JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Translaminer otonom sistemin kullanımını açıklar ve detaylandırırız. Bu sistem, glaukomöz optik nöropatinin özelliklerini taklit eden translaminer basınç gradyanı oluşturmak için segmentin içindeki basıncı (göz içi) ve optik siniri (intrakraniyal) çevreleyen basıncı bağımsız olarak düzenlemek için insan arka segmentini kullanır.

Özet

Glokom patogenez ile ilgili çeşitli patojenik paradigmaları tanımlayabilen intrakraniyal basınç (ICP) ve göz içi basıncı (Gİb) kullanarak hastalık etiyolojisi ex vivo'yu hedef alabilen yeni bir preklinik insan modeline karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Ex vivo insan ön segment perfüzyon organ kültürü modelleri daha önce glokom patogenezinin keşfi ve terapötiklerin test edilmesi için etkili teknolojiler olarak başarıyla kullanılmıştır ve uygulanmıştır. Ex vivo insan organ sistemleri üzerinde yapılan preklinik ilaç taraması ve araştırmaları klinik araştırmalara daha fazla çevrilebilir. Bu makalede translaminar otonom sistem (TAS) adı verilen yeni bir ex vivo insan translaminer basınç modelinin üretimi ve çalışması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. TAS modeli, insan donör arka segmentlerini kullanarak ICP ve Gİb'i bağımsız olarak düzenleyebilir. Model, patogenezin preklinik bir şekilde incelenmesine izin verir. Oftalmik araştırmalarda canlı hayvanların kullanımını azaltabilir. In vitro deneysel modellerin aksine, optik sinir kafası (ONH) doku yapısı, karmaşıklığı ve bütünlüğü ex vivo TAS modeli içinde de korunabilir.

Giriş

Son anketlerdeki küresel tahminler, 39 milyon'ı görme engelli olmak üzere 285 milyon kişinin görme bozukluğuyla yaşadığını gösteriyor1. 2010 yılında, Dünya Sağlık Örgütü, listelenen dokuz önde gelen körlük nedenlerinden üçünün gözün arka segmentinde meydana geldiğini belgeledi1. Arka segment göz hastalıkları retina, koroid ve optik siniri içerir2. Retina ve optik sinir beynin merkezi sinir sistemi (CNS) uzantılarıdır. Retina ganglion hücresi (RGC) aksonları, optik siniri oluşturmak için optik sinir başlığından (ONH) gözden çıktıkları için hasara karşı savunmasızdır3. ONH, lamina cribrosa (LC)4 adı verilen bağ dokusu ışınlarının 3D mesh çalışması nedeniyle RGC aksonları için en savunmasız nokta olmaya devam etmektedir. ONH, glokomda RGC aksonlarına hakaretin ilk yeridir5,6,7 ve ONH içindeki gen ekspresyon değişiklikleri oküler hipertansiyon ve glokom modellerinde çalışılmıştır8,9,10. RGC aksonları, göz içi basıncı (Gİb) olarak adlandırılan göz içi bölmesi arasındaki basınç farkları ve intrakraniyal basınç (ICP)11 adı verilen dış perioptik subaraknoid alanı içindeki basınç farkları nedeniyle ONH'de hassastır. LC bölgesi, 10-21 mmHg ve ICP arasında değişen Gİb ile normal basınç farklarını koruyarak her iki alanı da ayırır ve 5-15 mmHg12 arasında değişen bir değere sahiptir. İki oda arasındaki lamina arasındaki basınç farkına translaminer basınç gradyanı (TLPG)13 denir. Glokomun önemli bir risk faktörü yüksek IOP14'tür.

Artan Gİb, laminar bölge içindeki ve genelindeki gerginliği artırır6,15,16. İnsanlarda ve hayvan modellerinde deneysel gözlemler ONH'yi aksonal hasarın ilk bölgesi olarak göstermektedir17,18. ONH'de glaukom hasarına neden olan Gİb ile ilgili stres ve suşun biyomekanik paradigması da glokomun patofizyolojisini etkiler19,20,21. İnsanlarda basınç kaynaklı değişiklikler RGC axons22'ye mekanik olarak zarar verse de, lamina içinde kollajen plakaları olmayan kemirgenler de glokom geliştirebilir7,23. Ayrıca, yüksek Gİb primer açık açılı glokom hastalarında en belirgin risk faktörü olmaya devam ederken, normal gerilim glokom hastalarında yüksek Gİb olmasa bile glaukom optik nöropati gelişir. Ayrıca, optik sinir hasarı göstermeyen oküler hipertansif hastaların bir alt kümesi de vardır. Ayrıca beyin omurilik sıvı basıncının (CSFp) glokom patogenezinde rol oynayabileceği ileri sürülmektedir. Kanıtlar, GLOKOM hastalarında ICP'nin normal bireylere göre ~5 mmHg'ye düşürüldüğü ve böylece translaminer basıncın artmasına neden olduğu ve hastalıkta önemli bir rol oynadığı göstermektedir24,25. Daha önce, bir köpek modelinde, Gİb ve CSFp değişikliklerini kontrol ederek, optik diskin büyük yer değiştirmeleri olabileceği gösterilmiştir26. Porcine gözlerde CSFp'nin yükseltilmesi, LC bölgesi ve retrolaminer sinir dokusunda da artmış ana zorlanma göstermiştir. RGC'ler ve LC bölgesi üzerindeki artan yük, aksonal taşıma tıkanıklığı ve RGC'lerin kaybına katkıda bulunur27. RGC'lerin progresif dejenerasyonu trofik destek kaybı28,29, inflamatuar süreçlerin/immün regülasyonun uyarılması30,31 ve apoptotik efektörler29,32,33,34,35 ile ilişkilendirilmiştir. Ek olarak, aksonal yaralanma (Şekil 3) RPC'ler üzerinde zararlı etkilere neden olur ve rejeneratif başarısızlığı tetikler36,37,38,39. Gİb'in etkileri iyi çalışılmış olsa da anormal translaminer basınç değişimleri üzerinde minimal araştırma gerçeklenmiştir. Glokom için çoğu tedavi Gİb stabilize odaklanır. Bununla birlikte, Gİb'in düşürülmesi hastalığın ilerlemesini yavaşlatsa da, görme alanı kaybını tersine çevirmez ve RGC'lerin tam kaybını önlemez. Glokomda basınca bağlı nörodejeneratif değişiklikleri anlamak RGC ölümünü önlemek için çok önemli olacaktır.

Mevcut kanıtlar, travmatik veya nörodejeneratif görme bozukluklarından muzdarip hastalarda çeşitli mekanik, biyolojik veya fizyolojik değişikliklere bağlı translaminer basınç modülasyonlarının önemli görme kaybına neden olabileceğini göstermektedir. Şu anda, ex vivo insan ONH içinde glaukomöz biyomekanik hasarın incelenmesine izin verebilecek gerçek bir preklinik insan posterior segment modeli yoktur. Gözün arka segmentinin gözlemlenmesi ve tedavisi oftalmolojide büyük bir zorluktur27. Yüksek eliminasyon oranları, kan-retina bariyeri ve potansiyel immünolojik yanıtlar da dahil olmak üzere arka gözü hedeflemek için fiziksel ve biyolojik engeller vardır40. Yeni ilaç hedefleri için çoğu etkinlik ve güvenlik testi in vitro hücresel ve in vivo hayvan modelleri kullanılarak gerçekleştirilir41. Oküler anatomi karmaşıktır ve in vitro çalışmalar doku modeli sistemlerinin sunduğu anatomik ve fizyolojik engelleri doğru bir şekilde taklit etmez. Hayvan modelleri farmakokinetik çalışmalar için bir gereklilik olsa da, insan arka gözünün oküler fizyolojisi retinanın hücresel anatomisi, vaskülat ve ONH41,42 dahil olmak üzere çeşitli hayvan türleri arasında değişebilir.

Canlı hayvanların kullanımı yoğun ve ayrıntılı etik düzenlemeler, yüksek finansal bağlılık ve etkili tekrarlanabilirlik gerektirir43. Son zamanlarda, deneysel araştırmalarda hayvanların etik kullanımı için birden fazla kılavuz ortaya çıktı44,45,46. Hayvan testlerine bir alternatif, hastalık patogenezini araştırmak için ex vivo insan gözü modellerinin kullanılması ve ONH hasarını korumak için ilaçların potansiyel analizidir. İnsan ölüm sonrası dokusu, özellikle insan nörodejeneratif hastalıkları durumunda insan hastalığı paradigmalarını incelemek için değerli bir kaynaktır, çünkü hayvan modellerinde geliştirilen potansiyel ilaçların tanımlanması insanlara çevrilebilir olma ihtiyacını gerektirir47. Ex vivo insan donör dokusu, insan bozukluklarının incelenmesi için yoğun olarak kullanılmıştır47,48,49 ve insan ön segment perfüzyon organ kültürü sistemleri daha önce yükseltilmiş Gİb50,51,52 patofizyolojisini incelemek için benzersiz bir ex vivo modeli sağlamıştır.

İnsan gözünde Gİb ve ICP ile ilgili translaminer basıncı incelemek için, insan donör gözlerinden arka segmentleri kullanarak Gİb ve ICP'yi bağımsız olarak düzenleyebilen iki odalı bir translaminer otonom sistem (TAS) tasarladık ve geliştirdik. Translaminer basıncı inceleyen ve TLPG'nin ONH üzerindeki biyomekanik etkilerinden yararlanan ilk ex vivo insan modelidir.

Bu ex vivo insan TAS modeli keşfetmek ve IOP veya ICP kronik yükseklik nedeniyle meydana gelen hücresel ve fonksiyonel modifikasyonları sınıflandırmak için kullanılabilir. Bu raporda, TAS insan posterior segment modelinin parçalanması, kurulması ve izlenmesinin adım adım protokolünü detaylandırıyoruz. Protokol, diğer araştırmacıların biyomekanik hastalık patogenezini incelemek için bu yeni eks vivo basınçlı insan posterior segment modelini etkili bir şekilde yeniden üretmelerine izin verecektir.

Protokol

Gözler, insan dokusunu içeren araştırmalar için Helsinki Bildirgesi hükümlerine göre elde edildi.

NOT: Saygın göz bankalarının gözleri (örneğin, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) 6-12 saat içinde hasat edildi ve donör serum hepatit B, hepatit C ve insan immün yetmezlik virüsü 1 ve 2 için test edildi. Alındıktan sonra, gözler 24 saat içinde TAS modelinde parçalandı ve kuruldu. Dışlama kriterleri herhangi bir oküler patolojiyi içeriyordu. Gözler yaşa, ırka veya cinsiyete göre dışlanmadı. Retinanın alındıktan sonra yaşayabilirliğini sağlamak için doku donörlerinden retina eksplantları toplanmış ve 7 ve 14 gün boyunca kültüre edilmiştir (Ek Şekil 1). Bu retinalar ayrıca RGC belirteci için pozitif lekelenme, çoklu birleştirme (RBPMS) ile RNA bağlayıcı protein ve nörofilamentlerinde pozitif nörofilament ışık zinciri (NEFL) lekelenmesi ile 7 gün boyunca kültürde sağlıklı RGC'ler uzadı ve büyüdü (Ek Şekil 2). .

1. Ekipman ve malzemelerin hazırlanması ve sterilizasyonu

  1. Tedarikçi ve katalog numaralarının yanı sıra gerekli malzemelerin tam listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.
  2. Kullanmadan önce, etilen oksit ampulleri otoklavlayarak veya kullanarak tüm ekipman ve aletleri sterilize edin.

2. Perfüzyon ortamının hazırlanması

  1. 1.000 mL yüksek glikoz Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'una (DMEM) %1 penisilin streptomisin (10.000 U/mL penisilin, %0.85 NaCl'de 10.000 μg/mL streptomisin) ve %1 L-glutamin (200 mM) ekleyin.
  2. Perfüzyon ortamını 0,22 μm filtreden geçirerek sterilize edin.

3. Translaminar otonom sistem (TAS) kurulumu

  1. Giriş şırınglarını (Gİb ve ICP rezervuarları) ayarlayın.
    1. 30 mL şırındıya 30 mL perfüzyon ortamı (bölüm 2) ekleyin. 30 mL şırınna 3 yönlü bir stopcock takın. 3 yönlü stopcock'a 0,22 μm hidrofilik filtre takın. 0,22 μm hidrofilik filtreye 15 G Luer saplama adaptörü takın.
    2. Şırınd kurulumundan hava kabarcıklarını çıkarın. Boruyu 15 G Luer saplama adaptörüne takın. Stopcock'un yan portunun yanını düzensiz bir evrensel kilit kapağı ile kapatın. Toplam iki kurulum için yineleyin.
    3. Bir şırıng kanal 1 intrakraniyal basınç (CH1 ICP) ve diğer şırıng kanal 2 göz içi basıncı (CH2 Gİb) olarak etiketlenin.
  2. Çıkış şırıngırlarını (Gİb ve ICP rezervuarları) ayarlayın.
    1. 30 mL şırınna 3 yönlü bir stopcock takın. 3 yönlü stopcock'a 15 G Luer saplama adaptörü takın. Boruyu 15 G Luer saplama adaptörüne takın.
    2. Stopcock'un yan portunun yanını düzensiz bir evrensel kilit kapağı ile kapatın. Toplam iki kurulum için yineleyin. Bir şırınnayı CH1 ICP, diğer şırındıcıyı CH2 Gİb olarak etiketle.

4. İnsan tüm göz küresinin hazırlanması

NOT: Tüm gözler alınırsa, ön segmenti gözün arka kısmından ayırmak için aşağıdaki prosedürü izleyin. Gözler ikiye bölünmüş olarak alınırsa, 4.4.

  1. Tüm bir gözü 2 dakika boyunca povidone-iyot çözeltisine yerleştirin.
  2. Povidon-iyotunu durulamak için gözü steril fosfat tamponlu çözeltide (PBS) durulayın. 2 kez tekrarlayın.
  3. Apartma ve makas kullanarak adnexa'yı tüm göz küresinden çıkarın. Gözün ön ve arka bölümlerini ayırmak için ekvatorda gözü ikiye ayırın.
  4. Optik sinir kılımını çıkarın. Vitreus mizahını arka segmentten çıkarın.
  5. Gİb (alt) odasının yuvarlak kubbesine iyi bir uyum sağlamak için gerekirse arka segmentten ek sklera kırpın. Forseps kullanarak, retinanın segmentin arka kısmına eşit olarak yayıldığından emin olun.
  6. Gİb (alt) oda yapısı
    1. İnsan arka segmentini, optik sinir üstte olacak şekilde yuvarlak kubbenin üzerindeki TAS'ın Gİb (alt) odasına yerleştirin.
    2. Epoksi reçine O-halkasını kullanarak arka segmenti dört vida ile kapatın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın.
    3. Boruyu Gİb (alt) haznesinin IN ve OUT bağlantı noktalarına yerleştirin. Orta içeren borulu Gİb giriş şırınnası IN portuna, boş Gİb çıkış şırınnası ise borulu outflow şırınnası OUT portuna yerleştirilir.
    4. Perfüzyon ortamını giriş noktasına yavaşça demlenerek arka göz kabını doldurmak için itme/çekme yöntemini kullanın, aynı zamanda perfüzyon ortamını çıkış şırıncığından yavaşça çekerek hatlardan hava kabarcıklarını çıkarın. Hem IN hem de OUT tüpleri hava kabarcıkları boşluğuna girdikten sonra ortam infüze etmeyi bırakın.
    5. Stopcock'ları kapalı konuma kilitleyin. 30 mL şırınnayı IOP IN port filtre tertibatından çıkarın ve toplam 30 mL orta ile yeniden doldurun. 30 mL şırınnayı filtre tertibatına değiştirin.
  7. ICP (üst) oda kurulumu
    1. ICP (üst) haznesini/kapağı arka segmentin arkasına yerleştirin. Optik sinirin üst bölmede olduğundan emin olun. Üst hazneyi dört vida ile kapatın.
    2. Boruyu ICP (üst) haznesinin IN ve OUT bağlantı noktalarına yerleştirin. Orta içeren borulu ICP giriş şırınnası IN portuna, boş ICP çıkış şırınnası ise out portuna yerleştirilir.
    3. ICP haznesini doldurmak ve itme/çekme yöntemini kullanarak hava kabarcıklarını hatlardan çıkarmak için ortamı IN bağlantı noktasına hafifçe ve yavaşça demleyin. ICP odasının yanı sıra hem IN hem de OUT boruları hava kabarcıkları geçersiz olduğunda orta demlemeyi durdurun.
    4. Stopcock'ları kapalı konuma kilitleyin. 30 mL şırınnayı bağlantı noktası filtre tertibatında ICP'den çıkarın ve toplam 30 mL orta ile yeniden doldurun. 30 mL şırınnayı filtre tertibatına değiştirin.

5. Veri kayıt sistemi kurulumu

NOT: Veri kayıt sistemi 8 kanallı bir güç kaynağı, çok kanallı köprü amplifikatörü, hidrostatik basınç dönüştürücüleri ve veri toplama yazılımına sahip bir bilgisayardan oluşur (bkz. Malzeme Tablosu). Aşağıda sistemin nasıl ayarlandırılacağı ve kalibreılacağı açıklanmaktadır.

  1. Güç kablosunu 8 kanallı güç kaynağının arkasına bağlayın ve bir pil yedekleme cihazına takın.
  2. USB kablosunu 8 kanallı güç kaynağından bilgisayarın arkasına bağlayın.
  3. Birlikte verilen I2C kablosunu kullanarak 8 kanallı güç kaynağını çok kanallı köprü amplifikatörüne bağlayın.
  4. Bayonet Neill-Concelman (BNC) kablolarını 8 kanallı güç kaynağının önündeki kanal girişlerine ve kabloların ucunun ucuna çok kanallı amplifikatörün arkadaki ilgili kanallara bağlayın.
  5. Dönüştürücü kablolarını çok kanallı amplifikatörün önüne bağlayın.
  6. Veri toplama yazılımını bilgisayara yükleyin.
    1. Veri alma yazılımı kurulum yükleyicisini sağlanan yazılım CD'sinden çalıştırın.
    2. Bilgisayar ekranındaki yönergeleri izleyin.
    3. Yükleme tamamlandığında Son'u seçin.
  7. 8 kanallı güç kaynağını açın.
  8. Bilgisayarı açın ve veri toplama yazılımını başlatın.
    1. Dosya | Seç Yeni.
    2. Kur | Seç Kanal Ayarları. Üç kanal seçin (ekranın sol alt kısmı). Kanal Başlığı sütununda kanalları aşağıdaki gibi yeniden adlandırın: CH1 ICP; CH2 Gİb; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Tüm kanallarda Aralık için 2 mV seçin. Hesaplama sütununda 1 ve 2 numaralı kanallar için Hesaplama Yok'u seçin.
    4. Hesaplama sütununda Kanal 3 için Aritmetik'i seçin. Formül bölümünde: Kanalları/CH2'yi seçin; Aritmetik "-" seçeneğini belirleyin; Kanalları/CH1'i seçin. Çıktı bölümünde mmHg'yi seçin. Tamam'ı seçin. Yeniden Tamam'ı seçin.
  9. Hidrostatik basınç dönüştürücülerini kurun ve kalibre edin.
    NOT: Hidrostatik basınç dönüştürücüleri deneylerden önce aşağıdaki yöntem kullanılarak kalibre edilmelidir.
    1. Hidrostatik basınç dönüştürücülerini çok kanallı köprü amplifikatörüne bağlı dönüştürücü hatlarına bağlayın.
    2. CH1 (ICP) basınç dönüştürücüsün yan bağlantı noktasına hava dolu 30 mL şırınna takın. Sfigmomanometreyi CH1 (ICP) basınç dönüştürücüsunun altına takın.
    3. Grafikte, veri toplama yazılımının sayfasını görüntüleyin, örnekleme süresinin yanındaki oku sol tıklatarak örnekleme hızını ayarlayın ve 100'ü seçin. Ardından sayfanın CH1 (ICP) alanını sağ tıklatın.
    4. Köprü Amplifiktörü'nü seçin. Şebeke Filtresi'ni seçin. Sıfır'ı seçin ve basınç dönüştürücüslerini hareket ettirmemeye dikkat ederek sistemin sıfıra inmesini bekleyin.
    5. Basınç dönüştürücüslerinin beyaz sekmelerini sıkıştırın ve sfigmomanometrede 40 mmHg elde edilene kadar havayı dönüştürücüden geçirin. Beyaz sekmeleri bırakın ve şırınnak ve sfigmomanometreyi çıkarın.
    6. Birim Dönüştürme sayfasında 'eksi (-)' işaretini seçin. 40 mmHg'yi göstermek için en yüksek platoyu vurgulayın. Nokta 1 için Ok'a tıklayın ve 40 girin.
    7. 0 mmHg'yi belirtmek için en düşük platoyu vurgulayın. Nokta 2 için Ok'a tıklayın ve 0 girin. Birimler için mmHg'yi seçin. Tamam'ı seçin.
    8. Tamam'ı seçin (Köprü Amp sayfası). En yüksek plato için 100 mmHg ve en düşük plato için 0 kullanarak CH2 (Gİb) için 9,1–9,7 adımlarını yineleyin.
  10. TAS/posterior segment birimini veri toplama sistemine bağlayın.
    1. TAS/posterior segment ünitesini bir inkübatöre yerleştirin (%37 °C, %5 CO2). ICP boruyu OUT bağlantı noktasından CH1 (ICP) basınç dönüştürücüse takın.
    2. Gİb borularını OUT bağlantı noktasından CH2 (Gİb) basınç dönüştürücüse takın.
    3. Şırınd kurulumlarını (ICP ve Gİb) IN bağlantı noktalarından halka standına orta ile takın.
    4. Grafik görünümü sayfasında Örneklemesi Başlat'ı seçin. Örnekleme süresinin yanındaki oku sol tıklatarak örnekleme hızını ayarlayın ve Yavaş ve 1 dk'yı seçin.
    5. ICP ve Gİb basınçlarını protokol gereksinimlerine göre düzenlemek için halka standındaki şırınnaları yukarı veya aşağı ayarlayın.
    6. İtme ve çekme yöntemiyle her 48-72 saat içinde sistemdeki ortamın sistemik ikmalini gerçekleştirin.

6. Veri alma ve analiz

  1. Veri toplama yazılımında veri dosyasını açın.
  2. Veri Defteri bölümünde, Veri Defterine Çoklu Ekle simgesine tıklayın. Yeni bir pencere görünecektir.
    1. Kullanarak Bul bölümünde, açılan menüden Zaman'ı seçin.
    2. Seç bölümünde açılır menülerden her 1 saatte bir 1 saat seçin.
    3. Adım Adım bölümünde Tüm Dosya'yı seçin ve Ekle'yi tıklatın.
  3. Veri Defteri bölümünde Veri Defteri Görünümü simgesine tıklayın. Tüm verileri vurgulayın ve elektronik tabloya kopyala/yapıştır.
  4. Her 24 saat için Gİb, ICP ve TLPG için ortalama ve standart sapmaları hesaplayın. Elektronik tablo programındaki ve grafiğindeki özet tablo seçeneğini kullanarak verileri harmanlama.

7. İmmünohistokimya ve hematoksilin ve arka segmentlerin eozin lekesi

  1. TAS modelinden çeşitli zaman noktalarını takip eden arka göz segmentlerini çıkarın ve paraffinizlemeden önce formalin olarak düzeltin.
  2. Sagittal doku düzlemleri üretmek için gözleri bölümle.
  3. Parafin gömülü segmentleri %100 ksilen, %95 etanol, %50 etanol çözeltisi ile deparaffinize edin.
  4. Slaytları PBS ile 10 dakika yıkayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir engelleme tamponu ile engelleyin.
  5. Birincil antikorları olan etiket bölümleri: anti-kollajen IV (Hücre Dışı Matris (ECM) işaretleyici, NB120-6586, 1:100) ve anti-laminin (ECM işaretleyici, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (RGC işaretleyici), GTX118619, 1:50).
  6. Alexa Fluor ikincil antikorlarını kullanarak birincil antikorları tespit edin (Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan, A11008, 1:500).
  7. DAPI solmaya karşı çözüm kullanarak hücre çekirdeğine karşı koyma.
  8. Floresan mikroskop kullanarak 4x ve 10x objektif lenslerle lekeli bölümlerin ve faz görüntülerinin görüntülerini yakalayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  9. Hematoksilin ve eozin (H&E) boyama için, bölümleri otomatik bir boyama sisteminde işleyin (bkz. Malzeme Tablosu) %100, ksilen %95 etanol, %50 etanol çözeltisi ve H&E ile leke kullanarak deparaffinizasyon için.
  10. Parlak alan ışık kaynağına sahip bir mikroskop kullanarak 4x ve 10x objektif lenslerle görüntü yakalayın.

Sonuçlar

Translaminer otonom sistemin tasarımı ve oluşturulması
Translaminer basınç diferansiyel, glokom da dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların patogenezinde potansiyel bir anahtar mekanizmadır. Açıklanan modelin kullanım alanları arasında glokom (yüksek Gİb, belki de azalmış ICP), travmatik beyin hasarı (yüksek ICP) ve mikro yerçekimi ile ilişkili görme bozukluğuna (yükseltilmiş ICP, yükseltilmiş Gİb) uzun süreli maruz kalma çalışması yer almaktadır, ancak bunlarla s?...

Tartışmalar

İnsan ölüm sonrası dokuları, insan nörodejeneratif hastalıklarının incelenmesi için özellikle değerli bir kaynaktır, çünkü hayvan modellerinde geliştirilen potansiyel ilaçların tanımlanmasının insanlara çevrilebilir olması gerekir47. İnsan Gİb yüksekliğinin etkileri iyi belirlenmiştir, ancak anormal ONH translaminer basınç değişiklikleri üzerinde minimum araştırma gerçekleşmiştir. Birden fazla hayvan modeli ve insan ONH'nin sonlu modellemesi mevcut olsa da, t...

Açıklamalar

Makalenin yazarlarının açıklayacak potansiyel bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu projenin finansmanı Dr. Colleen M. McDowell'ın ihtiyati fonları aracılığıyla sağlandı. Bu çalışma kısmen Research to Prevent Blindness, Inc.'den UW Madison Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne sınırsız bir hibe ile desteklenmiştir. Dr. Abbot F. Clark ve Weiming Mao'ya perfüzyon organ kültürü modelindeki teknik yardımları için teşekkür ederiz. Lions Göz Nakil ve Araştırma Enstitüsü'ne (Tampa, FL) insan donör gözlerini sağladığı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)AmazonB000FMYRHK
30 mL Syringes without NeedleVitality Medical302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented CapQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriverBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167-100EA 
Corning L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Fine ForcepsF.S.T.11254-20
Eye Scissors Standard CurvedKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri DishesCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen ContainersFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and ClearQosina28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rateAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscopeKeyenceB2-X710
LabChart 8AD instrumentsLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, WhiteQOSINA65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)AD instrumentsFE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT MaleMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 PipeMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Surgical Scissors - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth CurvedKatenaK5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & PlasticsB1000-030

Referanslar

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. . Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 158g z i i bas ncintrakraniyal bas ntranslaminer bas n gradyanretina ganglion h crelerioptik sinir kafasperf zyon organ k lt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır