生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

要約

このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。

要約

角膜内皮細胞培養は、細胞間接触の喪失後に上皮間葉転換(EMT)を受ける傾向がある。EMTは、成熟した機能的な層を形成する能力を低下させるので、細胞にとって有害である。ここでは、ヒトおよび羊角膜内皮細胞培養物を確立し、細胞間接触の損失を最小限に抑える方法を紹介する。角膜内皮/デセメットの膜の外植植物は、ドナー角膜から採取され、細胞が一括して培養表面に移動することを可能にする条件下で組織培養に入れられる。培養が確立されると、外植は新鮮なプレートに移され、新しい文化を開始します。ディスパーゼIIは、細胞の塊を組織培養プレートから緩やかに持ち上げて、サブカル化するために使用されます。このプロトコルを使用して確立された角膜内皮細胞培養は、生体材料膜への転移に適しており、動物試験での移植のための組織操作細胞層を生成する。組織培養中に生体材料膜を支持するためのカスタムメイドの装置が記載されており、コラーゲンI型膜の両側に角膜内皮細胞の層と角膜間質細胞の層からなる組織工学的移植片の例が提示される。

概要

角膜は目の前に位置する透明な組織です。それは3つの主要な層で構成されている:外面上皮層、中間間質層、および角膜内皮と呼ばれる内層。角膜内皮は、デセメットの膜と呼ばれる基底膜に座っている細胞の単層であり、基礎となる水性房からストロマに入る流体の量を調節することによって角膜の透明性を維持する。間質内の体液が多すぎると、角膜腫脹、不透明性、視力低下を引き起こす。したがって、内皮は視力を維持するために不可欠である。

角膜内皮は、老化、病気、怪我を含む多くの理由で機能不全になり、現在の治療は移植手術だけです。この手術の間に、内皮およびデセメットの膜は患者の角膜から取り出され、ドナー角膜から得られた内皮およびデセメットの膜の移植片に置き換えられる。多くの内皮移植片はまた、ホスト角膜¹への取り扱いと付着を助けるために間質組織の薄い層を含む。

世界的に、移植手術のための角膜ドナー組織の需要は、眼球^バンク2によって供給できる量よりも大きい。したがって、この不足を緩和するために使用できる組織工学的な角膜内皮移植を開発するドライブがありました³.この根拠は、現在、個々の角膜からの内皮は単一の患者にのみ移すことができるという事実に基づいているが、角膜内皮細胞が最初に組織培養中の生体材料足場で拡大および増殖した場合、複数の患者を治療するために使用することができる。

組織工学による角膜内皮移植が外科医にとって実現可能な選択肢になる前に取り組む必要がある主な課題は次のとおりです: (1) 高品質の角膜内皮細胞を拡大し、成熟したインビトロでの機能的角膜内皮細胞層、および(2)生体材料足場上の細胞を成長させる技術を確立し、現在使用されているドナー角膜由来移植片と同等またはより優れた組織工学的移植片を産生する。

角膜内皮細胞は、生体内での増殖ポテンシャルが非常に低いが、インビトロ⁴で分裂するように刺激することができる。それにもかかわらず、それらは、成熟した機能的な内皮層を形成する能力を低下させるインビトロ上皮間葉移行(EMT)を受ける強い傾向を有する。角膜内皮細胞におけるEMTの既知のトリガーには、細胞間接触の特定の成長因子および細胞間接触の喪失5への曝露が含^まれる。したがって、サブカルチャー中に酵素的に解離された角膜内皮細胞培養物がEMTに関連する変化を受けることはほぼ避けられない。ここでは、分離、拡張およびサブ培養段階における細胞間接触の破壊を最小限に抑え、EMTの可能性を低減するように設計されたヒトまたは羊角膜内皮細胞の細胞培養方法を提示する。さらに、ドナー角膜由来内皮/デセメットの膜/間質組織移植片に似た組織工学的移植片を、生体材料膜の両側に培養した細胞層をカスタムメイドの実装装置で作り上げ、どのように作り出すことができるかを実証する。

プロトコル

研究のためのドナーの同意を持つ人間の角膜は、クイーンズランド州アイバンクから取得され、メトロサウス病院と保健サービスの人間研究倫理委員会(HREC/07/QPAH/048)から倫理承認を得て使用されました。羊角膜は、組織共有契約の下でクイーンズランド大学のハーストン医学研究施設で安楽死動物から得られました。

1. 解剖ツールの準備

1. 5分間70%エタノールの溶液に浸すか、オートクレーブすることによって、ナンバー4の時計製造者鉗子の2組を殺菌します。

2. 培養液・組織培養プレートの調製

1. Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1、5%のウシ胎児血清、100 U/mLペン/ストレップを含む100 mLの培地を調製します。この培養液は、羊角膜内皮細胞培養に適しており、ヒト角膜内皮細胞培養では50μg/mLウシ下垂体抽出物、0.08%のコンドロイチン硫酸、200μg/mLカルシウム、0.3mM L-アスコルビン酸2-リン酸を添加する必要があります。培養液は、4°Cで2週間暗い場所に保存することができる。
2. メーカーの指示に従って6ウェル組織培養プレートの井戸を取り付け係数でコーティングし、各コーティングウェルに1 mLの培養培地を加えます。角膜ごとに1つの井戸を準備します。

3. 外植解・細胞培養手順

1. 角膜、内皮側を上に置き、解剖顕微鏡のステージ上の無菌ペトリ皿に入れます。角膜表面が内皮層を強調するのに十分なコントラストで明るく点灯するように照明を調整します。エッジと中央角膜内皮が表示されるようにズームを調整します。
2. 殺菌された時計メーカーの鉗子を使用して、下層のストロマからデセメットの膜を静かに持ち上げて引き裂きます(図1)。膜は、すぐにカールするストリップとしてストロマから取り外されます。取り付け係数でコーティングされ、1 mLの培養液を含む6ウェル組織培養プレートの1つのウェルにストリップを置きます。組織培養プレートの蓋は、汚染のリスクを減らすために、外植物が加えられている場合を除き、常にオンにしておく必要があります。
3. 最初に内皮の極端な周辺からデセメットの膜のストリップを取り除き、次に中央領域から取り除きます。1つの角膜からすべてのストリップを6ウェルプレート内の単一の井戸に入れなさい。
4. 5%CO2および37°Cに設定した加湿細胞培養インキュベーターで外植植物をインキュベートする。外植者が落ち着いてプレート表面に付着できるように、培養を2日間妨げずにしておきます。通常、外植の最大3分の1はプレートに取り付けに失敗する。
5. 4日後に培地と未接続の外植植物を培養液から取り出し、2 mLの新鮮な培養培地を静かに加え、添付の外植植物を邪魔しないように注意してください。培地は週2回交換する必要があります。

4. 連続外植物培養による角膜内皮細胞の連続生産

注:10日後に新しい組織培養プレートに取り出し、角膜内皮細胞培養を確立することができます。

1. 外植培養を分剖顕微鏡のステージに置き、外植植物が見えるように照明とズームを調整します。
2. 滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、それぞれの外植物を培養プレートから軽く摘み取り、取り付け係数でコーティングされ、1 mLの培養培地を含む6ウェル組織培養プレートの新鮮な井戸に移します。
3. 培養液を2mLの新鮮な培地に置き換える前に、外植植物が新しいプレートの表面に4日間落ち着くようにします。週に2回変化培養培地。

5. ガラス上の角膜内皮細胞の成長 は、免疫蛍光分析のための円蓋

注:免疫蛍光を用いて分析される予定の細胞培養は、染色手順に従ってガラス顕微鏡スライドに取り付けることができるガラスカバースリップ上に確立する必要があります。

1. オートクレーブで直径13mmの丸いガラスカバーリップを殺菌するか、70%エタノールに15分間浸し、続いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に3つのすすを浸します。
2. 個々のカバーリップを24ウェルの組織培養プレートの井戸に入れ、取り付け係数でコーティングし、各ウェルに0.5mLの培養培地を加えます。
3. 滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、組織培養プレートから外植植物を取り除き、カバースリップを含む井戸に移します。外植植物が媒体を交換する前に4日間カバースリップに落ち着くようにします。
4. 必要な潜伏期間の後、彼らの培養井戸内のカバースリップ培養物を固定し、染色する。染色されたカバースリップをガラス顕微鏡スライドに取り付け、蛍光顕微鏡下で分析します。

6. ディスパーゼIIを用いた角膜内皮細胞のサブ培養

注:大きな線維芽細胞は、この手順を使用して下塗りする前に、6ウェルプレートの外植物培養物から選択的に除去することができる。すべての細胞をサブカルチャー化する場合は、手順 6.2 ~ 6.4 を実行しないでください。この手順の目的は、細胞間接触を可能な限り維持しながら、細胞を新鮮なプレートに移すことを目的としています。セルは穏やかに処理する必要があります。完全にconfluentの井戸は1:2の比率で継がれるべきであり、サブコンフルエント・ウェルは1:1以下の比率で継がれるべきである。

1. 培地を培養液から取り出し、DPBSで短時間リンスします。
2. 1 mL のヴァーセンを加えます。室温で30sのインキュベート。
3. Versene を取り外し、トリプレの 1 mL を追加します。組織培養インキュベーター内で37°Cで3分間インキュベートする。
4. 位相コントラスト顕微鏡を用いて培養を観察する。培養液を軽くタップして、プレートから細胞を取り除きます。大きな線維芽細胞がプレートから切り離されるとすぐにそれらを除去し、1 mLピペットを使用して、TrypLE.残りの細胞から残留トリプルを洗浄するには、2 mLのDPBSで2回洗浄します。
5. 1 mg/mL ディスパーゼ II の 1 mL を培養に加え、組織培養インキュベーター内で 1 ~ 2 時間、またはすべての細胞がプレートから切り離されるまでインキュベートします。細胞は徐々に塊のプレートから離れて浮かぶ必要があります。
6. 1 mLピペットを使用して細胞を集め、50 mL遠心管で20 mLのDPBSに移します。室温で300 x gで5分間遠心分離します。
7. 上清を取り出し、1 mLの培地で1mLピペットでトリチュレーションして細胞ペレットを静かに再懸濁させます。細胞懸濁液を6ウェルプレートの1つまたは2つのウェルのいずれかに移し、それぞれ1:1または1:2の比率で通過する。
8. 各ウェルに培地を上に上げて2mLを作り、培養液を組織培養インキュベーターに入れる。週に2回、新鮮な培地を2mLに交換します。

7. 生体物質膜上の角膜内皮細胞層の成長

注: 以下の手順では、セル培養用に、カスタムメイドの取り付け装置(マイクロボイデンチャンバー)にmembranous生体材料を取り付ける手順について説明します。デバイスの詳細および購入の詳細については、最近の出版物⁶を参照してください。

1. その中心に赤いOリングを置くことによってマイクロボイデン室の上部の部屋を組み立てます。
2. 直径18mmのトレフィンを使用して、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)まな板に生体材料シートからディスクをパンチアウトします。マイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーの赤いOリングの上にこのディスクを置きます。
3. 上部チャンバーに下側チャンバーをねじ込み、その間に生体材料ディスクを固定します。
4. 組み立てられたマイクロボイデン室を70%エタノールに1時間浸して殺菌します。
5. 組み立てられたマイクロボイデンチャンバーを10分間滅菌HBSSに完全に浸し、エタノールを除去します。この洗浄手順を 2 回繰り返します。非添加培地で10分間の最終洗浄ステップを行います。
6. 6ウェルプレートのウェルで滅菌されたマイクロボイデンチャンバーを培養培地に移し、上部チャンバーが最上部であることを保証する。培養液のレベルを調整して、生体材料膜の下面に接触しますが、上部チャンバには流入しません。
7. セクション6に概説された手順を使用して角膜内皮細胞の懸濁液を調製する。懸濁液中の十分な細胞密度は、マイクロボイデンチャンバ内の膜上の^cm2あたり少なくとも100,000個の細胞の播種密度を可能にするために達成されるべきである。マイクロボイデンチャンバー内の培養表面積は0.5cm2で、容積は100μLです。したがって、500,000個の細胞/mLを含む懸濁液を調製する必要があります。
8. マイクロボイデンチャンバーの膜上に100μLの細胞懸濁液(50,000個の細胞)を入れます。培地を完全に浸水させる前に、4時間の組織培養インキュベーターでインキュベートする。培養液を必要な期間インキュベートし、培地を週2回交換する。
   注:角膜内皮細胞が生体材料膜の上面に付着すると、マイクロボイデンチャンバーは、下側チャンバーが最も上になるように培養内でうまく反転することができます。さらに多くの細胞をチャンバに加え、膜の他の表面で細胞培養を開始することができる。例えば、角膜間質細胞は、後角膜内に見られるように角膜細胞型の相対的な位置を模倣するように代替表面に容易に適用され得る。

結果

ヒトまたはヒツジ角膜から角膜内皮細胞を単離および拡張する方法を図1および図2に要約する。1〜2歳の羊の角膜または30歳未満のヒトドナーに由来するほとんどの外植植物は、1週間以内に添付因子コーティングされた組織培養プレートに付着するが、外植の3分の1までがこの時間内に付着しないことは珍しいことではない。これらの「浮遊」外植?...

ディスカッション

ヒト角膜内皮細胞の確立と拡大に関連する重要な技術的課題は、培養中にEMTが発生するのを妨げている。EMTは、細胞間接触の喪失によって角膜内皮細胞で引き起こされ得^るが、しかし、これらの細胞に対するほとんどの細胞培養プロトコルは、単一細胞の単一細胞への酵素的解離を伴う。ここでは、分離およびサブ培養段階で細胞同士の接触を最小限に抑える角膜内皮細胞?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.