Wachstum von Human- und Schafhornhaut-Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die kritischen Schritte, die erforderlich sind, um hornhaut-Endothelzellkulturen aus Expflanzen von menschlichem oder Schafgewebe zu etablieren und zu züchten. Ein Verfahren zur Subkulierung von kornealen Endothelzellen auf membranösen Biomaterialien wird ebenfalls vorgestellt.

Zusammenfassung

Hornhaut-Endothel-Zellkulturen neigen dazu, nach Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts epitheliale inmechymale Übergänge (EMT) zu durchlaufen. EMT ist schädlich für die Zellen, da es ihre Fähigkeit reduziert, eine reife und funktionelle Schicht zu bilden. Hier stellen wir eine Methode zur Etablierung und Subkultivierung von kornealen Endothelzellkulturen von Mensch und Schaf vor, die den Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts minimiert. Explantieren der Hornhaut-Endothel/Descemet-Membran werden aus Spenderhornhäuten entnommen und unter Bedingungen in die Gewebekultur gebracht, die es den Zellen ermöglichen, kollektiv auf die Kulturoberfläche zu wandern. Sobald eine Kultur etabliert ist, werden die Explants auf frische Platten übertragen, um neue Kulturen zu initiieren. Dispase II wird verwendet, um Zellklumpen sanft von Gewebekulturplatten zur Subkultivierung zu heben. Mit diesem Protokoll hergestellte Hornhaut-Endothelzellkulturen eignen sich für die Übertragung auf Biomaterialmembranen zur Herstellung von gewebetechnischen Zellschichten für die Transplantation in Tierversuchen. Ein maßgeschneidertes Gerät zur Unterstützung von Biomaterialmembranen während der Gewebekultur wird beschrieben und ein Beispiel für ein gewebetechnisches Transplantat, das aus einer Schicht aus hornförmigen Endothelzellen und einer Schicht von hornförmigen Stromalzellen auf beiden Seiten einer Kollagenmembran Typ I besteht, wird vorgestellt.

Einleitung

Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe, das sich an der Vorderseite des Auges befindet. Es besteht aus drei Hauptschichten: einer Epithelschicht auf der außenoberfläche, einer mittleren Stroma-Schicht und einer inneren Schicht, dem Hornhautendothel. Das Hornhautendothel ist eine Monoschicht von Zellen, die auf einer Kellermembran namens Descemet-Membran sitzt und die Transparenz der Hornhaut aufrechterhält, indem es die Flüssigkeitsmenge reguliert, die aus dem zugrunde liegenden wässrigen Humor in die Stroma eindringt. Zu viel Flüssigkeit im Stroma verursacht Hornhautschwellungen, Opazität und Sehverlust. Das Endothel ist daher entscheidend für die Aufrechterhaltung der Sehkraft.

Das Hornhautendothel kann aus einer Reihe von Gründen wie Alterung, Krankheit und Verletzungen dysfunktional werden, und die einzige aktuelle Behandlung ist Transplantationschirurgie. Während dieser Operation wird das Endothel und die Descemet-Membran aus der Hornhaut des Patienten entfernt und durch ein Transplantat von Endothel und Descemets Membran aus einer Spenderhornhaut ersetzt. Viele Endotheltransplantate enthalten auch eine dünne Schicht Stromalgewebe, um die Handhabung und Befestigung an der Wirtshornhaut¹zu unterstützen.

Weltweit ist die Nachfrage nach Hornhautspendergewebe für Transplantationsoperationen größer als die Menge, die von Augenbänken 2 geliefert werden^kann. Es gab daher einen Antrieb, gewebegefertigte Hornhaut-Endothel-Transplantationen zu entwickeln, die verwendet werden könnten, um diesen Mangel zu lindern³. Die Begründung dafür beruht auf der Tatsache, dass Endothel aus einer einzelnen Hornhaut derzeit nur auf einen einzelnen Patienten übertragen werden kann, wenn die Hornhautendothelzellen jedoch zuerst erweitert und auf biomaterialgerüsten in der Gewebekultur angebaut werden, sie zur Behandlung mehrerer Patienten verwendet werden könnten.

Zu den großen Herausforderungen, die angegangen werden müssen, bevor gewebetechnische Hornhaut-Endotheltransplantationen für Chirurgen zu einer praktikablen Option werden, gehören: (1) Etablierung von Techniken zur Erweiterung von Hornhaut-Endothelzellen von hoher Qualität und zur Herstellung von reifen und funktionelle horneale Endothelzellschichten in vitro und (2) Die Herstellung von Techniken zum Anbau der Zellen auf biomaterialgerüsten, um gewebetechnische Transplantate herzustellen, die den derzeit verwendeten Transplantaten aus der Spenderhornhaut entsprechen oder besser sind.

Hornhaut-Endothelzellen haben ein sehr geringes proliferatives Potenzial in vivo, können aber stimuliert werden, um sich in vitro zu teilen⁴. Dennoch neigen sie stark dazu, sich einem in vitro epitheliaal-mesenchymalen Übergang (EMT) zu unterziehen, was ihre Fähigkeit zur Bildung einer reifen, funktionellen Endothelschicht verringert. Bekannte Auslöser für EMT in hornförmigen Endothelzellen sind die Exposition gegenüber bestimmten Wachstumsfaktoren und der Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts⁵. Es ist daher fast unvermeidlich, dass horneale Endothelzellkulturen, die während der Subkultur enzymatisch dissoziiert werden, Veränderungen im Zusammenhang mit EMT erfahren werden. Hier stellen wir eine Zellkulturmethode für humane oder Schafe Hornhaut-Endothelzellen vor, die entwickelt wurde, um Störungen von Zell-zu-Zell-Kontakten während Isolations-, Expansions- und Subkulturphasen zu minimieren, um das Potenzial für EMT zu reduzieren. Darüber hinaus zeigen wir, wie gewebegefertigte Transplantate, die den Membran-/Stromalgewebetransplantaten von Spenderhornhaut/Descemet ähneln, durch den Anbau von kultivierten Zellschichten auf beiden Seiten einer Biomaterialmembran in einem kundenspezifischen Montagegerät hergestellt werden können.

Protokoll

Humaneas mit Spenderzustimmung für die Forschung wurden von der Queensland Eye Bank bezogen und mit ethischer Genehmigung von der Human Research Ethics Committee des Metro South Hospital and Health Service (HREC/07/QPAH/048) verwendet. Schafhornhäuten wurden von eingeschläferten Tieren in der Herston Medical Research Facility der University of Queensland im Rahmen einer Vereinbarung über die GemeinsameNutzung von Geweben gewonnen.

1. Vorbereitung von Sezierwerkzeugen

1. Sterilisieren Sie zwei Paare von Nummer 4 Uhrmacher Zangen, indem Sie sie entweder in einer Lösung von 70% Ethanol für 5 min oder durch Autoklavieren einweichen.

2. Vorbereitung von Kulturmittel- und Gewebekulturplatten

1. Bereiten Sie 100 ml Kulturmedium mit Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% fetales Rinderserum und 100 U/ml Pen/Strep vor. Dieses Kulturmedium eignet sich für schafkorneale Endothelzellkulturen, jedoch sollte das Medium für menschliche Hornhaut-Endothelzellkulturen mit 50 g/ml Rinder-Hypophysenextrakt, 0,08 % Chondroitinsulfat, 200 g/ml Calciumchlorid und 0,3 mM L-Ascorbinsäure 2-Phosphat ergänzt werden. Kulturmedium kann zwei Wochen lang bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden.
2. Beschichten Sie die Brunnen einer 6-Well-Gewebekulturplatte mit Attachment Factor nach den Anweisungen des Herstellers und fügen Sie dann 1 ml Kulturmedium zu jedem beschichteten Brunnen hinzu. Bereiten Sie einen gut für jede Hornhaut.

3. Explant-Sektions- und Zellkulturverfahren

1. Die Hornhaut, Endothelseite nach oben, in eine sterile Petrischale auf der Bühne eines Sezierendes Mikroskops geben. Stellen Sie die Beleuchtung so ein, dass die Hornhautoberfläche gut beleuchtet ist und genügend Kontrast vorhanden ist, um die Endothelschicht hervorzuheben. Passen Sie den Zoom so an, dass die Kante und ein zentrales Hornhautendothel sichtbar sind.
2. Verwenden Sie sterilisierte Uhrmacherzange, um Descemets Membran sanft vom darunter liegenden Stroma zu heben und zu reißen (Abbildung 1). Die Membran löst sich von der Stroma als Streifen, der sich sofort auflöst. Legen Sie den Streifen in einen Brunnen einer 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit Attachment Factor beschichtet wurde und 1 ml Kulturmedium enthält. Der Deckel der Gewebekulturplatte sollte jederzeit eingeschaltet werden, außer wenn Ihm Explantationen zugesetzt werden, um das Risiko einer Kontamination zu verringern.
3. Entfernen Sie streifen von Descemets Membran zuerst aus der extremen Peripherie des Endothels und später aus zentralen Regionen. Legen Sie alle Streifen aus einer Hornhaut in einen einzigen Brunnen innerhalb der 6-Well-Platte.
4. Inkubieren Sie die Expflanzen in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator, der auf 5%_CO2 und 37 °C eingestellt ist. Lassen Sie die Kultur für 2 Tage ungestört, damit sich die Explants absetzen und an der Plattenoberfläche befestigen können. In der Regel können bis zu einem Drittel der Expflanzen nicht an der Platte befestigt werden.
5. Entfernen Sie das Medium und alle ungebundenen Explants aus der Kultur nach 4 Tagen und fügen Sie vorsichtig 2 ml frisches Kulturmedium unter Behutsam nicht die angeschlossenen Explants zu stören. Kulturmedium sollte zweimal pro Woche gewechselt werden.

4. Kontinuierliche Produktion von hornhauten Endothelzellen durch serielle Explantationskultur

HINWEIS: Explanten können nach 10 Tagen auf frische Gewebekulturplatten übertragen werden, um zusätzliche horneale Endothelzellkulturen zu etablieren.

1. Legen Sie die Explant-Kultur auf die Bühne eines Sezierendes Mikroskops und passen Sie die Beleuchtung und den Zoom so an, dass die Explanten sichtbar sind.
2. Mit sterilisierten Uhrmacherzangen, sanft zupfen jede Expflanze von seiner Kulturplatte und übertragen Sie es in einen frischen Brunnen einer 6-Well-Gewebekulturplatte, die mit Attachment Factor beschichtet wurde und enthält 1 ml Kulturmedium.
3. Lassen Sie die Explants sich 4 Tage lang auf der Oberfläche ihrer neuen Platte ansiedeln, bevor sie das Kulturmedium durch 2 ml frisches Kulturmedium ersetzen. Change Culture Medium änderte sich zweimal pro Woche.

5. Wachsende horneale Endothelzellen auf Glasabdeckungen für Immunfluoreszenzanalysen

HINWEIS: Zellkulturen, die mit Hilfe der Immunfluoreszenz analysiert werden sollen, sollten auf Glasabdeckungen nachgewiesen werden, die nach dem Färbeverfahren auf Glasmikroskop-Dias montiert werden können.

1. Sterilisieren Sie eine Packung mit runden Glasabdeckungen mit 13 mm Durchmesser in einem Autoklaven oder durch Einweichen von 70 % Ethanol für 15 min, gefolgt von drei Spülungen in phosphatgepufferter Saline (PBS).
2. Legen Sie einzelne Abdeckungen in die Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte, beschichten Sie sie mit Attachment Factor, und fügen Sie dann 0,5 ml Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu.
3. Mit sterilisierten Uhrmacherzangen entfernen Sie Expflanzen aus ihren Gewebekulturplatten und übertragen sie in Brunnen mit Abdeckungen. Lassen Sie die Explants 4 Tage lang auf den Abdeckungen absetzen, bevor Sie das Medium wechseln.
4. Nach der erforderlichen Inkubationszeit die Deckslipkulturen in ihren Kulturbrunnen fixieren und färben. Montieren Sie die gebeizten Abdeckungen zur Analyse unter einem Fluoreszenzmikroskop auf Glasmikroskopfolien.

6. Subkultur von hornhauten Endothelzellen mit Dispase II

HINWEIS: Große fibroblastische Zellen können selektiv aus Explantationskulturen in 6-Well-Platten entfernt werden, bevor sie mit diesem Verfahren subkulieren. Wenn alle Zellen subkultiviert werden sollen, führen Sie die Schritte 6.2 bis 6.4 nicht aus. Ziel dieses Verfahrens ist es, die Zellen auf frische Platten zu übertragen und gleichzeitig ihre Zell-zu-Zell-Kontakte so weit wie möglich zu erhalten. Die Zellen sollten schonend behandelt werden. Vollständig konfluente Brunnen sollten im Verhältnis 1:2 durchgelassen werden, während subkonfluente Brunnen im Verhältnis 1:1 oder weniger durchgelassen werden sollten.

1. Entfernen Sie das Medium aus der Kultur und spülen Sie es kurz mit DPBS ab.
2. Fügen Sie 1 ml Versene hinzu. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 s.
3. Entfernen Sie die Versene und fügen Sie 1 ml TrypLE. Bei 37 °C im Gewebekultur-Inkubator für 3 min inkubieren.
4. Beobachten Sie die Kultur mit einem Phasenkontrastmikroskop. Tippen Sie vorsichtig auf die Kultur, um Zellen von der Platte zu entfernen. Sobald sich die großen fibroblastischen Zellen von der Platte gelöst haben, entfernen Sie sie und die TrypLE mit einer 1 ml Pipette. Waschen Sie Rest TrypLE von den verbleibenden Zellen, indem Sie zweimal mit 2 ml DPBS spülen.
5. 1 ml 1 mg/ml Dispase II in die Kultur geben und im Gewebekultur-Inkubator für 1 bis 2 h brüten oder bis sich alle Zellen von der Platte gelöst haben. Die Zellen sollten nach und nach in Klumpen von der Platte wegschwimmen.
6. Sammeln Sie die Zellen mit einer 1 ml Pipette und übertragen Sie auf 20 ml DPBS in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Zentrifuge für 5 min bei 300 x g bei Raumtemperatur.
7. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet vorsichtig durch Triturierung mit einer 1 ml Pipette in 1 ml Kulturmedium wieder auf. Übertragen Sie die Zellsuspension entweder auf einen oder zwei Brunnen einer 6-Well-Platte, um sie im Verhältnis 1:1 bzw. 1:2 zu durchgehen.
8. Aufladen Sie das Medium in jedem Brunnen, um 2 ml zu machen und legen Sie die Kulturen in den Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium zweimal pro Woche durch 2 ml frisches Medium.

7. Wachstum von hornehauten Endothelzellschichten auf Biomaterialmembranen

HINWEIS: Das folgende Verfahren beschreibt die Schritte bei der Montage eines membranösen Biomaterials in einem maßgeschneiderten Montagegerät – einer so genannten Mikro-Boyden-Kammer – für die Zellkultur. Weitere Informationen zum Gerät und Kaufdetails finden Sie in unserer aktuellen Publikation^6.

1. Montieren Sie die obere Kammer der Mikro-Boyden-Kammer, indem Sie einen roten O-Ring in die Mitte legen.
2. Verwenden Sie ein Trephin mit 18 mm Durchmesser, um eine Scheibe aus einem Biomaterialblech auf einem Schneidebrett aus Polytetrafluorethylen (PTFE) auszustechen. Legen Sie diese Scheibe über den roten O-Ring in die obere Kammer der Mikro-Boyden-Kammer.
3. Schrauben Sie die untere Kammer auf die obere Kammer und sichern Sie die Biomaterialscheibe dazwischen.
4. Die montierte Mikro-Boyden-Kammer in 70% Ethanol einweichen, um sie 1 h zu sterilisieren.
5. Tauchen Sie die montierte Mikro-Boyden-Kammer 10 min lang vollständig in steriles HBSS ein, um das Ethanol zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. Führen Sie einen letzten Waschschritt für 10 min in unergänzenden Kulturmedium.
6. Übertragen Sie die sterilisierte Mikro-Boyden-Kammer in das Kulturmedium im Brunnen einer 6-Well-Platte, um sicherzustellen, dass die obere Kammer an erster Stellen steht. Stellen Sie das Niveau des Kulturmediums so ein, dass es die untere Oberfläche der Biomaterialmembran kontaktiert, aber nicht in die obere Kammer fließt.
7. Bereiten Sie eine Suspension von hornhauten Endothelzellen nach dem in Abschnitt 6 beschriebenen Verfahren vor. Eine ausreichende Zelldichte in der Suspension sollte erreicht werden, um eine Sädichte von mindestens 100.000 Zellen pro^cm2 auf der Membran in der Mikro-Boyden-Kammer zu ermöglichen. Die Kulturfläche innerhalb der Mikro-Boyden-Kammer beträgt 0,5 cm² und kann ein Volumen von 100 l aufnehmen. Daher sollte eine Suspension mit 500.000 Zellen/ml vorbereitet werden.
8. Pipette 100 l Zellsuspension (50.000 Zellen) auf die Membran in der Mikro-Boyden-Kammer. Inkubieren Sie im Gewebekultur-Inkubator für 4 h, bevor Sie das Medium auffüllen, um die Kammer vollständig zu untertauchen. Inkubieren Sie die Kultur für den erforderlichen Zeitraum und ersetzen Sie das Medium zweimal pro Woche.
   HINWEIS: Sobald die hornförmigen Endothelzellen an der Oberseite der Biomaterialmembran befestigt sind, kann die Mikro-Boyden-Kammer innerhalb der Kultur gut umgeklappt werden, so dass die untere Kammer an erster Stelle steht. Weitere Zellen können dann der Kammer hinzugefügt werden, um Zellkulturen auf der anderen Oberfläche der Membran zu initiieren. Zum Beispiel können Hornhautstromalzellen leicht auf die alternative Oberfläche aufgetragen werden, wodurch die relative Position von Hornhautzelltypen, wie sie in der hinteren Hornhaut gesehen werden, imitiert wird.

Ergebnisse

Die Methode zur Isolierung und Erweiterung von hornhauten Endothelzellen aus menschlichen oder Schafhornhäuten ist in Abbildung 1 und Abbildung 2zusammengefasst. Die meisten Expflanzen, die aus den Hornhäuten von 1 bis 2 Jahre alten Schafen oder menschlichen Spendern mit weniger als 30 Jahren gewonnen werden, werden innerhalb einer Woche an Attachment Factor-beschichteten Gewebekulturplatten befestigt, es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass bis zu einem Dritt...

Diskussion

Eine bedeutende technische Herausforderung, die mit der Etablierung und Erweiterung menschlicher Hornhaut-Endothelzellen verbunden ist, verhindert, dass EMT in den Kulturen auftritt. EMT kann in hornförmigen Endothelzellen durch Verlust des Zell-zu-Zell-Kontakts ausgelöst werden, aber die meisten Zellkulturprotokolle für diese Zellen beinhalten enzymatische Dissoziation zu einzelnen Zellen während der Isolation und Subkultur¹⁰. Hier stellen wir ein alternatives Zellkulturprotokoll für horneal...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.