. Burada sunulan yöntem damlacık çözümlerine dayalı ticari bir prosedürdür (bkz. Malzeme Tablosu)15,16. Bu yöntem, mikroakışkan kontrol sisteminin kontrolü altında bir yağ-su emülsiyon damlacık hücreleri ve benzersiz barkodlu boncuk setleri yakalama özellikleri. Damlacıklara hücre yükleme hızı son derece düşüktür, böylece damlacık emülsiyonlarının çoğu sadece bir hücre içerir17. Prosedürün dahice tasarımı, tek hücreli tek hücreli emülsiyonların barkodlama ile eş zamanlı olarak meydana gelmesinden gelir ve bu da heterojen bir popülasyonda RNA-Seq kullanan hücrelerin paralel analizini sağlar.

Çoklama stratejilerinin birleştirilmesi, geleneksel tek hücreli iş akışı13,14'eyapılan önemli eklemelerden biridir. Bu ek hücre doublets atarak çok yararlıdır, deneysel maliyetleri azaltmak, ve toplu etkileri ortadan kaldırarak18,19. Lipid bazlı barkodlama stratejisi ve antikor bazlı barkodlama stratejisi (bkz. Malzemeler Tablosu)çoğunlukla kullanılan iki çokluk yöntemidir. Her iki yöntemde de her örneği etiketlemek için belirli barkodlar kullanılır ve etiketli örnekler daha sonra tek hücre yakalama, kitaplık hazırlama ve sıralama için karıştırılır. Daha sonra, havuzlu sıralama verileri barkod dizileri analiz edilerek ayrılabilir (Şekil 1)19. Ancak, iki yöntem arasında önemli farklılıklar vardır. Lipid bazlı barkodlama stratejisi herhangi bir hücre tipi tercihleri olduğu tespit edilmemiştir lipid-modifiye oligonükleotidler dayanmaktadır. Antikor tabanlı barkodlama stratejisi sadece antijen proteinleri ifade hücreleri tespit ederken19,20. Buna ek olarak, lipidler leke için yaklaşık 10 dakika sürer ama 40 dk antikorlar leke(Şekil 1). Ayrıca, lipid modifiye oligonükleotidler antikor-konjuge oligonükleotidler daha ucuz ama ticari olarak bu makalenin yazıldığı anda mevcut değildir. Son olarak, lipid tabanlı strateji bir deneyde 96 örneği çok katlayabilir, ancak antikor tabanlı strateji şu anda sadece 12 örneği çok katlayabilir.

Tek bir deneyde multipleks için önerilen hücre numarası 2,5 x 104daha düşük olmalıdır , aksi takdirde, hücre doublets ve potansiyel ortam mRNA kontaminasyon yüksek bir yüzdesi yol açacaktır. Çoklama stratejileri sayesinde, tek hücre yakalama, cDNA oluşturma ve birden fazla örnek için kitaplık hazırlama maliyeti bir örnek maliyetine düşürülür, ancak sıralama maliyeti aynı kalır.

Protokol

Hayvan prosedürü Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca.

1. Fare Embriyonik Kalp Diseksiyonu ve Tek Hücresüspansiyon Hazırlığı

NOT: Bu adım, diseksiyon yapılacak embriyo sayısına bağlı olarak birkaç saat sürebilir.

  1. E18.5 embriyonik kalpleri elde etmek için, CO2 uygulaması ile hamile bir CD1 fare ötenazi. Karın bölgesinde istenmeyen saç kaldırmak ve% 70 etanol ile cilt dezenfekte etmek için bir jilet kullanın.
  2. Sterilize makas kullanarak karın derisini kesin ve dikkatlice embriyoları incelemek ve hızlı bir şekilde soğuk fosfat tamponlu salin içine koymak (PBS) buz üzerinde.
  3. Her bir embriyodan kalpleri, forceps ve makas kullanarak stereoskopik mikroskop altında soğuk PBS ile dolu 10 cm'lik bir tabakta dikkatlice izole edin.
    NOT: Akciğeri kalple birlikte keserek dört odacıkları sağlam tutun ve kalbi cerrahi aletlerle doğrudan yakalamayın/çekmeyin.
  4. Transfer ~ 10 kalpleri yeni bir 10 cm çanak soğuk PBS dolu ve mikro-sol atriyum içine kalpleri incelemek, sağ atriyum, sol ventrikül, ve sağ ventrikül.
    NOT: Bu her örnekten 1 x 106'dan fazla hücre verimi olduğu varsayılır. Biz örnek başına en az 1 x 105 hücreleri ile başlamak için tavsiye ediyoruz.
  5. 4 hazneli mendilin her birini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve makasla parçalara ayırın. 3 dk için 300 x g santrifüj dokuları toplamak için.
  6. Supernatant'ı azarladıktan sonra, her tüpe %0,25 Tripsin/EDTA 1 mL ekleyin ve P1000 pipet kullanarak 10 dk. Pipet'i 10 dk. Pipet'te 37 °C'lik bir su banyosunda inkübedin.
  7. Embriyonik evre E11.5'ten büyükse, 1 0 mg/mL kollajenaz A/B karışımının 1 mL'sini ekleyin ve 37 °C'de 10-20 dakika boyunca inkütün.
  8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve enzimleri seyreltmek için 8 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) ekleyin. Hücreleri 300 x g'de 5 dk. PBS'nin 1 mL'inde hücreleri askıya alın ve 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücreleri 40 μm'lik hücresüzden filtreleyin.
  9. Her numuneden 15 μL hacim alın ve %0,04 trypan mavisi ile karıştırın. Bunu bir hücre sayma odasına yükleyin ve hücre sayacındaki hücreleri sayın.
    NOT: Yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için hücre canlılığının %95'ten yüksek olması önerilir.

2. Tek Hücreli Çoklama Barkodlama

NOT: Bu adım, işlenen numune sayısına bağlı olarak değişen en az 40 dakika sürer. Ön amplifikasyon adımları (adım 2.11-3.11) için RNase dekontaminasyon çözeltisi ile tedavi edilen temiz bir tezgah alanı gereklidir ve amplifikasyon sonrası adımlar için ayrı bir temiz tezgah alanı gereklidir (3.11'den sonraki adımlar).

  1. Lipid bazlı barkodlama prosedürü (isteğe bağlı prosedür 1)
    1. Hücre konsantrasyonuna bağlı olarak, örnek başına 5 x 105 hücreden daha az tutun. Hücre süspansiyonenkaz ve hücre agregaları ücretsiz olduğundan emin olun.
    2. Her numune için 2 μM çapa/barkod stok çözeltisi ve 2 μM co-anchor stok çözeltisi hazırlayın(Tablo 1).
      NOT: Çapa ve yardımcı çapa nazik Dr Zev J. Gartner laboratuvar tarafından hediye edildi. Bu lipid-modifiye oligonükleotidsentez için, DNA dizileri katı bir destek yağ asidi ile konjuge edildi ve ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC)18,19tarafından saflaştırılmış .
    3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve hücreleri 300 x g'de 5 dk. 180 μL PBS'de hücreleri askıya alın.
    4. 20 μL çapa/barkod stok çözeltisi ve pipeti yavaşça karıştırıp karıştırın. 5 dakika buz üzerinde kuluçka.
    5. 20 μL co-anchor stok çözeltisi ve pipet ekleyin yavaşça karıştırmak için yukarı ve aşağı, sonra başka bir 5 dakika buz üzerinde kuluçka.
    6. 4 °C'de 5 dk için 300 x g'de %1 BSA ve santrifüj ile 1 mL soğuk PBS ekleyin. PBS'de en az 2 kez daha buz gibi %1 BSA ile yıkayın.
    7. Tüm örnekleri birleştirin ve 40 μm hücresüzden süzün. Hücreleri sayVe hücre süspansiyonuna bölüm 3'te kullanmak için buzüzerinde tutun.
  2. Antikor tabanlı barkodlama prosedürü (isteğe bağlı yordam 2)
    1. Santrifüj 1 x 106-2 x 106 hücreleri her örnek için (adım 1.8) 5 dk için 300 x g ve 100 μL boyama tampon(Tablo 1) 1,5 mL düşük bağlama tüpleri onları askıya.
    2. 4 °C'de 10 dakika boyunca 10 μL Fc bloke reaktifi ve kuluçka ya da 10 dakika ekleyin.
    3. Antikorları hazırlayın (bkz. Malzemeler Tablosu)14.000 x g'de 2-8 °C'de 10 dakika santrifüj ederek.
    4. Her oligo konjuge antikordan 1 μg'lik hücre boyama tamponuna ilave ederek antikor boyama solüsyonu20. Her numune tüpüne bir antikor boyama çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 30 dk kuluçka.
    5. Hücreleri 1 mL PBS ile 3 kez yıkayın, 4 °C'de 350 x g'de 5 dk döndürün.
    6. Tüm numuneleri istenilen oranlarda 1 mL boyama tamponu içinde havuz, 4 °C'de 350 x g'de 5 dk döndürün.
    7. PBS'deki hücreleri uygun konsantrasyonda yeniden askıya alın (1.500 hücre/μL'ye kadar) ve hücreleri 40 μm hücreli süzgeçten filtreleyin. Hemen bir sonraki adıma geçin.

3. Damlacık Üretimi ve mRNA Ters Transkripsiyon

NOT: Bu adım bir çok katlı reaksiyon için yaklaşık 90 dakika sürer.

  1. Jel boncukları (Bkz. Malzeme Tablosu)oda sıcaklığına 30 dakika boyunca dengeleyin. Jel boncuk-in-emülsiyon (GEMs) kitinden reaktifleri alın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve belirtilen sıcaklıkta saklayın.
  2. B yongasını bir talaş tutucuya monte edin (bkz. Malzemeler Tablosu).
  3. 75 μL%50 gliserol çözeltisini kullanılmayan kuyulara 1. 40 μL satır 2; 280 μL satır 3. Çipin üst satırında herhangi bir kurtarma kuyularında gliserol eklemeyin.
  4. Ana karışımı Tablo 1'egöre buz üzerinde hazırlayın. Bir hücre süspansiyon hacmi hesap tablosu17'ye göre ana karışıma uygun hacimli hücre süspansiyonu ve nükleaz içermeyen su ekleyin ve karışımı hafifçe pipetleyin. Kabarcıklar sokmadan örnek 1'de numunenin alt ortasına 75 μL hücre karışımı dağıtın.
  5. Girdap 30 s için jel boncuk bir girdap adaptörü kullanarak ve yavaş yavaş kabarcıklar tanıtmadan 2 satır jel boncuk alt merkezine jel boncuk 40 μL dağıtmak.
    NOT: Isletme arızası önlemek için hücre ve jel boncuk ekleme arasında 30 s beklemek önemlidir.
  6. 3. sırada yer alan bölümleme yağı için, kuyunun yanaklarından 280 μL'lik bölümleme yağı dağıtın.
    NOT: 270 μL'den az bölümleme yağı nın yüklenmesi anormal GEM üretimine yol açacaktır.
  7. Contayı çipin üzerine takın, contanın üzerine bastırmayın ve contanın ıslatılmasını önlemek için yatay tutun.
  8. Monte edilen çipi krom denetleyicideki contayla yükleyin ve krom tek hücreli B programını çalıştırın (Bkz. Malzeme Tablosu),program tamamlandığında hemen bir sonraki adıma geçin.
  9. Çipi çıkar ve contayı at. 45° kuyuları ortaya çıkarmak için kapağı geri katlayın, takunya olmadığından emin olmak için sıvı seviyesini kontrol edin.
  10. İyi leşmenin en düşük noktalarından 100 μL'lik GEM'leri yavaşça aspire edin ve GEM'lerin tekdüzeliğini kontrol edin. Jems'i, tüpün yanaklarına karşı pipet uçlarıyla buz üzerinde yeni bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpüne dağıtın.
    NOT: Aşırı sulu tabaka gözlenirse, numunelerin yeniden hazırlanması önerilir. Daha da önemlisi, GEM'ler hala pipet uçlarındayken karışımın resmini çekin. Bu resim, bir ıslatma hatası, kısmen emülsifiye edilmiş GEM'ler ve reaktif tıkanıklıkları olup olmadığını anlayabilir. Fotoğraf aynı zamanda yedek reaktifler ve yongaları ile reaktif şirketten geri ödeme almak için kanıt olarak kullanılabilir.
  11. Tüpü termal bir döngüye sokun ve ters transkripsiyon işlemini gerçekleştirin(Tablo 2).
    NOT: Burada durun veya bir sonraki adıma geçin. PCR ürünü -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.

4. cDNA Amplifikasyonu

NOT: Bu adım yaklaşık 150 dakika sürer.

  1. Post tek hücreli ters transkripsiyon temizleme
    1. GEM kitinden cDNA amplifikasyon reaktiflerini alın (Bkz. Malzeme Tablosu)ve belirtilen sıcaklıkta saklayın.
    2. Biphasik bir karışım elde etmek için oda sıcaklığında numuneye 125 μL geri kazanım maddesi ekleyin. Hiçbir opak sıvı gözlenmeli ve pipetleme veya karışım girdap kaçının.
    3. 60 s bekledikten sonra, tüpün altından yavaşça 125 μL'lik kurtarma maddesi çıkarın.
    4. Vortex manyetik boncuklar (Malzeme Tablosubakınız) iyice 30 s ve hemen boncuk temizleme karışımı hazırlamak için kullanabilirsiniz(Tablo 1). Reaktifler listelenmiş olarak sırayla eklenmelidir.
    5. Girdap boncuk temizleme karışımı ve örnek 200 μL ekleyin. Pipet karışımı 10 kez sonra oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
    6. Elüsyon çözeltisini hazırlamak için tablo 1'de listelenen reaktifleri sırayla ekleyin ve cDNA'yı aşağıdaki gibi aşındırın.
      1. Çözelti temize çıkarana kadar numuneleri mıknatısın üzerine (yüksek konum) yerleştirin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve ardından süpernatantı çıkarın.
      2. Pelete %80 etanol 200 μL ekleyin. 30 s bekleyin, sonra etanol çıkarın.
      3. Başka bir 2 kez adım 4.1.6.2 tekrarlayın. Santrifüj kısaca ve mıknatıs (düşük pozisyon) üzerine yerleştirin. Dikkatle az 2 dakika için kalan etanol ve hava kuru çıkarın.
        NOT: 2 dk'yi geçerek hava kurutmayı AŞMAYIN, aksi takdirde elüsyon verimi azalacaktır.
      4. Örneği mıknatıstan çıkarın. 15 kez karıştırmak için 35,5 μL elüsyon çözeltisi ve pipet ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dk kuluçka.
      5. Çözelti temizlenene kadar numuneyi mıknatısın üzerine (yüksek konum) yerleştirin. Numunenin 35 μL'sini yeni bir tüp şeridine aktarın.
        NOT: Bu arınma prosedürü 4.2.1.6, 4.2.2.3, 5.8, 6.1.10 ve 6.2.6 adımlarında da kullanılır. Manyetik boncukların konsantrasyonuna ve her adımda numuneleri elemek için kullanılan EB tampon/ultra saf su hacmine dikkat edin.
    7. Otomatik bir elektroforez aleti21 kullanarak eluted cDNA'nın boyutunu, konsantrasyonu ve bütünlüğünü ölçün (bkz. Malzeme Tablosu)(Şekil 2).
  2. CDNA amplifikasyonu
    1. lipid bazlı barkodlama stratejisi kullanılarak cDNA amplifikasyonu (isteğe bağlı prosedür 1)
      1. Buz üzerinde amplifikasyon reaksiyonu karışımı(Tablo 1)hazırlayın.
      2. 35 μL'lik cDNA örneklerine (adım 4.1.6.7'den) amplifikasyon reaksiyonu karışımını ekleyin. Pipet karışımı ve santrifüj kısaca. CDNA amplifikasyon işlemini takiben karışımı bir termal döngüde kuluçkaya yatırın (Tablo 2).
      3. Iyice girdap yaptıktan sonra, seçilmiş reaktifin 0,6 x konsantrasyonuna sahip olmak için 100 μL numuneye 120 μL select reaktif ve 100 μL ultrasaf su ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Pipet karışımı 15 kez.
      4. Oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatın ve çözeltiler netleşene kadar numuneyi mıknatısın üzerine yerleştirin.
        NOT: Boncuk fraksiyonunda endojen cDNA ve barkodlu cDNA'nın çokluk içinde supernatant bulunmaktadır.
      5. 6.1 adımda barkodlu cDNA kitaplığı inşaatının çokluzun ulaştırılması için supernatant'ı 1,5 mL'lik düşük bağlama tüpüne aktarın.
      6. 4.1.6'daki adımları izleyerek endojen cDNA'yı temizleyin ve 40 μL EB tamponu ile temizleyin.
      7. CDNA'yı analiz etmek/ölçmek için otomatik bir elektroforez aletine (Bkz. Malzeme Tablosu)1 μL saflaştırılmış cDNA numunesi çalıştırın.
      8. Aliquot 10 μL cDNA endojen kütüphane inşaatı için yeni bir PCR tüpü içine.
        NOT: Burada durun veya bir sonraki adıma geçin. Kalan numune -20 °C'de 4 haftaya kadar saklanabilir ve gerekirse ek kütüphaneler oluşturabilir.
    2. antikor bazlı barkodlama stratejisinde cDNA amplifikasyonu (isteğe bağlı prosedür 2)
      1. 2 pmol HTO ve ADT katkı lı astar ve 15 μL cDNA astarı 50 μL amplifikasyon reaksiyon karışımına ekleyin(Tablo 1) ve cDNA amplifikasyon prosedürü ile cDNA amplifikasyon uyguluyor (Tablo 2).
      2. Endojen cDNA (boncuk fraksiyonu) ve çoklubarkod cDNA (supernatant) ayırmak için 0.6x select reaktif kullanın. Adım 6.2'de barkodlama kitaplığı yapımı gerçekleştirmek için supernatant kaydetmeyi unutmayın.
      3. 4.1.6'daki adımları izleyerek endojen transkript cDNA'sını arındırın ve temize çıkarın, kütüphanelerin kalite kontrolünü (QC) gerçekleştirin ve endojen kütüphane yapımı için yeni bir PCR tüpüne 10°L'lik aliquot yapın.

5. Endojen Transkript Kütüphane Hazırlama

NOT: Bu adım yaklaşık 120 dakika sürer.

  1. Gen ekspresyonu kitaplığı yapı reaktiflerini kütüphane kitinden (bkz. Malzemeler Tablosu)sırasıyla belirtilen sıcaklıkta saklayın.
  2. Buz üzerinde parçalanma karışımı(Tablo 1)hazırlayın, pipet karıştırmak ve kısaca santrifüj.
  3. 10 μL saflaştırılmış cDNA örneğine 25°L EB tamponu ekleyin (adım 4.2.1.8 veya 4.2.2.3) ve sonra yeni hazırlanan 15 μL parçalanma karışımını numuneye ekleyin, pipet karışımı nı 15 kez buz ve santrifüj üzerine kısa bir süre ekleyin.
  4. Numuneyi önceden soğutulmuş bir termal döngüye aktarın ve parçalanma, son onarım ve A-tailing için PCR programını başlatın(Tablo 2).
  5. Vortex manyetik boncuklar askıya almak ve art arda 0.6x ve 0.8x seçin reaktifler kullanarak kullanıcı kılavuzu17,22göre çift taraflı boyut seçimi yapmak için seçin. DNA'yı yok etmek için 50 μL'lik EB tamponu kullanın.
  6. Adaptör ligasyon karışımı(Tablo 1),sonra pipet iyice karışımı ve santrifüj kısaca hazırlayın.
  7. 50 μL numuneye 50 μL adaptör ligasyon karışımı ekleyin, pipet 15 kez tekrar karıştırın ve kısa bir süre santrifüj yapın. Adaptör ligasyonunu bir termal döngüdeki protokole göre gerçekleştirin (Tablo 2).
  8. Ligasyon ürününü arındırmak ve saflaştırılmış numuneyi 30 μL EB tamponu yla temizlemek için 0,8x select reaktifkullanın (bkz. adım 4.1.6).
  9. Örnek indeks PCR karışımını hazırlayın (Tablo 1) ve saflaştırılmış numuneye 60 μL ekleyin. Numuneye 10 μL numune indeksi ekleyin, pipet 5 kez yukarı ve aşağı karıştırın ve kısaca santrifüj, numune indeks protokolünden sonra termal bir döngüiçinde kuluçkaya yatırılır(Tablo 2).
    NOT: Burada durun veya bir sonraki adıma geçin. Birden fazla kuyu kullanılıyorsa, her kuyu için belirli bir örnek dizini (Bkz. Malzeme Tablosu)seçin. Her kuyu için kullanılan dizin kimliğini kaydetmeyi ve çok katlı sıralama çalışmasında çakışma olmamasını unutmayın.
  10. Art arda 0.6x ve 0.8x seçipreaktifleri kullanarak 35 μL saflaştırılmış endojen hücresel kütüphane DNA17elde etmek için çift taraflı boyut seçimi yapın.
  11. QC sıralamadan önce endojen hücresel kütüphane (Şekil 2).

6. Çokluk Örneği Barkod cDNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

NOT: Bu adım en az 120 dakika sürer.

  1. Lipid bazlı çoklama stratejisi için örnek barkod kitaplığı üretimi (isteğe bağlı prosedür 1)
    1. 3.2x select reaktif konsantrasyonu elde etmek için 4.2.1.5 adımından barkod cDNA örneği için 520 μL select reaktif ve 360 μL izopropanol ekleyin. Pipet karışımı 10 kez ve 5 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    2. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve çözümün temizlenmesini bekleyin. Sonra supernatant atın.
    3. 500 μL%80 etanol kullanarak boncukları mıknatısta iki kez yıkayın ve her yıkamadan sonra 30 s bekleyin.
    4. Kısaca boncuksantrik ve bir mıknatıs üzerine yerleştirin. P10 mikropipet ile kalan etanol çıkarın ve 2 dakika boncuk bırakın.
    5. Tüpü mıknatıs rafından çıkarın ve 50 μL'lik EB tamponundaki boncukları yeniden askıya alın. Pipet yukarı ve aşağı iyice karıştırmak için. 2 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
    6. Tüpü mıknatısa döndürün ve çözümün temizlenmesini bekleyin. Supernatant 'ı (örnek barkod cDNA) yeni bir PCR tüpüne aktarın. Herhangi bir boncuk aktarmak için dikkatli olun.
    7. Örnek barkod cDNA23konsantrasyonu ölçmek .
    8. Toplam 50 μl hacim için saflaştırılmış barkodlu cDNA (adım 6.1.6'dan) ve nükleaz içermeyen su 3.5 ng ekleyin lipid barkod kitaplık karışımı(Tablo 1),hazırlayın.
    9. Lipid tabanlı barkod kitaplığı PCR 'yi takip eden bir termal döngüde saklayın (Tablo 2).
    10. PCR ürününü arındırmak ve 25 μL EB tamponu yla DNA'yı elemek için 1,6x select reaktifkullanın (bkz. adım 4.1.6).
    11. Kütüphane konsantrasyonunun 1:5'in ilk seyreltilmesinden24'ü yüksek duyarlılıklı DNA analiz yöntemiyle ölçülmesi(Şekil 2).
  2. Antikor tabanlı çoklama stratejisi için örnek barkod kitaplığı oluşturma (isteğe bağlı prosedür 2)
    1. 2x select reaktif oranı elde etmek için 4.2.2.3 adımından alınan örnek barkodları içeren supernatant'a select reaktifin ek 1,4x reaksiyon hacmi ekleyin.
    2. 4.1.6'daki adımları izleyerek boncukları %80 etanol ile yıkayın ve barkodlu cDNA'yı ultra saf su ile temizleyin.
    3. Seçim protokolünü ikinci kez 2x select reaktifle gerçekleştirin ve ultra saf su kullanarak esute.
    4. Antikor barkod kitaplık karışımı(Tablo 1) hazırlayın ve son adımdan itibaren 45 μL saflaştırılmış barkodlu cDNA ekleyin.
    5. Antikor barkod kitaplığı PCR aşağıdaki bir termal döngü içinde kuluçka (Tablo 2)20.
    6. PCR ürününü arındırmak ve saflaştırılmış numuneyi 30 μL ultra saf su yla temizlemek için 1,6 x seçip reaktifkullanın (bkz. adım 4.1.6).

7. Kütüphane Sıralaması

NOT: HiSeq 4000 ve NovaSeq gibi birden fazla yeni nesil sıralama platformu, endojen transkript kitaplıklarını ve çok katlı barkod kitaplıklarını sıralamak için kullanılabilir.

  1. Endojen transkript kitaplıklarını ve çok katlı barkod kitaplıklarını sıralamak için yeni nesil sıralama platformlarını kullanın.
  2. Kütüphaneleri, sıralama şirketindeki veya sıralama tesisindeki bir uzmanın tavsiyelerine göre seyreltin. Endojen transkript kitaplığı için hücre başına en az 20.000 okuma ve barkod kitaplıkları için 3000 okuma önerilir.

8. Veri Analizi

NOT: Bulut tabanlı kaynak BaseSpace'i kullanarak veya bir UNIX sunucusunda bcl2fastq paketini çalıştırarak sıralama verilerini de-multiplex.

  1. Endojen transkripsiyon veri analizi
    1. Demultiplexing yazılımından oluşturulan fastq verileri ile, her GEMs barkod daha demultiplex için ticari olarak kullanılabilir veri analizi boru hattı (Malzeme Tablosubakınız) üzerinde "mkfastq" çalıştırın.
    2. Hizalama, filtreleme, barkod sayma ve UMI sayma işlemleri gerçekleştirmek için "sayma"yı çalıştırın.
    3. İsteğe bağlı olarak, tek bir denemeden birden çok sıralama şeridi toplamak için "aggr" çalıştırın.
    4. Verileri, küme hücrelerini görselleştirmek, farklı ifade edilmiş genleri tanımlamak ve tSNE veya gen ekspresyonu ısı haritası çizimlerini oluşturmak için "hücre tarayıcısı" (Bkz. Malzemeler Tablosu'nabakın).
    5. İsteğe bağlı olarak, verileri normalleştirmek ve ölçeklendirmek, farklı olarak ifade edilen genleri tanımlamak ve tSNE/UMAP çizimlerini ve gen ekspresyonu ısı haritalarını oluşturmak için bakımlı R tabanlı bir platform25 (Bkz. Malzeme Tablosu'nabakınız) kullanın (Şekil 3).
  2. Çoklu barkod veri analizi
    1. Lipid bazlı barkodlama stratejisinden elde edilen verilerin analizi
      1. Örnek barkod FASTQ dosyalarını örnek barkod UMI sayım matrisine dönüştürmek için ticari olarak kullanılabilen veri analizi ardışık ardışık ardışık ardışık veya deMULTIplex R paketini(https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq)kullanın.
      2. Barkod UMI sayım matrisini endojen transkripsiyon verileriyle birlikte entegrasyon analizi için R tabanlı bir platforma yükleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)(Şekil 3).
    2. Antikor bazlı barkodlama stratejisinden elde edilen verilerin analizi
      1. Kitaplık CSV dosyasını ve hashtag özelliği referans CSV dosyasını sağlayarak barkodları eşlemek için ticari olarak kullanılabilen veri analizi ardışık boru hattından "count" kullanın.
      2. Her hücre barkodiçin özellik barkod sayıları yla birlikte gen ifade sayılarını içeren çıktı birleşik özellik-barkod matrisini, akış aşağı analizi için R tabanlı bir platforma yükleyin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, bir organın ayrı bölgelerinden farklı örnekleri aynı anda işlemek için çok katlı tek hücreli mRNA sıralamasının nasıl yapıldığını sergilemek için fare embriyonik kalbi örnek olarak kullandık. E18.5 CD1 fare kalpleri izole edildi ve sol atriyum (LA), sağ atriyum (RA), sol ventrikül (LV) ve sağ ventrikül (RV) içine kesildi. Atriyal ve ventriküler hücreler daha sonra lipit bazlı barkodlama prosedürü kullanılarak bağımsız olarak barkodland...

Tartışmalar

Bu çalışmada, tek hücreli transkripsiyonel profilleri analiz etmek için bir protokol gösterdik. Ayrıca scRNA-Seq iş akışında multipleks örneklerine iki isteğe bağlı yöntem sunduk. Her iki yöntem çeşitli laboratuvarlarda uygulanabilir olduğunu kanıtlamıştır ve maliyet-etkin ve toplu etkisiz tek hücreli deney18çalıştırmak için çözümler sağladı,26.

Protokolden geçerken dikkatle uyulması gereken birkaç...

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Teşekkürler

Dr. Zev J. Gartner laboratuvarından David M. Patterson ve Christopher S. McGinnis'e lipid bazlı barkodlama reaktifleri ve deneysel adımlar ve veri analizi önerileri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (HL13347202) tarafından kurulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10% Tween-20Bio-Rad1610781
10x Chip Holder10x Genomics120252 330019
10x Chromium Controller10x Genomics120223
10x Magnetic Separator10x Genomics120250 230003
10x Vortex Adapter10x Genomics330002, 120251
10x Vortex Clip10x Genomics120253 230002
4200 TapeStation SystemAgilentG2991AA
Agilent High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
Barcode OligoIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA25 nmol
Buffer EBQiagen19086
CD1 miceChales RiverStrain Code 022ordered pregnant mice
Centrifuge 5424RAppendorf2231000214
Chromium Chip B Single Cell Kit, 48 rxns10x Genomics1000073Store at ambient temperature
Chromium i7 Multiplex Kit, 96 rxns10x Genomics120262Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' GEM Kit v3,4 rxns10x Genomics1000094Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' Library Kit v310x Genomics1000095Store at -20 °C
Chromium Single Cell 3' v3 Gel Beads10x Genomics2000059Store at -80 °C
Collagenase ASigma/Millipore10103578001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
Collagenase BSigma/Millipore11088807001Store powder at 4 °C, store at -20 °C after it dissolves
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582University of Pittsburgh Health Sciences Sequencing Core
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 1.5 mLEppendorf022431021
DNA LoBind Tube Microcentrifuge Tube, 2.0 mLEppendorf022431048
Dynabeads MyOne SILANE10x Genomics2000048Store at 4 °C, used in Beads Cleanup Mix (Table 1)
DynaMag-2 MagnetTheromo Scientific12321D
Ethanol, Pure (200 Proof, anhydrous)SigmaE7023-500mL
Falcon 15mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-70C
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge TubeCorning Cellgro14-959-49A
Fetal Bovine Serum, qualified, United StatesFisher Scientific26140079Store at -20 °C
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 10-100μlTheromo Scientific4661020N
Finnpipette F1 Multichannel Pipettes, 1-10μlTheromo Scientific4661000N
Flowmi Cell StrainerSigmaBAH136800040Porosity 40 μm, for 1000 uL Pipette Tips, pack of 50 each
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)Ricca Chemical Company3290-32
HBSS, no calcium, no magnesiumThermo Fisher Scientific14170112
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution)BioLegend422301Add 5 µl of Human TruStain FcX per million cells in 100 µl staining volume
Isopropanol (IPA)Fisher ScientificA464-4
Kapa HiFi HotStart ReadyMix (2X)Fisher ScientificNC0295239Store at -20 °C, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Lipid Barcode Primer (Multi-seq Primer)Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)Thermo Fisher Scientific12090-015
MasterCycler ProEppendorf950W
Nuclease-Free Water (Ambion)Thermo Fisher ScientificAM9937
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube stripsEppendorf951010022
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1X without calcium & magnesiumCorning Cellgro21-040-CV
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin (alternative to Thermo Fisher product)Sigma-AldrichSRE0036
Pipet 4-pack (0.1–2.5μL, 0.5-10μL, 10–100μL, 100–1,000μL variable-volume pipettesFisher Scientific05-403-151
Selection reagent (SPRIselect Reagent Kit)Beckman CoulterB23318 (60ml)
Template Switch Oligo10x Genomics3000228Store at -20 °C, used in Master Mix (Table 1)
The antibody based barcoding strategy is also known as Cell Hashing
The cell browser is Loup Cell Browser10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/what-is-loupe-cell-browser
The commercial available analysis pipline in step 8.1 is Cell Ranger10x Genomicshttps://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/what-is-cell-ranger
The lipid based barcoding strategy is also known as MULTI-seq
The well maintained R platform is Seurat V3satijalabhttps://satijalab.org/seurat/
TipOne RPT 0.1-10/20 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-3710
TipOne RPT 1000 ul XL ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1182-1730
TipOne RPT 200 ul ultra low retention filter pipet tipUSA Scientific1180-8710
TotalSeq-A0301 anti-mouse Hashtag 1 AntibodyBioLegend1558010.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 2 AntibodyBioLegend1558030.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TotalSeq-A0302 anti-mouse Hashtag 3 AntibodyBioLegend1558050.1 - 1.0 µg of antibody in 100 µl of staining buffer for every 1 million cells
TrueSeq RPI primerIntegrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol, used in Lipid-tagged barcode library mix (Table 1)
Trypan Blue Solution, 0.4%Fisher Scientific15250061
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redFisher Scientific25200-056
Universal I5Integrated DNA TechnologiesSingle-stranded DNA100 nmol

Referanslar

  1. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877 (2008).
  2. Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377 (2009).
  3. Li, G., Plonowska, K., Kuppusamy, R., Sturzu, A., Wu, S. M. Identification of cardiovascular lineage descendants at single-cell resolution. Development. 142 (5), 846-857 (2015).
  4. DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental Cell. 39 (4), 480-490 (2016).
  5. Li, G., et al. Single cell expression analysis reveals anatomical and cell cycle-dependent transcriptional shifts during heart development. Development. 146 (12), dev173476 (2019).
  6. Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 1, (2018).
  7. Liu, Z., et al. Single-cell transcriptomics reconstructs fate conversion from fibroblast to cardiomyocyte. Nature. 551 (7678), 100 (2017).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 1, (2018).
  9. The Tabula Muris Consortium. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
  10. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175 (2016).
  11. Grün, D., van Oudenaarden, A. Design and analysis of single-cell sequencing experiments. Cell. 163 (4), 799-810 (2015).
  12. Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  13. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17 (1), 77 (2016).
  14. Islam, S., et al. Characterization of the single-cell transcriptional landscape by highly multiplex RNA-seq. Genome Research. 21 (7), 1160-1167 (2011).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  17. . Library Prep -Single Cell Gene Expression -Official 10x Genomics Support Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/library-prep (2018)
  18. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 1, (2019).
  19. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
  20. Chan, M. M., et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).
  21. . Agilent 4200 TapeStation System Available from: https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/5991-6029EN.pdf (2019)
  22. . SPRIselect User Guide Available from: https://research.fhcrc.org/content/dam/stripe/hahn/methods/mol_biol/SPRIselect%20User%20Guide.pdf (2012)
  23. . Qubit 4 Fluorometer User Guide Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0017209_Qubit_4_Fluorometer_UG.pdf (2018)
  24. . Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/High%20Sensitivity_DNA_KG.pdf (2016)
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411 (2018).
  26. Weber, R. J., Liang, S. I., Selden, N. S., Desai, T. A., Gartner, Z. J. Efficient targeting of fatty-acid modified oligonucleotides to live cell membranes through stepwise assembly. Biomacromolecules. 15 (12), 4621-4626 (2014).
  27. . Single Cell Protocols Cell Preparation Guide Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep (2017)

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisiSay 155Tek h creli mRNA s ralamafare embriyonik dokukalp geli imimultipleks barkodude multiplexingveri analizi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır