Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחסום הדם-מוח האנושי באופן סלקטיבי מונע חדירה של מולקולות הידרופילית ופתוגנים לתוך המוח. מספר פתווגיות, כולל דלקת קרום המוח והזיות פוסט-אופרטיביות, קשורות לחדירות מוגברות של מחסום הדם-מוחי. כאן, אנו מתארים מודל של התרבות התא האנדותל כדי לבדוק את חדירות המכשול על ידי החציית מחיידקים.

Abstract

מחסום הדם-מוח האנושי (BBB) מאופיין בחדירות נמוכות מאוד לbiomolecules על מנת להגן ולווסת את חילוף החומרים של המוח. BBB הוא בעיקר מתוך תאים אנדותל מוטבע קולגן הרביעי ו fibronectin-המרתף עשיר ממברנות. מספר פתווגיות נובעות מתפקוד של BBB ואחריו לחציית מחיידקים, גרימת מחלות כגון דלקת קרום העין. כדי לבחון את ההשפעה של פרמטרים מרובים, כולל תרופות שונות והרדמה, על החדירות של BBB הקמנו מודל התרבות התא האנושי הרומן מחקה את BBB עם המוח האנושי מיקרוכלי דם אנדותל. התאים האנדותל הם גדלו על קולגן IV ו-fibronectin מצופה יחידות מסנן עד למפגש והוא יכול להיות מטופלים עם תרכובות שונות של ריבית. על מנת להדגים את השטח, החדר העליון עם המשטח הפנימי של תאי האנדותל מחוסן בפני חיידקים. לאחר תקופת דגירה, מצופה דגימות של החדר התחתון על לוחות אגר והמושבות המתקבלות נספרות, ובכך מספר המושבות מתאם את החדירות של BBB. ניתן לנתח את גורמי הסלולר האנדוגניים בהגדרה ניסיונית זו כדי להבהיר מנגנונים סלולאריים בסיסיים של תאי האנדותל התורמים ל-BBB. בנוסף, פלטפורמה זו מאפשרת ביצוע מסך עבור תרכובות שעלולות להשפיע על חדירות התאים האנדותל. לבסוף, ניתן לחקור ולקשר בין הפתווגיות שונות, כגון דלקת קרום העין. זה יכול להיות אפשרי להאריך את המודל ולנתח את המסלולים של החיידקים דרך BBB. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של השיטה המתוארת לחקור את החדירות של BBB.

Introduction

BBB האנושי הוא גבול ייחודי של רקמת המוח, המפריד את המוח מהדם. זה בהחלט מווסת את המעבר של מולקולות גדולות והידרופילית, חוסם הפרפוזיות, ושומר על הומאוסטזיס המוח. הוא גם מגן על המוח מפני תנודות פלזמה, רעלים, חיידקים, ומדריכים תאים דלקתיים כחלק ממערכת העצבים המרכזית (CN) חסינות. מאז גילויו לפני מאה שנה1, מחקרים רבים בוצעו כדי להבין את המבנה והתפקוד של bbb. האינטראקציות המורכבות של תאים, חלבונים ואותות מתוך ביקוש המוח והדם עדיין בחקירה ובמודלים נוספים.

Bbb האנושי מורכב משלושה סוגי תאים: תאי המוח מיקרוכלי דם אנדותל (bmecs), קרום הלב, ו אסטרוציטים2,3. ה-bmecs שונים מרוב תאי האנדותל בגוף בכך שהם בעלי מספר גבוה של צמתים הדוקים וצמתים מקומדים4, פעילות pinocytotic נמוכה2,5, וממברנה מרתף רציפה6,7 כדי לחסום דיפוזיה. מולקולות ליפופילית קטנות יכולות לפזר ולעבור את BBB בעקבות מעבר הריכוז שלהם; גדול יותר ומולקולות הידרופיאליות להיכנס או לעזוב את המוח רק באמצעות מקוטב הביע מערכות תעבורה סלקטיבית8. תקנה זו גורמת להתנגדות חשמלית גבוהה של טראנסנדותל (העגלון) של 1500-2000 Ω · ס מ2 שהוא בקורלציה הפיכה לחדירות9,10. למרות bmecs לבנות מכשול חזק, הם יכולים להגיב על אותות מקומיים והיקפיים11,12. יש אינטראקציה קרובה בין bmecs ו אסטרוציטים13; the אסטרוציט קצה הרגליים לבנות שכבה סביב כלי הדם ולגרום היווצרות של צמתים הדוקים13,14. הם מעורבים התבגרות bbb עם גורמים שונים, כולל שינוי מקדם צמיחה-β (tgf-β)15,16. בנוסף, ממלאים לקרום החזה תפקיד מרכזי בוויסות האנגיוגנזה17 ומניעת אפופטוזיס של האנדותל בבידול תאי18 (איור 1). הם משובצים בקרום המרתף ומספקים יציבות מבנית של קיר הספינה19.

figure-introduction-2188
איור 1: מבנה סכימטי של מכשול המוח בדם. המבנה הייחודי של BBB האנושי מורכב משלושה סוגי תאים שונים. לומן המיקרוכלי מוקף בתאי אנדותל, אשר מועשרים בצמתים הדוקים, ואינם מדורגים. , הם משובצים בקרום המרתף. כמו בקרום הלב תאים אלה חשובים עבור יציבות מבנית של הקיר כלי ולשחק תפקיד בפיתוח של BBB ליד האסטרוציטים. הרגליים הקצה שלהם לבנות שכבה קרובה סביב הכלי ולתמוך את הבניין של צמתים הדוקים. כל הרכיבים של BBB חשובים לפונקציונליות פיזיולוגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פתווגיות שונות רבות קשורות התמוטטות של BBB (למשל, ספיגה אנצפלופתיה). החולים המושפעים הגדילו את רמות החלבון בנוזל השדרה20, ואת המוח בתוך מכרסמים מושפעים מראה ספיגה מוגברת של תחמוצת הברזל המסומנים ברזל וחומצות אמינו21,22. תוצאות אלו מצביעות לקראת חדירות מוגברת של BBB המתרחשת לצד פינוציטוזה מוגברת ב-BMECs21 והפעלת אנדותל23. מחלה נוספת הקשורה ב-BBB משתנה היא דלקת קרום המוח, חירום רפואי ודלקת מורכבת המלווה בבצקת מוחית שיכולה להוביל למוות של תאים עצביים. אתר הכניסה העיקרי של חיידקים במחזור אמור להיות מיקרואוניות24; עם זאת, BBB מונע כניסת חיידקים. החדירות של BBB אינו מקושר תמיד לגידול בדלקת קרום העין המטסוגגניים25 והמנגנון יכול להיות רב עצרת. צירוף מקרים של אלח דם עם הזיות לאחר הניתוח (POD)26 ואת הקשר עם זיהומים טרום ניתוח27,28 מציין את הצורך במודל bbb המאפשר חשיפה ישירה חיידקים כדי לקבל הבנה טובה יותר בפתוגנזה חיידקית.

יש הרבה פערים בהבנת החיידקים וכביכמת העוברים דרך BBB. לכן, פיתחנו מודל המאפשר בדיקה נוחה של גורמים ותנאים שונים עם קשר ישיר בין חציית החיידקים והשפעות על החדירות של BBB. העבודה הקודמת התמקדה חדירות הפרתאי וכללה מדידה הטיר ו שטף מעקב. בנוסף, המקרומולקולה התחבורה נותחו על ידי מולקולות או נוגדנים מצובית, לפיה דגמים שונים המשתמשים רק בתאי האנדותל או בשילובים עם האסטרוציטים וקרום הלב פותחו. בשל הקושי בהשגת רקמה אנושית על בסיס קבוע, נעשה שימוש בדגמים רבים המבוססים על חיות. בתאי המוח מקור של שור ו חזירי טופס מוצא הדוק עם כייר גבוה שיוצרים היטב בצורת קוטביות apical-בסיס מתאימים לחקירות של מולקולה קטנה הובלה דרך bbb. החלבונים שונים ברצף מhomologues האנושיים שלהם29,30, ביצוע חקירה של נוגדנים טיפולית קשה. מסיבה זו, ייתכן שתהיה עדיפות למודלים של מורנה או של התרבות האנושית. עכבר או חולדות כמו מקורות לדוגמה יש את היתרון של להיות מושגת מינים מאופיין אך תשואה כמה תאים למטרות לימוד. זה יכול להיות מוקף על ידי שימוש של המוח עכבר מונצח אנדותל (סוף) קווי תא לכופף. 3, להתכופף .5 או cend31,32,33.

תאים מתורבתים ראשוניים מרקמת האדם קשים להשגה ולטיפול בקביעות. לכן, רוב הדגמים הסלולריים האנושיים המשמשים במחקר חקירת ה-BBB האנושי הם שורות תא מונצח. קו התא שפורסם הוא המוח האנושי מיקרוסקולרית קו התאים הכדורית/D3, אשר מתאים גם ללמוד ספיגת סמים והוא קל לטפל. התאים לבנות דופלקס ולבטא את החלבונים האופייניים הצומת הדוק של bbb34, ואילו רמת הביטוי של קלודין-5 מדווחת להיות נמוך יותר מאשר במיקרו מיקרואוניות35 ומובילים ספציפיים רבים זוהו ב תעתיק רמה36 כמו גם במחקרים פרוטאומית34. בעלי מנוע נמוך יחסית בטווח של 30-50 Ω · ס"מ2 הוא עדיין אתגר37. מקור נוסף לתאי המוח באנדותל הם תאי גזע בעלי עוצמה של האדם (hPSCs)38 ותאי גזע אנושיים בעלי השפעה של מחזורי מחולל שורש, ולינבטיים39,40. שני הפרוטוקולים של בידול התוצאה בתא הדוקה monolayers וערכי העגלון גבוה (g., 1,450 Ω · cm2 ב שיתוף תרבויות)38. אלה מודלים תא גזע דורשים טיפול קיצוני לטיפוח, עדיין מציעים את ההזדמנות ללמוד את ההשפעה של ויסות הורמונים41 או מחלות עם רקעים גנטיים42 על פיתוח bbb.

במחקר זה, הקמנו מוהקים המוח האנושי מיקרוכלי שורה של תא בשיטת מיקרו-דם, THBMEC43, כדי לחקות את bbb וללמוד חציית חיידקים. תאים נזרע על מסנן וגדלו ל 100% השטף במודל זה של תרבות התא. החיידק מחוסן בחלקו העליון של חדר התרבות של התא. אנו משתמשים ב- es, coli (E. coli) במחקר לדוגמה שלנו בגלל השכיחות הגבוהה של E. coli דלקת קרום השכל44. הוכח כי החדירות הנמוכות ביותר של תא מונאולייר מתרחשת בין יום 13 ליום 15 לאחר זריעת45. לכן, הטיפול במונאולייר של THBMEC מבוצע לאחר זמן זה וחיידקים מחוסנת לאחר מכן במדיום על פני השטח הרשמי של המונאולייר. לאחר זמן דגירה, חיידקים שהיו מסוגלים לחצות את המכשול הם כימות באמצעות ציפוי בינוני עם החיידקים על צלחות אגר וספירת המושבות. מספר גדל של מושבות התואם לחציית חיידקים גבוהה יותר דרך BBB. העגלון הוא על 70 Ω · ס"מ246. עם זאת, אין צורך למדוד את העגלון בשיטה המתוארת. למרות שזהו ערך מבוסס על החדירות של BBB, נראה שאין לו כל השפעה על החציית החיידקים באמצעות BBB. תאים לא מטופלות לשמש שליטה של האטימות במודל שלנו. זה הוכח בעבודה הקודמת כי התאים מסוגלים להגיב על ציטוקינים proinflammatory ו לבטא אופייניה47חלבונים הצומת הדוק. זה מאפשר הקרנה מורכבת ואימות של קבוצה גדולה יותר של מצעים טרנספורטר וקולטנים.

Protocol

1. הכנת מאגר וריאגנטים

  1. להכין מלוחים 10x פוספט מאגר (10x PBS) על ידי הוספת 80 g של נתרן כלוריד (הנאל), 2 גר' אשלגן כלוריד (KCl), 14.4 גרם של disodium-מימן-פוספט דימיים (Na2hpo4 · 2h2O) ו 2 גרם של אשלגן-disodium ימן פוספט (KH2PO4) ב 1 אל זכוכית בקבוקון 1 l של מזוקקים כפול H2O. אוטוקלב הפתרון 10x PBS ולדלל 100 mL של פתרון זה ב 900 מ ל של מים מזוקקים כפולים כדי לקבל 1x PBS.
    1. השתמש האוטוקלב לעקר פתרונות. שימו את הבקבוק זכוכית לתוך הסל, לסגור את המכסה ולעקר אותו 15 דקות ב 121 ° צ' ו 98.9 kPa.
      הערה: פרוטוקול זה משמש תמיד לפתרונות אוטוקלינג בשלבים נוספים.
  2. הכן 10 μg/mL קולגן IV ו 10 μg/mL fibronectin פתרון על-ידי דילול 0.5 mg/mL fibronectin פתרון ו 0.3 mg/mL קולגן הרביעי פתרון כל עם 1x PBS ל 100 mg/μL מיקרו צינורות בשנת 1.5 mL. לאחר מכן, לערבב 100 μL של שניהם ali, עם 1,800 μL של 1x PBS ב 2 מ"ל מיקרו צינורות ולאחסן אותם ב-20 ° c.
  3. הכנת DMEM דיום/F-12 בינוני על-ידי הוספת 4% סרום פרה עוברי ו 2 מ"מ L-גלוטמין ו 100 mg/L פניצילין/סטרפטומיצין למדיום ולאחסן אותו ב 4 ° c.
  4. הכינו את התמיסה 1x טריפסין-EDTA על-ידי דילול 5 מ ל של הפתרון המרוכז ב-10x של טריפסין-EDTA עם 45 mL של 1x PBS בצינור 50 mL ולאחסן אותו ב -4 ° c.
  5. להכין 500 mL של ליברות בינונית על ידי שקילה 10 גרם של בסיס מרק LB ב 500 מ ל זכוכית בקבוקון. הוסף 500 מ ל של מים מעוקר ולאחר החיטוי אותו.
  6. להכין LB אגר על ידי שקילה 10 גרם של בסיס ציר ליברות ו 7.5 גרם של אגר-אגר ב-500 mL זכוכית בקבוקון. הוסף 500 mL של מים מעוקר לפני autoclaving ללא לסגור את המכסה של הבקבוקון. אוטוקלב ולהשאיר את הפתרון להתקרר עד שהוא חם למגע.
  7. הכנת מדיום ללא אנטיביוטיקה על-ידי הוספת 4% סרום בפרה העוברי ו 2 מ"מ L-גלוטמין, אבל אין פניצילין/סטרפטומיצין אל DMEM/F-12 בינונית ולאחסן אותו ב 4 ° צ' כמו בשלב 1.3.

2. צמיחה של דם-מכשול המוח מחקה תאים

  1. כדי להרכיב את הצלחת 12 היטב, לשים את התרבות התאים מוסיף הבארות (איור 2א).
    1. לפרוק את הצלחת ואת כל הוספת בארון בטיחות ביולוגית ולבצע צעדים נוספים שם. השתמש מלקחיים מעוקר כדי לתפוס את ההכנסה בבסיס הרחב שלה כדי להזיז אותו.
  2. מעיל את הקרום הנקבובי של כל הוספה עם 90 μL של 10 μg/mL קולגן IV ו 10 μg/mL fibronectin תערובת. מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 24 h ב 37 ° צ' בחממה לתרבות התא (איור 2ב).
  3. לשטוף את מוסיף פעמיים על-ידי ליטוף 1 מ ל של 1x PBS לתוך כל הוספת ולשאוב את הפתרון עם משאבת ואקום לתרביות תאים.
  4. הקרום על ידי ליטוף 0.5 מ ל של מדיום/F-12 בינוני בחלק העליון ו 1.5 mL בחדר התחתון. מודקת את הצלחת 30 דקות ב 37 ° c בחממה תרבות התא עם 5% CO2 אווירה (איור 2ג).
  5. זרע 2 x 105 האדם מיקרוכלי דם בתאי-הדם לתוך כל תא עליון ומודקת את הצלחת 12 היטב ב 37 ° c בחממה תרבות התא (איור 2ד).
    1. לשאוב את המדיום מתוך הבקבוקון תרבות התאים באמצעות משאבת ואקום לתרביות תאים ולשטוף את המונאולייר על ידי ליטוף 10 מ ל של 1x PBS ו לשאוב את הפתרון לאחר מכן עם משאבת ואקום.
    2. כסו את התאים לחלוטין בעזרת טריפסין מרוכז של 1 x באמצעות ליטוף 5 מ ל של הפתרון לתוך הבקבוקון של תרבות התא. מודיית את הבקבוקון עבור 3-5 דקות ב 37 ° c בחממה לתרבות התא.
      הערה: אם התאים אינם מאוודעים, לחץ בחוזקה על הבקבוקון כנגד כף היד כדי להוציא את התאים.
    3. לקחת 5 מ ל עם פיפטה כמו סדרת מחלקים מן ההשעיה התא בצינור 15 ml ולהוסיף 5 מ ל של fcs המכיל בינונית כדי לעצור את התגובה אנזימטית.
    4. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 3 דקות ב 210 x g, להסיר את supernatant עם משאבת ואקום, ולהשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ ל בינונית עם פיפטה.
    5. השתמש מונה התא על ידי ערבוב 10 μL של השעיית התא עם 10 μL של 0.4% טריפי כתם כחול בשפופרת מיקרו 1.5 mL. הוסף 10 μL של התערובת לתוך שקופית קאמרית ספירה, לשים אותו לתוך הדלפק התא, ולהתחיל ספירה.
      1. התמקד במונה על התאים כך שהקצה שלהם הוא כחול כהה והלבן האמצעי. לאחר מכן, הפעל את התוכנית המתאימה לספירת תאים.
    6. כדי לחשב את אמצעי האחסון לכל הוספה, חלק את התאים המתקבלים 2 x 105 להוספה עם הריכוז המחושב של השעיית התא.

3. טיפוח המודל המוחי-דם

  1. מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 14 ימים ב 37 ° c.
  2. שינוי 0.5 mL של בינונית עבור החדר העליון ו 1.5 mL של בינוני עבור התחתון כל 2-3 ימים. לחמם את המדיום לפני לשים אותו בבקבוקון התא. מנושף עם משאבת ואקום (איור 2E).
    הערה: לעבוד בזהירות כדי להימנע מלגעת בקרום.
  3. בדוק את מצב התאים על ידי הדמיה שלהם עם מיקרוסקופ ולקבוע את השטף. ודא כי השטף הוא 100% לאחר 14 ימים.

4. הכנת חיידקים

  1. יום לפני מדידה, לשים מושבה של E. coli זן GM2163 לתוך מדיום LB. מודאת שפופרת התרבות במשך 24 שעות ב 37 ° צ' עם 180 סל"ד ב דגירה שייקר (איור 2F).
    1. לטפח את החיידק E. coli על צלחת ליברות אגר ב 4 ° c. קח מושבה אחת עם בוחר עקר לשים את הבחור בצינור התרבות המוכן עם 3 מ ל של LB בינונית.
    2. הכינו צלחת LB אגר עבור כל הוספה עם פתרון LB אגר חם ולמלא את מנות פטרי למחצית נפח הכולל שלהם. תן להם להפוך למוצק ולאחסן אותם ב -4 ° c.

5. טיפול בתאים

  1. ביום 14 לאחר זריעה, לטפל בתאים עם תרכובות או למדוד את ההתנגדות החשמלית transendoal (העגלון), אם מתוכננת (איור 2G).
    הערה: תמיד יש תאים לא מטופלות כפקד.
    1. כדי לטפל בתאים עם מתחם הריבית, דלל את התרכובת לריכוז הסופי במדיום DMEM/F-12. הוסיפו 0.5 מ ל של תערובת זו לתוך החדר העליון ו 1.5 mL לתוך התא התחתון. מודקת את הצלחת בחממה לתרבות התא לזמן הרצוי.
  2. לאחר מכן, להחליף את המדיום השלם עם מדיום ללא אנטיביוטיקה על ידי מלטף עם משאבת ואקום וליטוף (איור 2H).

6. מדידה של פרמאביליות

  1. כדי לקבל ריכוזים קבועים של חיידקים, למדוד את הצפיפות האופטית עם פומטר באורך הגל של 600 ננומטר. לדלל את הפתרון לילה של חיידקים עם LB בינונית בצינור 50 mL הבז ל OD600 של 0.5 ± 0.05. . לעבוד על קרח
    1. מילוי 1 mL של בינוני LB לתוך קובט. התחילו את הפומטר והניחו את הקובט פנימה, מסומנים לצד קדימה. לחצו על "Blank" התחתון למדידת הערך הריק לאחר מכן.
    2. למדוד את הצפיפות של הפתרון החיידקי על ידי מילוי אותו קובט, לשים אותו, ולחיצה על המדגם התחתון. חזור על המדידה במהלך הדילול עד לקבלת הריכוז הסופי.
  2. עבודה בקבינט בטיחות ביולוגית שבו חיידקים יכולים להיות מטופלים עם מוכן 12 צלחת הבאר ופתרון חיידקי ב-OD600 = 0.5. הוסף 450 μL של פתרון חיידקי רק לתוך כל תא עליון המכיל 0.5 mL של בינונית (איור 2I).
  3. מודקת את הצלחת 12 היטב עבור 6 h ב 37 ° c בחממה.
    הערה: הפרוטוקול מכתיב לעצור כאן.
  4. לדוגמה 50 μL של המדיום עם פיפטה מכל תא תחתון על-ידי הסרת התותב עם מלקחיים (איור 2J). יש לדאוג שלא לשפוך את המדיום מהחדרים העליונים אל החלק התחתון.
  5. לוחית כל דוגמה על הצלחת אגר נפרד (איור 2K). שחרר את המדגם על הצלחת לרצף את הפתרון עם שליטת התא.
  6. מודאת צלחות אגר עבור 24 h ב 37 ° c בחממה.
  7. לספור את המושבות בכל צלחת (איור 2ל).

7. ניתוח נתונים

  1. כתוב את הנתונים בטבלה וחשב את סטיית הממוצע והתקן של המושבות הצפות של תאים מטופלים ובעלי מטופל.
  2. הצגת הממוצע כמספר המוחלט של המושבות.
    1. כדי לנרמל את התוצאות, חשב את המספר היחסי של מושבות על-ידי חלוקת כל התוצאות עם ערך הפקד.

figure-protocol-7680
איור 2: מצגת מפורטת של השלבים הבודדים בפרוטוקול. (א) לשים את מוסיף עם מלקחיים מעוקר לתוך 12 צלחת הבאר. (ב) מעיל כל הוספה עם 90 μl של fibronectin ו קולגן הרביעי תערובת ו מודלת עבור 24 שעות. (ג) הקרום הממברנות עם מדיום מחומם עבור 30 דקות (ד) זרעי 2 x 105 המוח האנושי מיקרוכלי דם מיקרו-נימי להכניס. (ה) לטפח את הצלחת למשך הזמן המתאים. (ו) יום אחד לפני המדידה, לשים E. coli המושבה לתוך שפופרת התרבות בינונית LB ו דגירה עבור 24 h. (G) לטפל בתאים או למדוד העגלון. (ח) Exchange בינוני מלא עם מדיום ללא אנטיביוטיקה. (I) להוסיף 450 μl של פתרון בקטריאלי (OD600 = 0.5) לתוך כל תא עליון ו-דגירה עבור 6 h. (J) לדוגמה 50 μl של בינוני מכל תא תחתון הסרת הוספת מלקחיים. (K) הצלחת המדגם על צלחות אגר ו הדגירה עבור 24 h. (L) לספור את המושבות ולנתח את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

   

תוצאות

בעקבות הפרוטוקול, התאים הופרה, ומודל BBB נבנה. ביום 14 לאחר זריעה, התאים טופלו glyoxal כמו אלדהיד תגובתי. מטרת הניסוי הייתה לחקור את הקורלציה בין גיל וסוכרת ב POD27 ואת השכיחות הגבוהה של דלקת קרום השכל בחולים קשישים48. הרמות הגבוהות של מוצרים מתקדמים לסיום הגליקטיון (גילאי) בגיל וסוכרת49 דורשים בדיקה נוספת של השפעת גליקטיון בפתוגנזה של חציית חיידקים דרך bbb. גליקטיון היא תגובה לא-אנזימטית של קבוצות אמינו חופשיות בחלבונים עם שימוש בקבוצות קרבונקסיל, הפחתת פחמימות או תרכובות קרבונקסיל אחרות. גלוקוז ידוע היטב כתורם לקבוצות קרבונקסיל; עם זאת, יש יותר תגובתי מוכרות. לאחר בניית בסיס של שיף לא יציב, הם מסדרים מחדש לתרכובות דיקרבקסיל יציבות ותגובתי יותר כמו glyoxal. הגילאים, המוצרים הסופיים, יכול לגרום לקרוס קישורים בין חלבונים50. הם יכולים לפגוע במבנים סלולריים ולשנות את הפונקציה התאית על ידי אינטראקציה עם קולטן של גילאי (זעם)51.

תאים טופלו עם 0.05 ו 0.15 mM glyoxal (GO) פתרון עבור 1 h, תאים לא מטופלים שימשו כפקד. גליקטיון זוהה באמצעות מאבחן חיסוני וזיהוי עם נוגדן נגד גיל (איור 3). המושבות החיידקית המתקבלות נספרו והוצגו כמספר המוחלט של מושבות (איור 4א) או מספר המושבות היחסי הנורמלי לשליטה (איור 4ב'). המדיום נלקח מבארות עם תאים לא מטופל יצרו מושבות מעטים מאוד. תוצאה זו הוכיחה כי תאים לא מטופל הצליחו לבנות מכשול והוא יכול לשמש כפקד. דגימות שטופלו glyoxal הציג מספר גדל של מושבות, המוביל למסקנה כי יש השפעה של glyoxal על THBMECs ואת צפיפות המכשול הסלולר, כי מספר המושבות הפגינו הבדל משמעותי בין תאים לא מטופלים וטופלו. המעבר חיידקי מוגבר של המכשול לאחר הטיפול עם glyoxal יכול להסביר מדוע סוכרת מתואם מחלות עם התמוטטות BBB.

figure-results-1957
איור 3: זיהוי גליקטיון חלבונים באמצעות החיסונית. THBMECs טופלו עם GO בריכוזים שונים עבור 1 h. חלבון סה כ היה מבודד והופרד באמצעות SDS-PAGE. גליקטיון של החלבונים זוהה באמצעות חיסוני האנטי-אייג '-הנוגדן (CML-26). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בסביבה אחרת, החלבון של THBMECs נגרם על ידי גלוקוז. גלוקוז מעוקר נוספה כדי Dמאמ/F-12 בינונית כדי להגביר את ריכוז הגלוקוז ממדיום גלוקוז רגיל (NG) עם 17.5 מ"מ בינוני גלוקוז גבוה (HG) עם 42.5 mM. THBMECs היו מעובדים בשני מבחנות שונות של תרבות התא: אחד ב גלוקוז רגיל (NG) בינונית והשני במדיום גבוהה (HG). שני מדיה שונים אלה שימשו גם לצמיחה של BBB על מסננים ב 12 צלחות היטב. תאים שטיפחו במדיום NG שימשו כבקרת. המושבות המתקבלות מיוצגות כמספר מוחלט של מושבות (איור 4ג) או המספר היחסי של המושבות הנורמלות לשליטה (איור 4ד). התוצאות מצביעות על השפעה משמעותית על החציית החיידקים באמצעות BBB האנושי, המוביל למסקנה כי ההשפעה של NG נגד HG לא היתה חמורה מספיק כדי להשפיע על שלמות של BBB. התרחישים השונים תוכננו כדי להוכיח את המודל ואת שלמות התאים מחקה את BBB.

figure-results-3375
איור 4: מספר מוחלט ויחסי של מושבות חיידקיים שנספרו במודל BBB עם THBMECs. THBMECs טופלו עם 0.15 mM GO עבור 1 h, תאים לא מטופלים שימשו כפקד. סך של 450 μL של E. coli ההשעיה (OD600 = 0.5) התווסף כל תא עליון. בינוני מן התאים הנמוכים היה מצופה על צלחות אגר לאחר 6 ה. (א) הגרף מראה את הממוצע ממוצע +/-SEM של המושבות נספר. (ב) הגרף מציג את המושבות הנספרות הנורמלות לתאים שאינם מטופלות כפקד +/-SEM (n = 4). ב (ג) ו-(ד), thbmecs היו מעובדים בינוני וכספית. סך של 450 μL של E. coli ההשעיה (OD600 = 0.5) התווסף כל תא עליון. בינוני מהתא התחתון היה מצופה על צלחות אגר לאחר 6 h. (ג) הגרף מראה את הממוצע הממוצעים +/-SEM של מושבות שנספרו. (ד) הגרף מציג את המושבות הנספרות הנורמלות לתאים שאינם מטופלות כפקד +/-SEM (n = 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

תובנה מוגבלת לתוך הפתוגנזה של לחציית חיידקים מגביל התפתחות נוספת של טיפולים POD או דלקת קרום הריאה. התמותה והתחלואה של מחלות אלו דורשות טיפול טוב יותר במטופלים, מחייבים מחקר על המנגנונים הבסיסיים, וזקוקים לפלטפורמה איתנה להקרנה מורכבת. ניתן ללמוד את האירועים רב-עצרת עם BMECs של האדם. מספר נוהלי בידוד מוצלחים של bmecs ממספר מינים הראו אובדן של מאפייני התאים חתימה מולקולרית52,53. THBMECs המתוארים בהליך זה היו מזוהמים בפסקאות מוקדמות מאוד, שם הם הציגו מאפיינים ספציפיים של תא במוח העצם ושמרו אותם43. זה חשוב, כי לא כל השלבים במסלולים המושפעים התגלו עד כה, ומודל זה נראה לחקות BMECs קונבנציונלי. המודל המוצג שלנו מראה השפעות ישירות על מסכת ה-BMECs והעברת החיידקים דרך BBB.

הטיפול בתאי THBMEC הוא פשוט, והציוד הטכני הנדרש קיים ברוב מעבדות מדעי החיים. המודל שלנו מאפשר התחלה מיידית של הליכי חקירה לאחר THBMECs בנו מונאולייר הדוק. שדה היישומים יכול להיות נרחב בגלל השילובים האפשריים בין בדיקות חדשות ומוסר קונבנציונאלי כגון מדידה העגלון או תיוג עםמ54. ניתן גם להוסיף האסטרוציטים או קרום הלב כדי ליצור מודל שיתוף או תרבות משולשת. השפעת התרופות על הבקטריה יכולה להיבדק גם במודל שלנו על-ידי טיפול ב-THBMECs עם תרכובות לפני התייחסות לחדר העליון עם חיידקים. למעשה, ניתן לרכוש מוסיף עם מסננים עבור 96 היטב צלחות המאפשרות אוטומציה של ההליך. זה יכול להקל על יישום של מערכות סינון סמים בתפוקה גבוהה כדי להאיץ את גילוי הסמים נגד המחלות המוזכרות ולהפחית תופעות לוואי על BBB במהלך פיתוח התרופה.

שלב קריטי בשיטה המוצגת הוא זמן הדגירה לאחר הוספת החיידקים לחדר העליון. חשוב להשתמש בשעות כצירי זמן בפרוטוקול, מכיוון שזמן הדור של E. coli הוא רק 20 דקות55. אחרת, השימוש בנקודות זמן שונות עלול להוביל לתוצאות מטעה. יש גם סיכון אפשרי של זיהום בין התא העליון והתחתון במהלך החשיפה חיידקי אם הצלחות לא מטופלים עם טיפול. כל שינוי לצלחת 12 הבאר בשלב זה יכול לזהם את המדיום בתא התחתון.

E. coli הוא אחד ידוע, הגורם הנפוץ מאוד של דלקת הקרום החיידק. חקירות נוספות צריך לבדוק חיידקים שונים הקשורים גם דלקת קרום הריאה, כגון מנינגקוקוס56 או סטרפטוקוקס דלקת ריאותה57. אלה נראים להשתמש מנגנונים שונים כדי לחצות את BBB וצריך להיות הבינו טוב יותר לטיפול בחולים. בחולים קשישים, השכיחות של POD מגביר את26 , כמו גם את מספר המתרחש בתחלואה. ידוע כי קיימים אינטראקציות בין מחלות שונות, במיוחד כאלה מערכתית כמו סוכרת. במודל שלנו, ניתן לדמות תנאים אלה או לטפל בתאים לפני הוספת החיידקים.

המודל מוגבל על ידי מגע ישיר של THBMECs וחיידקים, ומחקר נוסף הכרחי כדי לחקור מנגנונים פוטנציאליים של מגע כדי לזהות את מסלולים מעורבים וחלבונים. עם זאת, ניתן להסיר מוסיף ולקצור את התאים לניתוח נוסף. העגלון של המודל הוא נמוך יותר לעומת מודלים תא גזע38,39,40. אנו מאשרים זאת באמצעות ריכוז חיידקי כי לא חצה את BBB בתאים לא מטופל אחרי 6 h.

לסיכום, שיטה זו מייצגת פלטפורמה חזקה לניתוח החציית החיידקים באמצעות BBB עם הפוטנציאל להרחיב אותה לצורך הקרנת תרופות בתפוקה גבוהה.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים מכירים ד ר מרים חוסיין על העבודה הקודמת על שיטה זו, קבוצת המשטרה ד ר קרסטין דאנקר (Charité-אוניברסיטת מדימדיצין, ברלין) לספק את THBMECs ו Juliane וובר על קריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר זה היה נתמך על ידי RTK 2155 (מקדם-העבודה).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agar - AgarCarl Roth6494.3BioScience-Grade
AutoclaveSystecVX-150
Bacteria E.coli strain GM2163Fermentas Life Sciences, Lithuania
PhotometerEppendorf6131
Cells THBMECGroup of M. F. Stins
Cell culture flasksGreiner Bio-One658175
Centrifuge Universal 320Hettrichlab1401
Collagen IVSIGMA AldrichC6745from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%InvitrogenC10311
Culture tubesGreiner Bio-One191180
CuvettesBRAND759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrateMERCK1065800500
DMEM/F-12GIBCO/ Thermo Sc.11330032HEPES
Falcon tubes 15 mlGreiner Bio-One188271
Falcon tubes 50 mlGreiner Bio-One227261
Fetal Bovine SerumGIBCO/ Thermo Sc.10270value FBS -Brazil
FibronectinSIGMA AldrichF0556solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 IncubatorHeraeus50116047
Incubator shaker I 26 New BrunswickEppendorfM1324-0000
Inoculation loopDr. Ilona Schubert - Laborfachhandel641000
LB Broth BaseGIBCO/ Thermo Sc.12780029
L-GlutamineGIBCO/ Thermo Sc.25030-081
Microbial incubator B 6200Heraeus51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class IIBIOAIR12469
Microscope inverseZeissTELAVAL 31
Micro tubes 2 mlSarstedt72,695,400
Micro tubes 1,5 mlSarstedt72,706,400
Penicillin / StreptomycinGIBCO/ Thermo Sc.15140122
Petri dishDr. Ilona Schubert - Laborfachhandel464-800
Potassium chlorideRothHN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphateRothP018.2
Sodium chlorideRoth9265.2
ThinCerts + Multiwell PlatesGreiner Bio-One66563112 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTAGIBCO/ Thermo Sc.15400054
Vacuumpump LaboportKNFN 86 KT.18

References

  1. Goldmann, E. E. . Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. , (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58 (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30 (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131 (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202 (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12 (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279 (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52 (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16 (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277 (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9 (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127 (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy?. The American Journal of Surgery. 141 (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4 (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90 (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145 (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17 (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112 (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59 (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10 (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10 (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9 (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9 (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30 (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30 (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. . The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. , (2015).
  46. Weber, V. . The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. , (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33 (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54 (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407 (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207 (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46 (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8 (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285 (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176 (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8 (7), e68408 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved