צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

Abstract

לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.

Introduction

הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.

האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מקרנית של התורם. שתלי אנדותל רבים מכילים גם שכבה דקה של רקמת סטרומה כדי לסייע לטיפול המצורף הקרנית המארחת¹.

ברחבי העולם, הביקוש של רקמת תורם הקרנית לניתוחי השתלה גדול יותר מהכמות שניתן לספק על ידי בנקים עין². יש אפוא כונן לפתח השתלות רקמה הנדסה אנדותל שיכול לשמש כדי להקל על הגרעון הזה³. הרציונל של זה מבוסס על העובדה כיום, אנדותל מן הקרנית הפרט יכול להיות רק מועבר לחולה יחיד, עם זאת, אם התאים האנדותל הקרנית התרחבו הראשון וגדל על ביוקפלי החומר בתרבית רקמות, הם יכולים לשמש לטיפול בחולים מרובים.

האתגרים העיקריים כי צריך להיות ממוען לפני השתלת רקמות מהונדסים הקרנית אנדותל להפוך אופציה אפשרית עבור מנתחים כוללים: (1) הקמת טכניקות להרחבת תאים אנדותל הקרנית באיכות גבוהה להפקת בוגרת ו הקרנית פונקציונלי שכבות תא אנדותל מבחנה, ו (2) הקמת טכניקות לגידול התאים על מקפלים ביוטומטל לייצר שתלי רקמות מהונדסים כי הם שווים, או טוב יותר, שתלי קרנית נגזר התורם המשמשים כיום.

תאים הקרנית אנדותל יש פוטנציאל מתרבים נמוך מאוד vivo אבל יכול להיות מגורה כדי לחלק בתוך מבחנה⁴. למרות זאת, יש להם נטייה חזקה לעבור במעבר האפיתל-אל-מסנצ'יאל (חובש), המפחית את יכולתם ליצור שכבת אנדותל בוגרת ופונקציונלית. הגורמים המוכרים לחובשים בתאי הקרנית של הקרניות כוללים חשיפה לגורמי גדילה מסויימים ואובדן של מגע תא-אל-תא⁵. זה כמעט בלתי נמנע כי הקרנית התרביות התאים האנדותל כי הם מנוכה אנזימטי במהלך תת-תרבות יעברו שינויים הקשורים פרמדיק. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבות התא עבור תאים אנושיים או כבשים הקרנית לתאי שנועד למזער את ההפרעה של הקשר תא אל התא במהלך בידוד, בשלבים הרחבה ותת-בית, כדי להפחית את הפוטנציאל של חובש. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד רקמות הנדסה שתלים הדומות לקרנית הנגזרת של ממברנה/שתלי רקמת העור/מסטרומה של הרקמה ניתן לייצר על ידי גידול שכבות התא מתורבת בשני הצדדים של קרום ביומטריה במכשיר מותאם אישית הרכבה.

Protocol

הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות.

1. הכנת כלי ניתוח

1. לחטא שני זוגות של מלקחיים מספר 4 השען על ידי לספוג אותם בפתרון של 70% אתנול עבור 5 דקות או על ידי אוטוקלינג אותם.

2. הכנת צלחות תרבות בינונית ורקמה

1. הכינו 100 mL של מדיום התרבות המכיל Opti-הזיכרון 1 (1x) + גלוטמקס-1, 5% סרום העובר העוברי ו 100 U/mL עט/דלקת. זה בינוני התרבות הוא מתאים לתרבויות הקרנית כבשים בתאי האנדותל, עם זאת, עבור תרבויות תא הקרנית האדם המדיום צריך להיות שיושלם עם 50 μg/mL בלוטת יותרת הבלוטת הפרה, 0.08% כונדרויטין סולפט, 200 μg/mL סידן כלוריד ו 0.3 מ"מ חומצה אסקורבית 2-פוספט. ניתן לאחסן את בינוני התרבות בחשכה ב-4 ° c לשבועיים.
2. לחלוק את הבארות של לוחית 6-היטב התרבות רקמה עם קובץ מצורף פקטור באמצעות הוראות היצרן ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של התרבות הבינונית כל באר מצופה. . הכינו באר אחת לקרנית

3. לחקור ניתוח והליכי התרבות של התא

1. מניחים את הקרנית, מעלה האנדותל, לתוך צלחת פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ מבתר. התאימו את התאורה כך שמשטח הקרניות יהיה מואר היטב בניגוד מספיק כדי להדגיש את שכבת האנדותל. התאימו את הזום כך שהקצה ומספר הקרניות המרכזיות יהיו בתצוגה.
2. השתמש מלקחיים השען מעוקר כדי להרים בעדינות ולקרוע את הקרום של הורד הרחק מן הסטרומה הבסיסית (איור 1). הקרום יהיה להתנתק מסטרומה כמו רצועה כי מיד התלתלים. מניחים את הרצועה לתוך באר אחת של לוחית התרבות של 6-היטב עם רקמה שהיתה מצופה בפקטור מצורף ומכילה 1 מ ל של תרבות בינונית. את המכסה של צלחת התרבות רקמה יש לשמור על כל הזמן, למעט כאשר explants מתווספים אליו, כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
3. הסירו רצועות מקרום הממברנה מהפריפריה הקיצונית של האנדותל קודם ולאחר מכן מאזורים מרכזיים מאוחר יותר. מניחים את כל הרצועות מקרנית אחת לבאר אחת בתוך צלחת 6-הבאר.
4. מודלת את האקסוצמחים בחממה תרבותית מחולל לחות הגדר ב 5% CO₂ ו 37 ° c. להשאיר את התרבות ללא הפרעה במשך יומיים כדי לאפשר explants להתיישב ולצרף למשטח הצלחת. בדרך כלל, עד שליש מהשתילים. לא מצליחים להתחבר ללוחית
5. הסר את המדיום ואת כל ההרחבות מחובר מהתרבות לאחר 4 ימים בעדינות להוסיף 2 מ ל של התרבות הטרייה בינונית לוקח טיפול לא להפריע explants מצורפים. יש לשנות את התרבות בינונית פעמיים בשבוע.

4. הפקה רציפה של תאי הקרנית על ידי תרבות ההסבר הטורית

הערה: ניתן להעביר את האקכורים ללוחות של תרבית רקמות טריות לאחר 10 ימים להקמת תרביות תאים נוספות של הקרנית.

1. מניחים את תרבות ההסבר על הבמה של מיקרוסקופ מבתר ומתאימים את התאורה והזום כך שניתן לראות את האקסוצמחים.
2. באמצעות מלקחיים שען מעוקר, לקטוף בעדינות כל לחקור את לוחית התרבות שלה ולהעביר אותו היטב טרי של צלחת התרבות 6-גם רקמה כי כבר מצופה עם מקדם קובץ מצורף ומכיל 1 mL של מדיום התרבות.
3. אפשר explants להתיישב על פני השטח של הצלחת החדשה שלהם במשך 4 ימים לפני החלפת מדיום התרבות עם 2 מ ל של מדיום תרבות טרייה. שנה את בינונית התרבות השתנתה פעמיים בשבוע.

5. הגדלת תאים אנדותל הקרנית על שמיכות זכוכית עבור ניתוח מאימונוללואונציה

הערה: תרביות תאים שנועדו להיות מנותח באמצעות immunofluorescence יש להקים על שמיכות זכוכית שניתן לרכוב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בעקבות הליך הצביעת.

1. לחטא חפיסה של שמיכות זכוכית עגולות של קוטר 13 מ"מ ב החיטוי או על ידי הטבילה ב 70% אתנול עבור 15 דקות ואחריו שלושה טיפות מלוחים באגירה פוספט (PBS).
2. המקום שמיכות בודדות לתוך הבארות של לוח 24-היטב של תרבות הרקמה, לחלוק אותם עם מקדם קובץ מצורף, ולאחר מכן להוסיף 0.5 mL של התרבות בינונית לכל טוב.
3. באמצעות מלקחיים שען מעוקר להסיר explants מלוחות התרבות שלהם רקמה ולהעביר אותם בארות המכילות coverslips. אפשר explants להתיישב על הכיסויים 4 ימים לפני שינוי המדיום.
4. לאחר תקופת הדגירה הנדרשת, לתקן ולהכתים את התרבויות שמיכות בתוך בארות התרבות שלהם. הר הוכתם שמיכות על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות לניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית.

6. תת-תרבות של תאי הקרנית באמצעות Dispase השני

הערה: תאים fibroblastic גדולים ניתן להסיר באופן סלקטיבי מתרבויות ההסבר ב 6-היטב צלחות לפני subculturing באמצעות הליך זה. אם כל התאים יהיו משניים, אל תבצע את השלבים 6.2 עד 6.4. מטרת הליך זה היא להעביר את התאים ללוחות טריים תוך שמירה על אנשי הקשר שלהם לתא-לתא ככל האפשר. התאים צריכים להיות מטופלים בעדינות. בארות שוטפת לחלוטין צריך להיות מיושן ביחס של 1:2, בעוד בארות subconfluent צריך להיות מיושן ביחס של 1:1 או פחות.

1. הסר את המדיום מן התרבות ולשטוף בקצרה עם DPBS.
2. הוסף 1 מ ל של Versene. . בטמפרטורת החדר במשך 30 ס מ
3. הסר את הversene והוסף 1 מ ל של טרילול. מודטה ב 37 ° c בחממה לתרבות רקמות במשך 3 דקות.
4. צפו בתרבות בעזרת מיקרוסקופ לעומת פאזה. הקש בעדינות על התרבות כדי להוציא תאים מהצלחת. ברגע שהתאים הfibroblastic הגדולים מנותקים מהצלחת להסיר אותם ואת הטרילה באמצעות הפיפטה 1 mL. שטוף טרילול שיורית את התאים הנותרים על ידי שטיפה פעמיים עם 2 מ ל של DPBS.
5. הוסף 1 מ ג של 1 מ"ג/mL Dispase II אל התרבות, הדגירה בחממה תרבות הרקמה עבור 1 עד 2 h או עד כל התאים התנתק מן הצלחת. התאים צריכים לרחף בהדרגה מן הצלחת במקבצים.
6. לאסוף את התאים באמצעות מנקז 1 mL ולהעביר 20 מ ל של DPBS בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
7. הסירו את הסופרנטאנט והשהה בעדינות את הגלולה הסלולרית בעזרת מפית מ-mL ב-1 מ ג של התרבות הבינונית. העבר את ההשעיה התא אל אחת או שתי בארות של צלחת 6-היטב, למעבר ביחס של או 1:1 או 1:2 בהתאמה.
8. למעלה את המדיום בכל באר לעשות 2 מ ל ולמקם את התרבויות לתוך החממה תרבות רקמות. החלף את המדיום עם 2 מ ל של מדיום טרי פעמיים בשבוע.

7. צמיחת שכבות של תאי הקרנית על גבי ממברנות

הערה: הפרוצדורה הבאה מתארת את השלבים המעורבים בהרכבה של חומר ביוקרומי במכשיר הרכבה מותאם אישית-הנקרא תא מיקרו-בוידן-לתרבות התא. נא^{לעיין בפרסום} האחרון שלנו לקבלת מידע נוסף על המכשיר ולרכישת פרטים.

1. הרכיבו את החדר העליון של חדר המיקרו-בוידן באמצעות הצבת טבעת אדומה למרכזו.
2. השתמש בטפין בקוטר 18 מ"מ כדי לחבוט בדיסק מתוך גיליון ביואטי על גבי קרש חיתוך פוליארביואתילן. מניחים את הדיסק מעל הטבעת האדומה בחדר העליון של החדר של מיקרו-בוידן.
3. , לעזאזל עם החדר התחתון לחדר העליון. ולאבטח את הדיסקית באמצע
4. להשרות את החדר התאספו micro-Boyden ב 70% אתנול עבור 1 h כדי לעקר אותו.
5. לטבול לחלוטין את החדר התאספו מיקרו-Boyden ב HBSS סטרילי עבור 10 דקות כדי להסיר את האתנול. חזור על שלב השטיפה פעמיים. בצע כביסה הסופי צעד עבור 10 דקות בינונית תרבות ללא תוספת.
6. להעביר את החדר מיקרו-Boyden מעוקר לתווך התרבות בבאר של 6-היטב צלחת להבטיח כי החדר העליון הוא כלפי מעבר. התאימו את רמת התווך התרבותי כך שהוא ייצור קשר עם המשטח התחתון של קרום הרפידה, אך לא יזרום לתוך התא העליון.
7. הכן השעיה של תאי הקרנית אנדותל באמצעות ההליך המתואר בסעיף 6. צפיפות תאים מספקת בהשעיה צריך להיות מושגת כדי לאפשר צפיפות הזריעה של לפחות 100,000 תאים לכל ס מ² על קרום בחדר Micro-boyden. שטח התרבות בתוך החדר מיקרו-Boyden הוא 0.5 ס"מ² וזה יכול להכיל נפח של 100 μl. לכן, השעיה המכילה 500,000 תאים/mL צריך להיות מוכן.
8. פיפטה 100 μL של השעיית תא (50,000 תאים) אל הקרום בחדר מיקרו-Boyden. מודטה בחממה תרבות הרקמה עבור 4 שעות לפני הציפוי בינוני כדי להטביע לחלוטין את החדר. מודאת התרבות לפרק זמן הנדרש, החלפת המדיום פעמיים בשבוע.
   הערה: ברגע שתאי הקרנית של הקרניות מחוברים למשטח העליון של קרום הממברנה, ניתן להפוך את חדר המיקרו-בוידן בתוך התרבות, כך שהחדר התחתון יהיה כלפי מעבר. תאים נוספים ניתן להוסיף לחדר כדי ליזום תרביות תאים על פני השטח השני של קרום. לדוגמה, תאים סטרומה הקרנית ניתן להחיל בקלות על משטח חלופי ובכך לחקות את המיקום היחסי של סוגי תא הקרנית כפי שניתן לראות בתוך הקרנית האחורי.

תוצאות

השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי ?...

Discussion

אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.