JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים ומפרטים את השימוש במערכת האוטונומית הטרנסלמינרית. מערכת זו משתמשת במגזר האחורי האנושי כדי לווסת באופן עצמאי את הלחץ בתוך המקטע (תוך עיני) וסביב עצב הראייה (תוך גולגולתי) כדי ליצור שיפוע לחץ טרנסלמינארי המחקה תכונות של נוירופתיה אופטית גלאוקומטית.

Abstract

קיים צורך בלתי ממומש עדכני במודל אנושי פרה-אקליני חדש שיכול להתמקד באטיולוגיה של מחלות אקס ויו באמצעות לחץ תוך גולגולתי (ICP) ולחץ תוך עיני (IOP) שיכול לזהות פרדיגמות פתוגניות שונות הקשורות לפתוגנזה הגלאוקומה. מודלים של תרבות איברים של פרגור פלח חיצוני של Ex vivo נוצלו בעבר בהצלחה ויישמו טכנולוגיות יעילות לגילוי פתוגנזה גלאוקומה ובדיקת טיפולים. הקרנת תרופות פרה-קלינית ומחקר המבוצע על מערכות איברים אנושיים ex vivo יכול להיות מתורגם יותר למחקר קליני. מאמר זה מתאר בפירוט את הדור והתפעול של מודל לחץ טרנסלמינארי אנושי חדש שנקרא המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית (TAS). מודל TAS יכול לווסת באופן עצמאי ICP ו- IOP באמצעות מקטעים אחוריים של תורמים אנושיים. המודל מאפשר ללמוד פתוגנזה באופן פרה-אקליני. זה יכול להפחית את השימוש בבעלי חיים במחקר עיניים. בניגוד למודלים ניסיוניים במבחנה, ניתן לשמור גם על מבנה הרקמה של ראש עצב הראייה (ONH), המורכבות והשלמות במודל האקס ויוו TAS.

Introduction

הערכות עולמיות בסקרים האחרונים מצביעות על כך ש - 285 מיליון אנשים חיים עם לקות ראייה, כולל 39 מיליון עיוורים1. בשנת 2010, ארגון הבריאות העולמי תיעד כי שלושה מתוך תשעת הגורמים המובילים הרשומים לעיוורון מתרחשים בחלק האחורי של העין1. מחלות עיניים מגזר אחורי כוללות את הרשתית, choroid, עצב הראייה2. הרשתית ועצב הראייה הם הרחבות מערכת העצבים המרכזית (CNS) של המוח. האקסונים של תאי הגנגליון ברשתית (RGC) חשופים לנזק מכיוון שהם יוצאים מהעין דרך ראש עצב הראייה (ONH) כדי ליצור את עצב הראייה3. ONH נשאר הנקודה הפגיעה ביותר עבור אקסונים RGC בגלל רשת 3D של קורות רקמת חיבור בשם lamina cribrosa (LC)4. ONH הוא האתר הראשוני של עלבון אקסונים RGC בגלאוקומה5,6,7, ושינויים ביטוי גנים בתוך ONH נחקרו בדגמי יתר לחץ דם עיניים וגלאוקומה8,9,10. האקסונים של RGC רגישים ב- ONH בשל הפרשי לחץ בין התא התוך עיני, הנקרא לחץ תוך עיני (IOP), ובתוך המרחב התת-עכבישי perioptic החיצוני, הנקרא לחץ תוך גולגולתי (ICP)11. אזור LC מפריד בין שני האזורים, שמירה על הפרשי לחץ נורמליים, עם IOP הנע בין 10-21 מ"מ כ"ג ו- ICP מ 5-15 מ"מHg12. הפרש הלחץ דרך הלמינה בין שני התאים נקרא שיפוע הלחץ הטרנסלמינארי (TLPG)13. גורם סיכון מרכזי לגלאוקומה הוא IOP14 גבוה.

IOP מוגבר מגביר את העומס בתוך ומרחב אזור למינאר6,15,16. תצפיות ניסיוניות במודלים של בני אדם ובעלי חיים מציגות את ה- ONH כאתר הראשוני של נזק אקסוני17,18. הפרדיגמה הביומכנית של מתח ומתח הקשורים ל- IOP הגורמים לנזק גלאוקומה ב- ONH משפיעה גם על הפתופיזיולוגיה של גלאוקומה19,20,21. למרות שבבני אדם שינויים הנגרמים על ידי לחץ פוגעים באופן מכני ב- RGC axons22, מכרסמים חסרי לוחות קולגן בתוך הלמינה יכולים גם לפתח גלאוקומה7,23. בנוסף, IOP גבוה נשאר גורם הסיכון הבולט ביותר בחולי גלאוקומה בזווית פתוחה ראשונית, בעוד חולי גלאוקומה מתח נורמלי לפתח נוירופתיה אופטית גלאוקומה גם ללא IOP גבוה. יתר על כן, ישנם גם תת קבוצה של חולים יתר לחץ דם עינית שאינם מראים נזק עצבי הראייה. כמו כן הוצע כי לחץ נוזל השדרתי (CSFp) עשוי לשחק תפקיד פתוגנזה גלאוקומה. הראיות מצביעות על כך ICP הוא הוריד ~ 5 מ"מ כ"ג בחולי גלאוקומה בהשוואה לאנשים רגילים, ובכך גורם ללחץ טרנסלמינארי מוגבר ולשחק תפקיד מכריע במחלה24,25. בעבר, הוכח במודל כלבים, כי על ידי שליטה בשינויי IOP ו- CSFp, יכולות להיות תזוזות גדולות של הדיסק האופטי26. העלאת CSFp בעיני חזירים הראתה גם זן עיקרי מוגבר בתוך אזור LC ורקמה עצבית רטרולמינארית. עומס מוגבר על RGCs ואזור LC תורם לחסימת תחבורה אקסונית ואובדן RGCs27. ניוון פרוגרסיבי של RGCs קושר לאובדן תמיכה טרופית28,29, גירוי של תהליכים דלקתיים/ויסות חיסוני30,31, ומשפיעים אפופטוטיים29,32,33,34,35. בנוסף, פגיעה אקסונית (איור 3) גורמת להשפעות מזיקות על ה-RGCs וגורמת לכשל רגנרטיבי36,37,38,39. למרות ההשפעות של IOP נחקרו היטב, מחקר מינימלי בוצע על שינויים חריגים בלחץ טרנסלמינארי. רוב הטיפולים לגלאוקומה מתמקדים בייצוב IOP. עם זאת, למרות שהורדת IOP מאטה את התקדמות המחלה, היא אינה הופכת אובדן שדה ראייה ומונעת אובדן מוחלט של RGCs. הבנת שינויים נוירודגנרטיביים הקשורים ללחץ בגלאוקומה תהיה חיונית למניעת מוות של RGC.

הראיות הנוכחיות מצביעות על כך אפנון לחץ translaminar עקב שינויים מכניים, ביולוגיים, או פיזיולוגיים שונים בחולים הסובלים מליקויי ראייה טראומטיים או ניווניות יכול לגרום לאובדן ראייה משמעותי. נכון לעכשיו, לא קיים מודל פלח דם פרה-אקליני אמיתי שיכול לאפשר את המחקר של נזק ביומכני גלאוקומה בתוך ONH האנושי ex vivo. תצפית וטיפול בחלק האחורי של העין הוא אתגר עצום ברפואת עיניים27. ישנם מחסומים פיזיים וביולוגיים כדי למקד את העין האחורית, כולל שיעורי חיסול גבוהים, מחסום רשתית הדם, ותגובות חיסוניות פוטנציאליות40. רוב בדיקות היעילות והבטיחות למטרות סמים חדשניות מושגות תוך שימוש במודלים של תאי במבחנה ובדגמים של בעלי חיים ב-vivo41. האנטומיה העין מורכבת, ובמחקרי במבחנה אינם מחקים במדויק את המחסומים האנטומיים והפיזיולוגיים המוצגים על ידי מערכות מודל רקמות. למרות שמודלים של בעלי חיים הם הכרח למחקרים פרמקוקינטיים, הפיזיולוגיה העיןית של העין האחורית האנושית עשויה להשתנות בין מינים שונים של בעלי חיים, כולל אנטומיה תאית של הרשתית, vasculature, ו ONH41,42.

השימוש בבעלי חיים דורש תקנות אתיות אינטנסיביות ומפורטות, מחויבות פיננסית גבוהה ושחזור יעיל43. לאחרונה, הנחיות רבות אחרות התפתחו לשימוש אתי בבעלי חיים במחקר ניסיוני44,45,46. חלופה לניסויים בבעלי חיים היא שימוש במודלים של עיניים אנושיות ex vivo כדי לחקור פתוגנזה מחלות וניתוח פוטנציאלי של תרופות להגנה על נזק ONH. רקמה אנושית לאחר המוות היא משאב בעל ערך לחקר פרדיגמות מחלות אנושיות, במיוחד במקרה של מחלות ניווניות אנושיות, מכיוון שזיהוי תרופות פוטנציאליות שפותחו במודלים של בעלי חיים דורש את הצורך להיות מתורגם לבני אדם47. רקמת התורם האנושי ex vivo כבר בשימוש נרחב לחקר הפרעות אנושיות47,48,49, ומערכות תרבות איברים מגזרי קדם אנושי סיפקו בעבר מודל ex vivo ייחודי לחקור את הפתופיזיולוגיה של IOP50,51,52.

כדי לחקור לחץ טרנסלמינארי הקשור ל- IOP ו- ICP בעיני האדם, עיצבנו ופיתחנו בהצלחה מערכת אוטונומית טרנסלמינארית דו-תאית (TAS) שיכולה לווסת באופן עצמאי את IOP ו- ICP באמצעות מקטעים אחוריים מעיני תורם אנושי. זהו המודל האנושי ex vivo הראשון לחקור לחץ טרנסלמינאר ולנצל את ההשפעות הביומכניות של TLPG על ONH.

מודל זה של Ex vivo אנושי TAS יכול לשמש כדי לגלות ולסווג שינויים תאיים ותפקודיים המתרחשים עקב העלאה כרונית של IOP או ICP. בדוח זה, אנו מפרטים את הפרוטוקול שלב אחר שלב של ניתוח, הגדרה וניטור של מודל המקטע האחורי האנושי של TAS. הפרוטוקול יאפשר לחוקרים אחרים לשחזר ביעילות את מודל הקטע האחורי האנושי החדש הזה של ex vivo כדי לחקור פתוגנזה של מחלות ביומכניות.

Protocol

העיניים הושגו על פי הוראות הצהרת הלסינקי למחקר הנוגע לרקמת אדם.

הערה: עיניים מבנקים עיניים מכובדים (למשל, מכון עיניים אריות להשתלה, מחקר, טמפה FL) נקצרו בתוך 6-12 שעות של מוות סרום תורם נבדק עבור הפטיטיס B, הפטיטיס C, ווירוס כשל חיסוני אנושי 1 ו -2. ברגע שהם התקבלו, העיניים נותחו והוקמו במודל TAS בתוך 24 שעות. קריטריוני אי-הכללה כללו כל פתולוגיה עינית. העיניים לא הוחרגו על סמך גיל, גזע או מין. כדי להבטיח את הכדאיות של הרשתית עם קבלתה, explants רשתית נקצרו מתורמי הרקמות ותרברב במשך 7 ו -14 ימים (איור משלים 1). רשתיות אלה היו גם מנותקות וגדלו RGCs בריאים בתרבות במשך 7 ימים עם כתמים חיוביים עבור סמן RGC, חלבון מחייב RNA עם splicing מרובים (RBPMS), כמו גם מכתים שרשרת אור neurofilament חיובי (NEFL) כתמים neurofilaments שלהם (איור 2 משלים). .

1. הכנה ועיקור של ציוד ואספקה

  1. עיין ברשימת החומרים לקבלת רשימה מלאה של החומרים הדרושים וכן למספרי ספקים וקטלוגים.
  2. לפני השימוש, לעקר את כל הציוד והמכשירים על ידי autoclaving או באמצעות אמפולות תחמוצת אתילן.

2. הכנת מדיום זלוף

  1. הוסיפו 1% פניצילין סטרפטומיצין (10,000 פניצילין U/mL, 10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ב-0.85% NaCl) ו-1% L-גלוטמין (200 מ"ר) עד 1,000 מ"ל גלוקוז גבוה של Dulbecco שונה בגודל בינוני (DMEM).
  2. לחטא את מדיום זלוף על ידי מעבר דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.

3. מערך מערכת אוטונומית טרנסלמינארית (TAS)

  1. הגדר מזרקי זרימה (מאגרי IOP ו- ICP).
    1. הוסף 30 מ"ל של מדיום זלוף (סעיף 2) למזרק 30 מ"ל. צרף עצירה תלת-כיוונית למזרק 30 מ"ל. צרף מסנן הידרופילי 0.22 מיקרומטר לעצירה תלת כיוונית. חבר מתאם ספח 15 G Luer למסנן ההידרופילי 0.22 מיקרומטר.
    2. הסר בועות אוויר מהגדרת המזרק. חברו צינורות למתאם 15 G Luer Stub. סגור את היציאה הצדדית של הסטופקוק עם מכסה מנעול אוניברסלי שלא הומצא. חזור על הפעולה עבור שתי הגדרות בסך הכל.
    3. סמן מזרק אחד כלחץ תוך גולגולתי של ערוץ 1 (CH1 ICP) והמזרק השני כלחץ תוך עיני של ערוץ 2 (CH2 IOP).
  2. הגדר מזרקי זרימה (מאגרי IOP ו- ICP).
    1. צרף עצירה תלת-כיוונית למזרק של 30 מ"ל. חבר מתאם ספח 15 G Luer לתחנה תלת-כיוונית. חברו צינורות למתאם 15 G Luer Stub.
    2. סגור את היציאה הצדדית של הסטופקוק עם מכסה מנעול אוניברסלי שלא הומצא. חזור על הפעולה עבור שתי הגדרות בסך הכל. סמן מזרק אחד כ- CH1 ICP ואת המזרק השני כ- CH2 IOP.

4. הכנת כדור הארץ כולו האנושי

הערה: אם מתקבלות עיניים שלמות, בצע את ההליך שלהלן כדי להפריד את המקטע הקדמי מהקטע האחורי של העין. אם העיניים מתקבלות חוצה, להתחיל בשלב 4.4.

  1. מניחים עין שלמה לתוך פתרון פוידון-יוד במשך 2 דקות.
  2. יש לשטוף את העין בתמיסה סטרילית של פוספט (PBS) כדי לשטוף את הפובידון-יוד. חזור פעמיים.
  3. הסר את adnexa מכל כדור העין באמצעות מלקחיים ומספריים. חתחו את העין בקו המשווה כדי להפריד בין המקטעים הקדמיים והאחוריים של העין.
  4. הסר את נדן עצב הראייה. הסר את ההומור הזגג מהקטע האחורי.
  5. גזור סקלרה נוספת ממקטע אחורי, במידת הצורך, כדי להבטיח התאמה טובה בכיפה העגולה של תא IOP (התחתון). באמצעות מלקחיים, ודא כי הרשתית מפוזרת באופן שווה על החלק האחורי של המקטע.
  6. הגדרת תא IOP (תחתון)
    1. מקם את המקטע האחורי האנושי לתוך תא IOP (התחתון) של TAS מעל הכיפה העגולה עם עצב הראייה מול החלק העליון.
    2. אטמו את המקטע האחורי באמצעות טבעת השרף אפוקסי עם ארבעה ברגים, והבטיחו אטם הדוק.
    3. הכנס את הצינורות ליציאות IN ו- OUT של תא IOP (התחתון). מזרק הזרימה של IOP עם צינורות המכילים מדיום מוכנס ליציאת IN ומזרק היציאה הריק של IOP עם צינורות מוכנס ליציאת OUT.
    4. השתמש בשיטת הדחיפה / משיכה כדי להחדיר לאט את מדיום ההזדוה ליציאת הזרימה כדי למלא את העין האחורית ובו זמנית מושך לאט את המדיום זלוף החוצה דרך המזרק החוצה כדי להסיר את כל בועות האוויר מן הקווים. להפסיק להחדיר מדיום פעם הן IN ו OUT צינורות ריקים של בועות אוויר.
    5. תנעלו את העצירה במצב כבוי. הסר את המזרק 30 מ"ל מהרכבת מסנן היציאה IOP IN ומלא מחדש ב- 30 מ"ל של בינוני. החלף את המזרק של 30 מ"ל בהרכבה של המסנן.
  7. הגדרת תא ICP (למעלה)
    1. הנח את התא /מכסה של ICP (עליון) מעל החלק האחורי של המקטע האחורי. ודא כי עצב הראייה נמצא בתוך התא העליון. לאטום את התא העליון עם ארבעה ברגים.
    2. הכנס את הצינורות ליציאות IN ו- OUT של תא ICP (למעלה). מזרק הזרימה של ICP עם צינורות המכילים מדיום מוכנס ליציאת IN ומזרק היציאה הריק של ICP עם צינורות מוכנס ליציאת OUT.
    3. החדירו בעדינות ובאיטיות את המדיום ליציאת IN כדי למלא את תא ה-ICP ולהסיר בועות אוויר מהקווים בשיטת הדחיפה/משיכה. הפסק להחדיר מדיום פעם תא ICP, כמו גם צינורות IN ו- OUT הם ריקים של בועות אוויר.
    4. תנעלו את העצירה במצב כבוי. הסר את המזרק של 30 מ"ל מה- ICP בהרכבה של מסנן היציאה ומלא מחדש ב- 30 מ"ל של בינוני. החלף את המזרק של 30 מ"ל בהרכבה של המסנן.

5. הגדרת מערכת הקלטת נתונים

הערה: מערכת הקלטת הנתונים מורכבת ממקור כוח בן 8 ערוצים, מגבר גשר רב ערוצי, מתמרים ללחץ הידרוסטטי ומחשב עם תוכנת רכישת נתונים (ראה טבלת חומרים). להלן תיאורים של אופן ההגדרה וכיול המערכת.

  1. חבר את כבל החשמל לחלק האחורי של מקור החשמל בן 8 הערוצים וחבר להתקן גיבוי סוללה.
  2. חבר את כבל ה- USB ממקור החשמל בן 8 הערוצים לחלק האחורי של המחשב.
  3. חבר את מקור החשמל בן 8 הערוצים למגבר הגשר הרב-ערוצי באמצעות כבל I2C שסופק.
  4. חבר את כבלי כידון ניל-קונסלמן (BNC) לכניסות הערוץ מול מקור הכוח בן 8 הערוצים וסוף הכבלים לערוצים המתאימים בחלק האחורי של המגבר הרב-ערוצי.
  5. חבר את כבלי המתמר לחזית המגבר הרב-ערוצי.
  6. התקן את תוכנת רכישת הנתונים במחשב.
    1. הפעל את מתקין התקנת התוכנה לרכישת נתונים מתקליטור התוכנה שסופק.
    2. בצע את ההוראות המופיעות על מסך המחשב.
    3. לאחר השלמת ההתקנה, בחר סיום.
  7. הפעל את מקור הכוח בן 8 הערוצים.
  8. הפעל את המחשב ופעיל את תוכנת רכישת הנתונים.
    1. בחירת | קבצים חדש.
    2. בחר | התקנה הגדרות ערוץ. בחר שלושה ערוצים (מימין למטה למסך). בעמודה כותרת ערוץ שנה את שם הערוצים באופן הבא: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. בחר 2 mV עבור הטווח בכל הערוצים. בעמודה חישוב בחר ללא חישוב עבור ערוצים 1 ו- 2.
    4. בעמודה חישוב בחר אריתמטי עבור ערוץ 3. במקטע נוסחה : בחר ערוצים/CH2; בחר חשבון "-"; בחר ערוצים/CH1. במקטע פלט בחר mmHg. בחר אישור. בחר שוב אישור .
  9. תקימו וכיילו את מתמרי הלחץ ההידרוסטטיים.
    הערה: יש לכייל מתמרי לחץ הידרוסטטיים לפני ניסויים בשיטה הבאה.
    1. חבר את מתמרי הלחץ ההידרוסטטיים לקווי המתמר המחוברים למגבר הגשר הרב-ערוצי.
    2. חבר מזרק 30 מ"ל מלא באוויר ליציאה הצדדית של מתמר הלחץ CH1 (ICP). חבר את ה- sphygmomanometer לתחתית מתמר הלחץ CH1 (ICP).
    3. בתרשים, הצג את הדף של תוכנת רכישת הנתונים, הגדר את מהירות הדגימה על-ידי לחיצה שמאלית על החץ לצד זמן הדגימה ובחר 100. לאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני באזור CH1 (ICP) של הדף.
    4. בחר מגבר גשר. בחר מסנן ראשי. בחר אפס והמתן עד שהמערכת תתאפס, תוך דאגה לא להזיז את מתמר הלחץ.
    5. צבוט את הכרטיסיות הלבנות של מתמר הלחץ ולדחוף אוויר דרך המתמר עד 40 מ"מ כ"ג מתקבל על sphygmomanometer. שחררו את הכרטיסיות הלבנות והסירו את המזרק והפיגמומנומטר.
    6. בדף המרת יחידות , בחר 'מינוס (-)'. הדגש את הרמה הגבוהה ביותר כדי לציין 40 מ"מ כ"ג. לחץ על החץ עבור נקודה 1 והזן 40.
    7. סמן את הרמה הנמוכה ביותר כדי לציין 0 מ"מ כ"ג. לחץ על החץ עבור נקודה 2 והזן 0. בחר mmHg עבור היחידות. בחר אישור.
    8. בחר אישור (עמוד מגבר גשר). חזור על שלבים 9.1-9.7 עבור CH2 (IOP) באמצעות 100 מ"מ כ"ג לרמה הגבוהה ביותר ו- 0 לרמה הנמוכה ביותר.
  10. חבר את יחידת המקטע TAS/אחורי למערכת רכישת הנתונים.
    1. מקם את יחידת המקטע TAS /אחורי לתוך אינקובטור (37 °C (37 °C, 5% CO2). חבר את צינורות ICP מיציאת OUT למתמר הלחץ CH1 (ICP).
    2. חבר את צינורות IOP מיציאת OUT למתמר הלחץ CH2 (IOP).
    3. חבר את הגדרות המזרק (ICP ו- IOP) עם בינוני מיציאות IN למעמד הטבעת.
    4. בדף תצוגת תרשים בחר התחל דגימה. הגדר את מהירות הדגימה על-ידי לחיצה שמאלית על החץ לצד זמן הדגימה ובחר איטי ודקה אחת.
    5. התאם את המזרקים על הטבעת לעמוד למעלה או למטה כדי לווסת את לחצי ICP ו- IOP לדרישות פרוטוקול.
    6. בצע חידוש מערכתי של בינוני במערכת כל 48-72 שעות באמצעות שיטת הדחיפה והמשיכה.

6. אחזור וניתוח נתונים

  1. פתח את קובץ הנתונים בתוכנת רכישת הנתונים.
  2. במקטע לוח נתונים , לחץ על סמל הוספה מרובה למשטח נתונים . יופיע חלון חדש.
    1. במקטע חפש שימוש בחר שעה מהתפריט הנפתח.
    2. במקטע בחר בחר שעה אחת כל שעה מהתפריטים הנפתחים.
    3. במקטע שלב דרכה בחר קובץ שלם ולאחר מכן לחץ על הוסף.
  3. במקטע לוח נתונים לחץ על סמל תצוגת לוח נתונים . סמן את כל הנתונים והעתק/הדבק בגיליון אלקטרוני.
  4. חשב את הממוצע ואת סטיות התקן עבור IOP, ICP ו- TLPG עבור כל 24 שעות. איסוף הנתונים באמצעות אפשרות טבלת הציר בתוכנית גיליון אלקטרוני ובגרף.

7. אימונוהיסטוכימיה והמטוקסילין והכתמת אאוזין של מקטעים אחוריים

  1. הסר את מקטעי העיניים האחוריים בעקבות נקודות זמן שונות מדגם TAS ותקן פורמלין לפני paraffinizing.
  2. תחלק את העיניים כדי לייצר מישורי רקמת קשת.
  3. דפראפין להפוך את פלחי פרפין משובץ עם 100% קסילן, 95% אתנול, 50% תמיסת אתנול.
  4. לשטוף את השקופיות עם PBS במשך 10 דקות ולחסום עם חוצץ חסימה בטמפרטורת החדר במשך 1 שעה.
  5. מקטעי תוויות עם נוגדנים עיקריים: סמן אנטי קולגן IV (מטריצה חוץ-תאית (ECM), NB120-6586, 1:100) ואנטי למינין (סמן ECM, NB300-144, 1:100, אנטי RBPMS (סמן RGC), GTX118619, 1:50).
  6. זהה את הנוגדנים העיקריים באמצעות נוגדנים משניים Alexa Fluor (אלכסה פלור 488 אנטי ארנב עז, A11008, 1:500).
  7. תטעה את גרעיני התא באמצעות פתרון נגד עמעום DAPI.
  8. צלם תמונות של המקטעים המוכתמים ותמונות הפאזה עם עדשות אובייקטיביות 4x ו- 10x באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלה של חומרים).
  9. להכתמת המטוקסילין ואוסין (H&E), עבדו את המקטעים במערכת כתמים אוטומטית (ראו טבלת חומרים) לדפראפיזציה באמצעות 100%, קסילן 95% אתנול, 50% תמיסת אתנול וכתם עם H&E.
  10. צלם תמונות באמצעות עדשות המטרה 4x ו- 10x באמצעות מיקרוסקופ עם מקור אור שדה בהיר.

תוצאות

תכנון ויצירה של המערכת האוטונומית הטרנסלמינרית
דיפרנציאל לחץ טרנסלמינארי הוא מנגנון מפתח פוטנציאלי בפתוגנזה של מחלות שונות, כולל גלאוקומה. השימושים במודל המתואר כוללים, אך אינם מוגבלים, את המחקר של גלאוקומה (IOP גבוה, אולי ירידה ICP), פגיעה מוחית טראומטית (ICP גבוה), וחשיפה ארוכת טוו...

Discussion

רקמות אנושיות לאחר המוות הן משאב בעל ערך מיוחד לחקר מחלות ניווניות אנושיות מכיוון שזיהוי תרופות פוטנציאליות שפותחו במודלים של בעלי חיים צריך להיות מתורגם לבני אדם47. ההשפעות של העלאת IOP אנושית מבוססות היטב, אבל מחקר מינימלי בוצע על שינויים חריגים בלחץ TRANSLAMINAR ONH. למרות שקיימים ?...

Disclosures

למחברי כתב היד אין ניגוד אינטרסים פוטנציאלי לחשוף.

Acknowledgements

המימון לפרויקט זה היה באמצעות כספים לפי שיקול דעתה של ד"ר קולין מ. מקדואל. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק בלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון, Inc. למחלקת UW מדיסון לרפואת עיניים ומדעי הראייה. אנו מודים לד"ר אבוט פ. קלארק ווימינג מאו על הסיוע הטכני שלהם במודל תרבות האיברים. אנו מודים למכון העיניים של האריות להשתלה ומחקר (טמפה, FL) על מתן עיני התורם האנושי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)AmazonB000FMYRHK
30 mL Syringes without NeedleVitality Medical302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented CapQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriverBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167-100EA 
Corning L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Fine ForcepsF.S.T.11254-20
Eye Scissors Standard CurvedKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri DishesCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen ContainersFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and ClearQosina28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rateAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscopeKeyenceB2-X710
LabChart 8AD instrumentsLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, WhiteQOSINA65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)AD instrumentsFE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT MaleMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 PipeMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Surgical Scissors - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth CurvedKatenaK5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & PlasticsB1000-030

References

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. . Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

158

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved