Crescita degli strati cellulari endoteliali umani e ovini sulle membrane biomateriali

Riepilogo

Questo protocollo descrive i passaggi critici necessari per stabilire e coltivare colture di cellule endoteliali corneali da espianti di tessuto umano o o novino. Viene inoltre presentato un metodo per la subcultura delle cellule endoteliali corneali su biomateriali membranosi.

Abstract

Le colture di cellule endoteliali corneali tendono a subire la transizione epiteliale-mesenchica (EMT) dopo la perdita del contatto tra cellule. EMT è deleterio per le cellule in quanto riduce la loro capacità di formare uno strato maturo e funzionale. Qui, presentiamo un metodo per stabilire e sottraire le colture endoteliali umane e ovine che riduce al minimo la perdita di contatto tra cellule. Gli espianti della membrana dell'endotelio/Descemet vengono prelevati dalle cornee dei donatori e messi in coltura dei tessuti in condizioni che consentono alle cellule di migrare collettivamente sulla superficie di coltura. Una volta che una cultura è stata stabilita, gli espianti vengono trasferiti in piastre fresche per avviare nuove culture. Dispase II viene utilizzato per sollevare delicatamente ciuffi di cellule dalle piastre di coltura dei tessuti per una subcultura. Le colture di cellule endoteliali eteliali che sono state stabilite utilizzando questo protocollo sono adatte per il trasferimento a membrane biomateriali per produrre strati cellulari tessuti-ingegnerizzati per il trapianto in sperimentazioni animali. Viene descritto un dispositivo su misura per sostenere le membrane biomateriali durante la coltura dei tessuti e viene presentato un esempio di innesto di tipo tessuto composto da uno strato di cellule endoteliali corneali e da uno strato di cellule stromali corneali su entrambi i lati di una membrana di collagene di tipo I.

Introduzione

La cornea è un tessuto trasparente che si trova nella parte anteriore dell'occhio. È composto da tre strati principali: uno strato epiteliale sulla superficie esterna, uno strato di stroma medio e uno strato interno chiamato endotelio corneale. L'endotelio cornealeè è un monostrato di cellule che si trova su una membrana seminterrato chiamata membrana di Descemet e mantiene la trasparenza della cornea regolando la quantità di liquido che entra nello stroma dall'umorismo acquoso sottostante. Troppo fluido all'interno dello stroma provoca gonfiore corneale, opacità e perdita della vista. L'endotelio è quindi vitale per mantenere la visione.

L'endotelio corneo può diventare disfunzionale per una serie di motivi tra cui l'invecchiamento, malattia e lesioni, e l'unico trattamento corrente è la chirurgia del trapianto. Durante questo intervento, l'endotelio e la membrana di Descemet vengono rimossi dalla cornea del paziente e sostituiti con un innesto di endotelio e membrana di Descemet ottenuta da un donatore cornea. Molti innesti di endotelio contengono anche un sottile strato di tessuto stromatale per facilitare la manipolazione e l'attaccamento alla cornea^{ospite 1}.

In tutto il mondo, la domanda di tessuto del donatore di cornea per interventi chirurgici di trapianto è superiore alla quantità che può essere fornita dalle banche degli occhi². È stato quindi dimostrato di sviluppare trapianti di endotelio corneo ingegnerizzati che potrebbero essere utilizzati per alleviare questa carenza³. La motivazione di questo si basa sul fatto che attualmente, l'endotelio da un singolo cornea può essere trasferito solo a un singolo paziente, tuttavia, se le cellule endoteliali corneali sono state prima espanse e coltivate su impalcature biomateriali nella coltura del tessuto, potrebbero essere utilizzate per trattare più pazienti.

Le principali sfide che devono essere affrontate prima che i trapianti di endotelio corneo ingegnerizzati siano un'opzione fattibile per i chirurghi includono: (1) stabilire tecniche per espandere le cellule endoteliali corneali di alta qualità e per produrre strati di cellule endoteliali corneali funzionali in vitro e (2) che stabiliscono tecniche per la crescita delle cellule su scaffold biomateriali per produrre innesti di tessuto che sono uguali o migliori dei innesti derivati dalla cornea del donatore attualmente utilizzati.

Le cellule endoteliali corneali hanno un potenziale proliferativo molto basso in vivo, ma possono essere stimolate a dividersi in vitro⁴. Tuttavia, essi hanno una forte tendenza a subire una transizione epiteliale-mesenchica in vitro (EMT), che riduce la loro capacità di formare uno strato endoteliale maturo e funzionale. I fattori scatenanti noti per EMT nelle cellule endoteliali corneali includono l'esposizione a determinati fattori di crescita e la perdita del contatto da cellula a cellula⁵. È quindi quasi inevitabile che le colture di cellule endoteliali corneali che sono enzimaticamente dissociate durante la sottocultura subiranno cambiamenti associati all'EMT. Qui, presentiamo un metodo di coltura cellulare per le cellule endoteliali corneali umane o ovine che è progettato per ridurre al minimo l'interruzione dei contatti cellulare-cellulare durante le fasi di isolamento, espansione e sottocultura, per ridurre il potenziale di EMT. Inoltre, dimostriamo come gli innesti di tessuto- ingegnerici che assomigliano a innesti di membrana/tessuto strome del composto da membrana/Descemet derivati dal donatore possono essere prodotti colti producendo strati cellulari coltivati su entrambi i lati di una membrana biomateriale in un dispositivo di montaggio su misura.

Protocollo

Le cornee umane con il consenso del donatore per la ricerca sono state ottenute dalla Queensland Eye Bank e utilizzate con l'approvazione etica del Comitato Etico della Ricerca Umana del Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048). Le cornee di pecora sono state ottenute da animali eutanasia presso l'Herston Medical Research Facility dell'Università del Queensland in base a un accordo di condivisione dei tessuti.

1. Preparazione degli strumenti di dissezione

1. Sterilizzare due coppie di pinze da orologiaio numero 4 sia immergendoli in una soluzione di 70% etanolo per 5 min o autoclaving loro.

2. Preparazione delle lastre di coltura media e dei tessuti

1. Preparare 100 mL di mezzo di coltura contenente Opti-MEM 1 (1x) - GlutaMAX-1, 5% siero bovino fetale e 100 U/mL Pen/Strep. Questo mezzo di coltura è adeguato per le colture di cellule endoteliali della cornea delle pecore, tuttavia, per le colture di cellule endoteliali corneali umane il mezzo deve essere integrato con 50 estrali ipofisari bovini g/mL, 0,08% solfato di condroitina, 200 g/mL di cloruro di calcio e 0,3 mM di cofaridecro l-ascorbio 2-fofano. Il mezzo di coltura può essere conservato al buio a 4 gradi centigradi per due settimane.
2. Rivestire i pozze di una piastra di coltura dei tessuti a 6 pozze con fattore di attacco utilizzando le istruzioni del produttore e quindi aggiungere 1 mL di mezzo di coltura ad ogni pozzo rivestito. Preparare un pozzo per ogni cornea.

3. Dissezione degli espiantatori e procedura di coltura cellulare

1. Collocare la cornea, lato endotelio verso l'alto, in un piatto Petri sterile sullo stadio di un microscopio dissetante. Regolare l'illuminazione in modo che la superficie corneale sia ben illuminata con un contrasto sufficiente per evidenziare lo strato endoteliale. Regolare lo zoom in modo che il bordo e alcuni endotelio corneo centrale sia in vista.
2. Utilizzare pinze sterilizzate dell'orologiaio per sollevare e strappare delicatamente la membrana di Descemet lontano dallo stroma sottostante (Figura 1). La membrana si staccherà dallo stroma come una striscia che si arriccia immediatamente. Mettere la striscia in un pozzo di una piastra di coltura dei tessuti a 6 velo che è stata rivestita con fattore di attacco e contiene 1 mL di mezzo di coltura. Il coperchio della piastra di coltura dei tessuti deve essere sempre mantenuto, tranne quando vengono aggiunti espianti, per ridurre il rischio di contaminazione.
3. Rimuovere le strisce della membrana di Descemet dalla periferia estrema dell'endotelio prima e poi dalle regioni centrali in seguito. Mettere tutte le strisce da una cornea in un unico pozzo all'interno della piastra 6-well.
4. Incubare gli espianti in un'incubatrice a coltura cellulare umida fissata al 5% di CO₂ e a 37 gradi centigradi. Lasciare la coltura indisturbata per 2 giorni per consentire agli espianti di depositarsi e attaccarsi alla superficie della piastra. Tipicamente, fino a un terzo degli espianti non riesce ad attaccarsi alla piastra.
5. Togliere il mezzo e gli eventuali espianti non attaccati dalla coltura dopo 4 giorni e aggiungere delicatamente 2 mL di fresco mezzo avendo cura di non disturbare gli espianti attaccati. Il mezzo di coltura deve essere cambiato due volte alla settimana.

4. Produzione continua di cellule endoteliali corneali per coltura seriale di espiantatori

NOTA: Gli espiante possono essere trasferiti nelle piastre di coltura dei tessuti freschi dopo 10 giorni per stabilire ulteriori colture di cellule endoteliali corneali.

1. Posizionare la coltura dell'espianto sullo stadio di un microscopio sezionato e regolare l'illuminazione e lo zoom in modo che gli espianti siano visibili.
2. Utilizzando pinze sterilizzate orologiere, strappare delicatamente ogni espianto dalla sua piastra di coltura e trasferirlo in un pozzo fresco di una piastra di coltura dei tessuti a 6 velo che è stata rivestita con fattore di attacco e contiene 1 mL di mezzo di coltura.
3. Lasciare che gli espianti si depositino sulla superficie del loro nuovo piatto per 4 giorni prima di sostituire il mezzo di coltura con 2 mL di fresco mezzo di coltura. Cambiare il mezzo di coltura cambiato due volte alla settimana.

5. Coltivare cellule endoteliali corneali su vetro coprelips per analisi immunofluorescenza

NOTA: Le colture cellulari destinate ad essere analizzate utilizzando l'immunofluorescenza devono essere stabilite su copricapi di vetro che possono essere montati su vetrini al microscopio in vetro seguendo la procedura di colorazione.

1. Sterilizzare una confezione di vetro rotondo in 13 mm di diametro in un'autoclave o immergendo in 70% etanolo per 15 min seguita da tre risciacqui in salina di fosfato-buffered (PBS).
2. Posizionare le singole coperture nei pozzi di una piastra di coltura dei tessuti a 24 pozze, ricoprirle con il fattore di attacco e quindi aggiungere 0,5 mL di mezzo di coltura a ogni pozzo.
3. Utilizzando pinze orologiere sterilizzate rimuovere le espianti dalle loro piastre di coltura dei tessuti e trasferirle in pozzi contenenti coverlips. Lasciare che gli espianti si stabilizzino sui coperchi per 4 giorni prima di cambiare il mezzo.
4. Dopo il periodo di incubazione richiesto, fissare e macchiare le culture coverslip all'interno dei loro pozzi di coltura. Montare i coperchi delle coperture colorate su vetrini al microscopio in vetro per l'analisi al microscopio a fluorescenza.

6. Sottocultura delle cellule endoteliali corneali che utilizzano Dispase II

NOTA: Le grandi cellule fibroblastiche possono essere rimosse selettivamente dalle colture degli espiantati in 6-well plates prima di subessere utilizzando questa procedura. Se tutte le celle devono essere sottocoltivate, non eseguire i passaggi da 6.2 a 6.4. Lo scopo di questa procedura è trasferire le cellule su piastre fresche mantenendo il più possibile i loro contatti da cellula a cella. Le cellule devono essere maneggiate delicatamente. I pozzi completamente confluenti dovrebbero essere passaggiati ad un rapporto di 1:2, mentre i pozzi subconfluenti dovrebbero essere passaggi a un rapporto di 1:1 o inferiore.

1. Rimuovere il mezzo dalla coltura e risciacquare brevemente con DPBS.
2. Aggiungere 1 mL di Versene. Incubare a temperatura ambiente per 30 s.
3. Rimuovere il Versene e aggiungere 1 mL di TrypLE. Incubare a 37 gradi centigradi nell'incubatrice della coltura tissutale per 3 min.
4. Osservare la coltura utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Toccare delicatamente la coltura per spostare le cellule dalla piastra. Non appena le grandi cellule fibroblastiche si sono staccate dalla piastra, rimuoverle e il TrypLE utilizzando una pipetta da 1 mL. Lavare TrypLE residuo dalle cellule rimanenti risciacquando due volte con 2 mL di DPBS.
5. Aggiungere 1 mL di 1 mg/mL Dispase II alla coltura e incubare nell'incubatrice della coltura tissutale per 1 a 2 h o fino a quando tutte le cellule si sono staccate dalla piastra. Le cellule dovrebbero fluttuare gradualmente lontano dalla piastra in grumi.
6. Raccogliere le cellule utilizzando una pipetta da 1 mL e trasferirle a 20 mL di DPBS in un tubo di centrifuga di 50 mL. Centrifuga per 5 min a 300 x g a temperatura ambiente.
7. Rimuovere il supernatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare mediante triturazione con una pipetta da 1 mL in 1 mL di mezzo di coltura. Trasferire la sospensione cellulare in uno o due pozze di una piastra di 6 pozze, al passaggio ad un rapporto di 1:1 o 1:2 rispettivamente.
8. Ricaricare il mezzo in ogni pozzo per fare 2 mL e posizionare le colture nell'incubatrice di coltura dei tessuti. Sostituire il mezzo con 2 mL di mezzo fresco due volte alla settimana.

7. Crescita degli strati delle cellule endoteliali corneali sulle membrane biomateriali

NOTA: la procedura seguente descrive i passaggi necessari per montare un biomateriale membranoso in un dispositivo di montaggio su misura, denominato camera micro-Boyden, per la coltura cellulare. Si prega di fare riferimento alla nostra recente pubblicazione⁶ per ulteriori informazioni sul dispositivo e per i dettagli di acquisto.

1. Assemblare la camera superiore della camera micro-Boyden posizionando un anello O rosso al suo centro.
2. Utilizzare una trefina di 18 mm di diametro per estrarre un disco da un foglio biomateriale su un tagliere in politetrafluoroetilene (PTFE). Posizionare questo disco sull'anello rosso nella camera superiore della camera micro-Boyden.
3. Avvitare la camera inferiore sulla camera superiore, fissando il disco biomateriale in mezzo.
4. Immergere la camera assemblata micro-Boyden nel 70% di etanolo per 1 h per sterilizzarla.
5. Immergere completamente la camera assemblata micro-Boyden in HBSS sterile per 10 min per rimuovere l'etanolo. Ripetere questo passaggio di lavaggio due volte. Eseguire un passaggio di lavaggio finale per 10 min in un supplemento di coltura medio.
6. Trasferire la camera sterilizzata micro-Boyden al mezzo di coltura nel pozzo di una piastra a 6 pozzetto assicurando che la camera superiore sia più alta. Regolare il livello di supporto di coltura in modo che contatti la superficie inferiore della membrana biomateriale ma non scorra nella camera superiore.
7. Preparare una sospensione delle cellule endoteliali corneali utilizzando la procedura descritta nella sezione 6. Deve essere ottenuta una densità cellulare sufficiente nella sospensione per consentire una densità di semina di almeno 100.000 cellule per cm² sulla membrana nella camera micro-Boyden. La superficie di coltura all'interno della camera micro-Boyden è di 0,5 cm² e può contenere un volume di 100 l. Pertanto, deve essere preparata una sospensione contenente 500.000 cellule/mL.
8. Pipetta 100 -L di sospensione cellulare (50.000 cellule) sulla membrana nella camera micro-Boyden. Incubare nell'incubatrice di coltura tissutale per 4 h prima di rifornire il mezzo per immergere completamente la camera. Incubare la coltura per il periodo di tempo richiesto, sostituendo il mezzo due volte alla settimana.
   NOTA: Una volta che le cellule endoteliali corneali sono attaccate alla superficie superiore della membrana biomateriale, la camera micro-Boyden può essere capovolta all'interno della coltura in modo che la camera inferiore sia più in alto. Più cellule possono quindi essere aggiunte alla camera per avviare colture cellulari sull'altra superficie della membrana. Ad esempio, le cellule stromali corneali possono essere facilmente applicate alla superficie alternativa imitando così la posizione relativa dei tipi di cellule corneali come si vede all'interno della cornea posteriore.

Risultati

Il metodo per isolare ed espandere le cellule endoteliali corneali da cornee umane o pecore è riepilogato nella Figura 1 e Figura 2. La maggior parte delle espianti che derivano dalle cornee da 1 a 2 anni o donatori umani di età inferiore ai 30 anni si attaccano alle piastre di coltura dei tessuti rivestiti di fattore di attacco entro una settimana, tuttavia, non è insolito scoprire che fino a un terzo degli espianti non riescano ad attaccarsi entro questo pe...

Discussione

Una sfida tecnica significativa associata alla creazione e all'espansione delle cellule endoteliali corneali umane impedisce che si verifichino EMT nelle colture. EMT può essere attivato nelle cellule endoteliali corneali dalla perdita di contatto cellulare-cellulare, ma la maggior parte dei protocolli di coltura cellulare per queste cellule comporta la dissociazione enzimatica a singole cellule durante l'isolamento e la sottocultura¹⁰. Qui presentiamo un protocollo alternativo di coltura cellula...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.