Modelo de Sistema Autônomo Translaminar para a Modulação da Pressão Intraocular e Intracraniana em Segmentos Posteriores de Doadores Humanos

Resumo

Descrevemos e detalhamos o uso do sistema autônomo translaminar. Este sistema utiliza o segmento posterior humano para regular independentemente a pressão dentro do segmento (intraocular) e ao redor do nervo óptico (intracraniano) para gerar um gradiente de pressão translaminar que imita características de neuropatia óptica glaucomatosa.

Resumo

Há uma necessidade atual não atendida de um novo modelo humano pré-clínico que possa atingir a etiologia da doença ex vivo usando pressão intracraniana (ICP) e pressão intraocular (IOP) que pode identificar vários paradigmas patogênicos relacionados à patogênese de glaucoma. Modelos de cultura de órgãos de perfusão do segmento anterior ex vivo têm sido previamente utilizados e aplicados como tecnologias eficazes para a descoberta de patogênese de glaucoma e testes de terapêutica. A triagem pré-clínica de medicamentos e pesquisas realizadas em sistemas de órgãos humanos ex vivo podem ser mais traduzíveis para a pesquisa clínica. Este artigo descreve em detalhes a geração e o funcionamento de um novo modelo de pressão translaminar humano ex vivo chamado sistema autônomo translaminar (TAS). O modelo TAS pode regular independentemente o ICP e o IOP utilizando segmentos posteriores de doadores humanos. O modelo permite estudar a patogênese de forma pré-clínica. Pode reduzir o uso de animais vivos em pesquisas oftálmicas. Em contraste com modelos experimentais in vitro, a estrutura tecidual da cabeça do nervo óptico (ONH) a complexidade e a integridade também podem ser mantidas dentro do modelo ex vivo TAS.

Introdução

Estimativas globais em pesquisas recentes sugerem que 285 milhões de pessoas vivem com deficiência visual, incluindo 39 milhões que são ^cegos1. Em 2010, a Organização Mundial da Saúde documentou que três das nove principais causas de cegueira listadas ocorrem no segmento posterior do ^olho1. As doenças oculares posteriores do segmento envolvem a retina, o coroide e o nervo ^óptico2. A retina e o nervo óptico são extensões do sistema nervoso central (SNC) do cérebro. Os axônios da célula gânglio da retina (RGC) são vulneráveis a danos porque saem do olho através da cabeça do nervo óptico (ONH) para formar o nervo ^óptico3. O ONH continua sendo o ponto mais vulnerável para os axônios RGC devido ao trabalho de malha 3D de feixes de tecido conjuntivo chamado lamina cribrosa (LC)⁴. O ONH é o local inicial de insulto aos axônios RGC em glaucoma5,6,7, e alterações na expressão genética dentro do ONH têm sido estudadas nos modelos de hipertensão ocular e glaucoma8,9,10. Os axônios RGC são suscetíveis no ONH devido a diferenciais de pressão entre o compartimento intraocular, chamado de pressão intraocular (IOP), e dentro do espaço subaracnóide perióptico externo, chamado de pressão intracraniana (ICP)¹¹. A região da LC separa ambas as áreas, mantendo diferenciais normais de pressão, com IOP variando de 10 a 21 mmHg e ICP de 5 a 15 ^mmHg12. A diferença de pressão através da lâmina entre as duas câmaras é chamada de gradiente de pressão translaminar (TLPG)¹³. Um dos principais fatores de risco de glaucoma é o ^IOP14 elevado.

O aumento do IOP aumenta a tensão dentro e em toda a região laminar6,15,16. Observações experimentais em humanos e modelos animais apresentam o ONH como sendo o local inicial de danos axonais17,18. O paradigma biomecânico do estresse e da tensão relacionada ao IOP que causam danos glaucososos no ONH também influencia a fisiopatologia do glaucoma19,20,21. Embora em humanos alterações induzidas por pressão dano mecanicamente Axônios ²², roedores sem placas colágenas dentro da lâmina também podem desenvolver ^glaucoma7,23. Além disso, o IOP elevado continua sendo o fator de risco mais proeminente em pacientes com glaucoma de ângulo aberto primário, enquanto pacientes com glaucoma de tensão normal desenvolvem neuropatia óptica glaucoma mesmo sem IOP elevado. Além disso, há também um subconjunto de hipertensos oculares que não apresentam danos nos nervos ópticos. Também foi sugerido que a pressão do fluido cefalorraquidiano (CSFp) pode desempenhar um papel na patogênese do glaucoma. Evidências indicam que a ICP é reduzida para ~5 mmHg em pacientes com glaucoma em comparação com indivíduos normais, causando assim aumento da pressão translaminar e desempenhando um papel crucial na ^doença24,25. Anteriormente, foi demonstrado em um modelo canino, que ao controlar as alterações de IOP e CSFp, pode haver grandes deslocamentos do disco ^óptico26. A elevação do CSFP nos olhos suínos também mostrou aumento da tensão principal dentro da região da LC e do tecido neural retrolaminar. O aumento da tensão nos RGCs e na região da LC contribui para o bloqueio do transporte axonal e perda de ^RGCs27. A degeneração progressiva dos RGCs tem sido associada à perda de suporte trófico28,29, estimulação de processos inflamatórios/regulação ^{imunológica30,31} e efeitos apoptóticos29,32,33,34,35. Além disso, a lesão axal (Figura 3) causa efeitos prejudiciais sobre os RGCs, desencadeando falhas regenerativas36,37,38,39. Embora os efeitos do IOP tenham sido bem estudados, pesquisas mínimas foram realizadas sobre alterações anormais de pressão translaminar. A maioria dos tratamentos para glaucoma se concentra na estabilização do IOP. No entanto, embora a redução do IOP desacelere a progressão da doença, ela não reverte a perda visual do campo e previne a perda completa de RGCs. A compreensão de alterações neurodegenerativas relacionadas à pressão no glaucoma será crucial para prevenir a morte do RGC.

As evidências atuais indicam que modulações de pressão translaminar devido a várias alterações mecânicas, biológicas ou fisiológicas em pacientes que sofrem de deficiências visuais traumáticas ou neurodegenerativas podem causar perda significativa de visão. Atualmente, não existe um verdadeiro modelo de segmento posterior humano pré-clínico que possa permitir o estudo de danos biomecânicos glaucomatosos dentro do ONH humano ex vivo. A observação e o tratamento do segmento posterior do olho é um grande desafio na ^{oftalmologia27}. Existem barreiras físicas e biológicas para atingir o olho posterior, incluindo altas taxas de eliminação, barreira hemorrística e respostas imunológicas ^potenciais40. A maioria dos testes de eficácia e segurança para novos alvos de drogas são realizados utilizando modelos celulares in vitro e in vivo ^animal41. A anatomia ocular é complexa, e estudos in vitro não imitam com precisão as barreiras anatômicas e fisiológicas apresentadas pelos sistemas de modelos teciduais. Embora os modelos animais sejam uma necessidade para estudos farmacocinéticos, a fisiologia ocular do olho posterior humano pode variar entre várias espécies animais, incluindo anatomia celular da retina, vasculatura e ^ONH41,42.

O uso de animais vivos requer regulamentações éticas intensivas e detalhadas, alto compromisso financeiro e reprodutibilidade ^efetiva43. Recentemente, várias outras diretrizes se seguiram para o uso ético de animais em pesquisas experimentais44,45,46. Uma alternativa ao teste em animais é o uso de modelos de olhos humanos ex vivo para investigar a patogênese da doença e a análise potencial de medicamentos para proteger os danos do ONH. O tecido pós-morte humano é um recurso valioso para estudar paradigmas da doença humana, especialmente no caso de doenças neurodegenerativas humanas, pois a identificação de potenciais drogas desenvolvidas em modelos animais requer a necessidade de ser traduzível para os seres ^humanos47. O tecido doador humano ex vivo tem sido amplamente utilizado para o estudo de distúrbios ^{humanos47,48,49}, e os sistemas de cultura de órgãos de perfusão do segmento anterior humano já forneceram um modelo único ex vivo para estudar a fisiopatologia de IOP50,51,52 elevados.

Para estudar a pressão translaminar relacionada ao IOP e iCP aos olhos humanos, projetamos e desenvolvemos com sucesso um sistema autônomo translaminar de duas câmaras (TAS) que pode regular independentemente o IOP e o ICP usando segmentos posteriores a partir de olhos de doadores humanos. É o primeiro modelo humano ex vivo a estudar a pressão translaminar e explorar os efeitos biomecânicos do TLPG no ONH.

Este modelo TAS humano ex vivo pode ser usado para descobrir e classificar modificações celulares e funcionais que ocorrem devido à elevação crônica de IOP ou ICP. Neste relatório, detalhamos o protocolo passo a passo de dissecar, configurar e monitorar o modelo de segmento posterior humano do TAS. O protocolo permitirá que outros pesquisadores reproduzam efetivamente esse novo modelo de segmento posterior humano pressurizado ex vivo para estudar a patogênese da doença biomecânica.

Protocolo

Os olhos foram obtidos de acordo com as disposições da Declaração de Helsinque para pesquisas envolvendo tecido humano.

NOTA: Olhos de bancos oculares respeitáveis (por exemplo, Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) foram colhidos dentro de 6-12 h de morte e o soro de doadores foi testado para hepatite B, hepatite C e vírus da imunodeficiência humana 1 e 2. Uma vez recebidos, os olhos foram dissecados e configurados no modelo TAS dentro de 24 horas. Os critérios de exclusão incluíam qualquer patologia ocular. Os olhos não foram excluídos com base na idade, raça ou gênero. Para garantir a viabilidade da retina após o recebimento, as explanações da retina foram colhidas dos doadores de tecidos e cultivadas por 7 e 14 dias (Figura Suplementar 1). Essas retinas também foram dissociadas e cresceram RGCs saudáveis na cultura por 7 dias com coloração positiva para marcador RGC, proteína de ligação de RNA com splicing múltiplo (RBPMS), bem como coloração positiva da cadeia de luz de neurofilamento (NEFL) em seus neurofilamentos (Figura Suplementar 2). .

1. Preparação e esterilização de equipamentos e suprimentos

1. Consulte a Tabela de Materiais para obter uma lista completa de suprimentos necessários, bem como números de fornecedores e catálogos.
2. Antes de usar, esterilize todos os equipamentos e instrumentos por autoclaving ou usando ampolas de óxido de etileno.

2. Preparação do meio de perfusão

1. Adicione 1% de estreptomicina de penicilina (10.000 penicilina U/mL, 10.000 μg/mL estreptomicina em 0,85% NaCl) e 1% L-glutamina (200 mM) a 1.000 mL de alta glicose Dulbecco's médio de Águia modificada (DMEM).
2. Esterilize o meio de perfusão passando por um filtro de 0,22 μm.

3. Configuração do sistema autônomo Translaminar (TAS)

1. Configurar seringas de entrada (reservatórios IOP e ICP).
   1. Adicione 30 mL do meio de perfusão (seção 2) a uma seringa de 30 mL. Conecte uma torneira de 3 vias à seringa de 30 mL. Conecte um filtro hidrofílico de 0,22 μm à torneira de 3 vias. Conecte um adaptador de stub Luer de 15 G ao filtro hidrofílico de 0,22 μm.
   2. Remova bolhas de ar da configuração da seringa. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G. Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de bloqueio universal nãoventada. Repita para um total de duas configurações.
   3. Rotule uma seringa como pressão intracraniana do canal 1 (CH1 ICP) e a outra seringa como pressão intraocular do canal 2 (CH2 IOP).
2. Configurar seringas de escoamento (reservatórios IOP e ICP).
   1. Conecte uma torneira de 3 vias a uma seringa de 30 mL. Conecte um adaptador de stub Luer de 15 G na torneira de 3 vias. Conecte a tubulação ao adaptador de stub Luer de 15 G.
   2. Feche a porta lateral da torneira com uma tampa de bloqueio universal nãoventada. Repita para um total de duas configurações. Rotule uma seringa como CH1 ICP e a outra seringa como CH2 IOP.

4. Preparação de globo ocular inteiro humano

NOTA: Se os olhos inteiros forem recebidos, siga o procedimento abaixo para separar o segmento anterior do segmento posterior do olho. Se os olhos forem recebidos bissecto, comece na etapa 4.4.

1. Coloque um olho inteiro na solução povidone-iodo por 2 min.
2. Enxágüe o olho em solução tamponada de fosfato estéril (PBS) para enxaguar o povidone-iodo. Repita duas vezes.
3. Remova a adnexa de todo o globo ocular usando fórceps e tesouras. Bissecte o olho no equador para separar os segmentos anterior e posterior do olho.
4. Remova a baia do nervo óptico. Remova o humor vítreo do segmento posterior.
5. Apare a esclera adicional do segmento posterior, se necessário, para garantir um bom ajuste na cúpula redonda da câmara IOP (inferior). Usando fórceps, certifique-se de que a retina se espalhe uniformemente sobre o posterior do segmento.
6. Configuração da câmara IOP (inferior)
   1. Coloque o segmento posterior humano na câmara IOP (inferior) do TAS sobre a cúpula redonda com o nervo óptico voltado para a parte superior.
   2. Sele o segmento posterior usando o anel O de resina epóxi com quatro parafusos, garantindo uma vedação apertada.
   3. Insira a tubulação nas portas DE ENTRADA e SAÍDA da câmara IOP (inferior). A seringa de entrada IOP com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída IOP vazia com tubulação é inserida na porta OUT.
   4. Use o método push/pull para infundir lentamente o meio de perfusão na porta de entrada para preencher o copo ocular posterior, ao mesmo tempo em que puxa lentamente o meio de perfusão para fora através da seringa de saída para remover quaisquer bolhas de ar das linhas. Pare de infundir o meio uma vez que os tubos DE ENTRADA e SAÍDA estejam vazios de bolhas de ar.
   5. Tranque as torneiras na posição de fora. Remova a seringa de 30 mL do conjunto do filtro de porta IOP IN e reabaste nas proximidades com um total de 30 mL de meio. Substitua a seringa de 30 mL no conjunto do filtro.
7. Configuração da câmara ICP (superior)
   1. Coloque a câmara/tampa ICP (superior) sobre a parte de trás do segmento posterior. Certifique-se de que o nervo óptico está dentro da câmara superior. Sele a câmara superior com quatro parafusos.
   2. Insira a tubulação nas portas DE ENTRADA e SAÍDA da câmara ICP (superior). A seringa de entrada ICP com tubo contendo meio é inserida na porta IN e a seringa de saída ICP vazia com tubulação é inserida na porta OUT.
   3. Infundir suavemente e lentamente o meio na porta IN para encher a câmara ICP e remover bolhas de ar das linhas usando o método push/pull. Pare de infundir o meio uma vez que a câmara ICP, bem como a tubulação IN e OUT são vazias de bolhas de ar.
   4. Tranque as torneiras na posição de fora. Remova a seringa de 30 mL da ICP no conjunto do filtro de porta e reabastecida com um total de 30 mL de meio. Substitua a seringa de 30 mL no conjunto do filtro.

5. Configuração do sistema de gravação de dados

NOTA: O sistema de gravação de dados é composto por uma fonte de energia de 8 canais, amplificador de ponte multicanal, transdutores de pressão hidrostática e um computador com software de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais). O seguinte descreve como configurar e calibrar o sistema.

1. Conecte o cabo de alimentação na parte de trás da fonte de alimentação de 8 canais e conecte-se a um dispositivo de backup da bateria.
2. Conecte o cabo USB da fonte de alimentação de 8 canais na parte de trás do computador.
3. Conecte a fonte de energia de 8 canais ao amplificador de ponte multicanal usando o cabo I2C fornecido.
4. Conecte os cabos Bayonet Neill-Concelman (BNC) nas entradas do canal em frente à fonte de energia de 8 canais e à extremidade dos cabos nos canais correspondentes na parte traseira do amplificador multicanal.
5. Conecte os cabos transdutores à frente do amplificador multicanal.
6. Instale o software de aquisição de dados no computador.
   1. Execute o instalador de configuração de software de aquisição de dados a partir do CD de software fornecido.
   2. Siga as instruções na tela do computador.
   3. Quando a instalação estiver concluída, selecione Terminar.
7. Ligue a fonte de energia de 8 canais.
8. Ligue o computador e inicie o software de aquisição de dados.
   1. Selecione | de arquivos Novo.
   2. Selecione | de configuração Configurações do canal. Selecione três canais (inferior esquerdo da tela). Na coluna Título do Canal renomeia os canais da seguinte forma: CH1 ICP; CH2 IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
   3. Selecione 2 mV para o Intervalo em todos os canais. Na coluna Cálculo selecione Não Cálculo para os canais 1 e 2.
   4. Na coluna Cálculo selecione Aritmética para o canal 3. Na seção Fórmula : Selecione canais/CH2; Selecione aritmética "-"; Selecione canais/CH1. Na seção Saída selecione mmHg. Selecione OK. Selecione OK novamente.
9. Configure e calibrar os transdutores de pressão hidrostática.
   NOTA: Os transdutores de pressão hidrostática devem ser calibrados antes dos experimentos usando o seguinte método.
   1. Conecte os transdutores de pressão hidrostática às linhas transdutoras ligadas ao amplificador da ponte multicanal.
   2. Conecte uma seringa de 30 mL cheia de ar à porta lateral do transdutor de pressão CH1 (ICP). Conecte o esfigmomanômetro à parte inferior do transdutor de pressão CH1 (ICP).
   3. No gráfico, veja a página do software de aquisição de dados, defina a velocidade de amostragem à esquerda clicando na seta ao lado do tempo de amostragem e selecione 100. Em seguida, clique com o botão direito do mouse na área CH1 (ICP) da página.
   4. Selecione Bridge Amp. Selecione Filtro de rede. Selecione Zero e aguarde que o sistema zero, tomando cuidado para não mover o transdutor de pressão.
   5. Aperte as abas brancas do transdutor de pressão e empurre o ar através do transdutor até que 40 mmHg seja obtido no esfigmomanômetro. Solte as abas brancas e remova a seringa e o esfigmomanômetro.
   6. Na página Conversão de Unidades , selecione o sinal 'menos (-)'. Destaque o platô mais alto para indicar 40 mmHg. Clique na Seta para o ponto 1 e digite 40.
   7. Destaque o platô mais baixo para indicar 0 mmHg. Clique na Seta para o ponto 2 e digite 0. Selecione mmHg para as unidades. Selecione OK.
   8. Selecione OK (página Bridge Amp). Repita as etapas 9.1-9.7 para CH2 (IOP) usando 100 mmHg para o planalto mais alto e 0 para o planalto mais baixo.
10. Conecte a unidade do segmento TAS/posterior ao sistema de aquisição de dados.
    1. Coloque a unidade do segmento TAS/posterior em uma incubadora (37 °C, 5% DE _CO2). Conecte a tubulação ICP da porta OUT ao transdutor de pressão CH1 (ICP).
    2. Conecte a tubulação IOP da porta OUT ao transdutor de pressão CH2 (IOP).
    3. Conecte as configurações de seringa (ICP e IOP) com meio das portas IN ao suporte do anel.
    4. Na página de exibição do gráfico selecione Iniciar amostragem. Defina a velocidade de amostragem à esquerda clicando na seta ao lado do tempo de amostragem e selecione Lento e 1 min.
    5. Ajuste as seringas no suporte do anel para cima ou para baixo para regular as pressões ICP e IOP aos requisitos do protocolo.
    6. Realize a reposição sistêmica do meio no sistema a cada 48-72 h através do método push and pull.

6. Recuperação e análise de dados

1. Abra o arquivo de dados no software de aquisição de dados.
2. Na seção Data Pad , clique no ícone Adicionar várias vezes ao Data Pad . Uma nova janela aparecerá.
   1. Na seção Localizar usando o tempo do menu suspenso.
   2. Na seção Selecionar 1 hora a cada 1 hora nos menus suspensos.
   3. Na seção Passo através de arquivo inteiro , clique em Adicionar.
3. Na seção Data Pad clique no ícone Data Pad View . Destaque todos os dados e copie/cole em uma planilha.
4. Calcule os desvios médios e padrão para IOP, ICP e TLPG para cada 24 horas. Coleto os dados usando a opção de tabela dinâmica em um programa de planilha e gráfico.

7. Imunohistoquímica e hematoxilina e eosina de segmentos posteriores

1. Remova os segmentos posteriores dos olhos seguindo vários pontos de tempo do modelo TAS e fixe em formalina antes da parafinação.
2. Seção os olhos para produzir planos de tecido sagital.
3. Desparafinar os segmentos embarcados parafina com uma solução 100% xileno, 95% etanol, 50% de etanol.
4. Lave os slides com PBS por 10 minutos e bloqueie com um tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 1h.
5. Seções de rótulo com anticorpos primários: anti-colágeno IV (Marcador de Matriz Extracelular (ECM), NB120-6586, 1:100) e anti-laminina (marcador ECM, NB300-144, 1:100, anti-RBPMS (marcador RGC), GTX118619, 1:50).
6. Detecte os anticorpos primários usando anticorpos secundários Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 anti-coelho de cabra, A11008, 1:500).
7. Contra-retiver os núcleos celulares usando a solução anti-fade DAPI.
8. Capture imagens das seções manchadas e imagens de fase com lentes objetivas de 4x e 10x usando um microscópio de fluorescência (ver Tabela de Materiais).
9. Para a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), processe as seções em um sistema automatizado de coloração (ver Tabela de Materiais) para desparafinação utilizando 100%, xileno 95% etanol, solução de 50% etanol e mancha com H&E.
10. Capture imagens com as lentes objetivas 4x e 10x usando um microscópio com uma fonte de luz de campo brilhante.

Resultados

Projeto e criação do sistema autônomo translaminar
O diferencial de pressão translaminar é um mecanismo-chave potencial na patogênese de várias doenças, incluindo o glaucoma. Os usos para o modelo descrito incluem, mas não se limitam a, o estudo do glaucoma (IOP elevado, talvez diminuição da ICP), lesão cerebral traumática (ICP elevada) e exposição a longo prazo à deficiência visual associada à microgravidade (ICP elevada, IOP elevada). Para ajudar a descobrir a patogênese molecular...

Discussão

Os tecidos pós-morte humanos são um recurso especialmente valioso para estudar doenças neurodegenerativas humanas porque a identificação de potenciais drogas desenvolvidas em modelos animais precisa ser traduzível para ^humanos47. Os efeitos da elevação do IOP humano são bem estabelecidos, mas pesquisas mínimas foram realizadas sobre alterações anormais de pressão translaminar ONH. Embora existam múltiplos modelos animais e modelagem finita do ONH humano, não existem modelos humanos ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick, 755 Durometer 50 Pack	Amazon	B07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)	Amazon	B000FMYRHK
30 mL Syringes without Needle	Vitality Medical	302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented Cap	QOSINA	2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriver	Brikksen Stainless Steel Fastners	PPMSSSCH4C.5
ANPROLENE 16 LARGE AMPULE	Fisher Scientific	NC9085343
Betadine	Purdue	PUR1815001EACH
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430167-100EA
Corning L-glutamine Solution	Fisher Scientific	MT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CS	Med Plus Medical Supply	COV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)	Katena	K5-4010
Dumont #5 - Fine Forceps	F.S.T.	11254-20
Eye Scissors Standard Curved	Katena	K4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri Dishes	Capitol Scientific	351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen Containers	Fisher Scientific	16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouches	Fisher Scientific	01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium	Fisher Scientific	SH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution	Fisher Scientific	SV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and Clear	Qosina	28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rate	AD instruments	DPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/Box	Jenson Global	JG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscope	Keyence	B2-X710
LabChart 8	AD instruments	LabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainer	Leica	ST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, White	QOSINA	65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)	AD instruments	FE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF	Fisher Scientific	NC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)	AD instruments	PL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT Male	McMAster-Carr	7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 Pipe	McMAster-Carr	51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.	Fisher Scientific	14-171-268
Superblock T20	Fisher Scientific	PI37536
Surgical Scissors - Sharp-Blunt	F.S.T.	14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth Curved	Katena	K5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)	University of North Texas Health Science Center	N/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N (NBR, Nitrile, Buna)	Marco Rubber & Plastics	B1000-030