JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir beschreiben und beschreiben die Verwendung des translaminaren autonomen Systems. Dieses System nutzt das menschliche hintere Segment, um den Druck innerhalb des Segments (intraokular) und um den Sehnerv (intrakranial) unabhängig zu regulieren, um einen translaminaren Druckgradienten zu erzeugen, der Merkmale der glaukomatösen Optikusneuropathie nachahmt.

Zusammenfassung

Es besteht derzeit ein ungedeckter Bedarf an einem neuen präklinischen Humanmodell, das die Ätiologie der Krankheit ex vivo unter Verwendung von intrakraniellem Druck (ICP) und Intraokulardruck (IOP) anvisieren kann, die verschiedene pathogene Paradigmen im Zusammenhang mit der Glaukompathogenese identifizieren können. Ex-vivo-Modelle der Perfusionsorgankultur des menschlichen vorderen Segments wurden bisher erfolgreich eingesetzt und als wirksame Technologien für die Entdeckung der Glaukompathogenese und die Erprobung von Therapeutika eingesetzt. Präklinisches Arzneimittelscreening und Forschung an menschlichen Ex-vivo-Organsystemen können besser auf die klinische Forschung übertragbar sein. Dieser Artikel beschreibt detailliert die Erzeugung und den Betrieb eines neuartigen ex vivo menschlichen translaminaren Druckmodells, das als translaminares autonomes System (TAS) bezeichnet wird. Das TAS-Modell kann ICP und IOP unabhängig voneinander regulieren, indem es posteriore Segmente des menschlichen Spenders verwendet. Das Modell ermöglicht es, die Pathogenese präklinisch zu untersuchen. Es kann den Einsatz lebender Tiere in der ophthalmologischen Forschung reduzieren. Im Gegensatz zu experimentellen In-vitro-Modellen können auch die Gewebestruktur, -komplexität und -integrität des Sehnervenkopfes (ONH) innerhalb des ex vivo TAS-Modells aufrechterhalten werden.

Einleitung

Globale Schätzungen in jüngsten Umfragen deuten darauf hin, dass 285 Millionen Menschen mit Sehbehinderung leben, darunter 39 Millionen, die blind sind1. Im Jahr 2010 dokumentierte die Weltgesundheitsorganisation, dass drei der neun aufgeführten Hauptursachen für Erblindung im hinteren Segment des Auges auftreten1. Augenerkrankungen des hinteren Segments betreffen die Netzhaut, die Aderhaut und den Sehnerv2. Die Netzhaut und der Sehnerv sind Erweiterungen des Gehirns des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Axone der retinalen Ganglienzellen (RGC) sind anfällig für Schäden, da sie das Auge durch den Sehnervenkopf (ONH) verlassen, um den Sehnerv zu bilden3. Das ONH bleibt der anfälligste Punkt für die RGC-Axone aufgrund des 3D-Geflechts von Bindegewebsstrahlen, die als Lamina cribrosa (LC)4 bezeichnet werden. Das ONH ist der erste Ort der Beleidigung von RGC-Axonen bei Glaukom5,6,7, und Genexpressionsänderungen innerhalb des ONH wurden in okulären Hypertonie- und Glaukommodellen untersucht8,9,10. Die RGC-Axone sind am ONH aufgrund von Druckunterschieden zwischen dem intraokularen Kompartiment, dem sogenannten Augeninnendruck (IOP), und innerhalb des externen perioptischen Subarachnoidalraums, dem sogenannten intrakraniellen Druck (ICP)11, anfällig. Der LC-Bereich trennt beide Bereiche unter Beibehaltung der normalen Druckunterschiede, wobei der IOD zwischen 10 und 21 mmHg und der ICP zwischen 5 und 15 mmHg12 liegt. Die Druckdifferenz durch die Lamelle zwischen den beiden Kammern wird als translaminarer Druckgradient (TLPG)13 bezeichnet. Ein Hauptrisikofaktor des Glaukoms ist ein erhöhter IOP14.

Ein erhöhter IOD erhöht die Belastung innerhalb und über die laminare Region6,15,16. Experimentelle Beobachtungen in Menschen- und Tiermodellen stellen das ONH als den ersten Ort axonaler Schäden dar17,18. Das biomechanische Paradigma des IOD-bedingten Stresses und der Belastung, die am ONH glaukomatöse Schäden verursachen, beeinflusst auch die Pathophysiologie des Glaukoms19,20,21. Obwohl beim Menschen druckbedingte Veränderungen die RGC-Axone mechanisch schädigen22, können Nagetiere, denen kollagene Platten in der Lamina fehlen, auch ein Glaukom entwickeln7,23. Darüber hinaus bleibt ein erhöhter IOD der prominenteste Risikofaktor bei Patienten mit primärem Offenwinkelglaukom, während normale Spannungsglaukompatienten auch ohne erhöhten IOD eine glaukomatöse Optikusneuropathie entwickeln. Darüber hinaus gibt es auch eine Untergruppe von okulären hypertensiven Patienten, die keine Sehnervenschädigung zeigen. Es wurde auch vorgeschlagen, dass der Liquordruck (CSFp) eine Rolle bei der Glaukompathogenese spielen kann. Es gibt Hinweise darauf, dass der ICP bei Glaukompatienten im Vergleich zu normalen Personen auf ~ 5 mmHg gesenkt wird, wodurch ein erhöhter translaminarer Druck verursacht wird und eine entscheidende Rolle bei der Erkrankung spielt24,25. Zuvor wurde in einem Hundemodell gezeigt, dass es durch die Kontrolle von IOP- und CSFp-Änderungen zu großen Verschiebungen der optischen Disc26 kommen kann. Die Erhöhung des LIQUOR in den Augen von Schweinen hat auch eine erhöhte Hauptbelastung innerhalb der LC-Region und des retrolaminaren Nervengewebes gezeigt. Eine erhöhte Belastung der RGCs und der LC-Region trägt zur axonalen Transportblockade und zum Verlust von RGCs bei27. Die fortschreitende Degeneration von RGCs wurde mit dem Verlust der trophischen Unterstützung28,29, der Stimulation von Entzündungsprozessen/Immunregulation30,31 und apoptotischen Effektoren in Verbindung gebracht29,32,33,34,35. Darüber hinaus verursacht eine axonale Verletzung (Abbildung 3) schädliche Auswirkungen auf die RGCs und löst ein regeneratives Versagen aus36,37,38,39. Obwohl die Auswirkungen von IOD gut untersucht wurden, wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Die meisten Behandlungen für Glaukom konzentrieren sich auf die Stabilisierung des IOD. Obwohl die Senkung des IOD das Fortschreiten der Krankheit verlangsamt, kehrt sie den Gesichtsfeldverlust nicht um und verhindert den vollständigen Verlust von RGCs. Das Verständnis druckbedingter neurodegenerativer Veränderungen des Glaukoms wird entscheidend sein, um den Tod durch RGC zu verhindern.

Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass translaminare Druckmodulationen aufgrund verschiedener mechanischer, biologischer oder physiologischer Veränderungen bei Patienten mit traumatischen oder neurodegenerativen Sehstörungen zu einem erheblichen Sehverlust führen können. Derzeit existiert kein echtes präklinisches modell für das menschliche hintere Segment, das die Untersuchung von glaukomatösen biomechanischen Schäden innerhalb des ex vivo humanen ONH ermöglichen könnte. Die Beobachtung und Behandlung des hinteren Augenabschnitts ist eine große Herausforderung in der Augenheilkunde27. Es gibt physikalische und biologische Barrieren, die auf das hintere Auge abzielen, einschließlich hoher Eliminationsraten, Blut-Netzhaut-Barriere und potenzieller immunologischer Reaktionen40. Die meisten Wirksamkeits- und Sicherheitstests für neuartige Wirkstoffziele werden unter Verwendung von In-vitro-Zell- und In-vivo-Tiermodellen durchgeführt41. Die Augenanatomie ist komplex, und In-vitro-Studien ahmen die anatomischen und physiologischen Barrieren von Gewebemodellsystemen nicht genau nach. Obwohl Tiermodelle eine Notwendigkeit für pharmakokinetische Studien sind, kann die Augenphysiologie des menschlichen hinteren Auges zwischen verschiedenen Tierarten variieren, einschließlich der zellulären Anatomie der Netzhaut, des Gefäßsystems und ONH41,42.

Die Verwendung lebender Tiere erfordert intensive und detaillierte ethische Vorschriften, ein hohes finanzielles Engagement und eine effektive Reproduzierbarkeit43. In jüngster Zeit sind mehrere weitere Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der experimentellen Forschung entstanden44,45,46. Eine Alternative zu Tierversuchen ist die Verwendung von Ex-vivo-Modellen des menschlichen Auges zur Untersuchung der Krankheitspathogenese und der Potenzialanalyse von Arzneimitteln zum Schutz von ONH-Schäden. Menschliches postmortales Gewebe ist eine wertvolle Ressource für die Untersuchung menschlicher Krankheitsparadigmen, insbesondere im Fall von humanen neurodegenerativen Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, die Notwendigkeit erfordert, auf den Menschen übertragbar zu sein47. Das menschliche Ex-vivo-Spendergewebe wurde umfassend für die Untersuchung menschlicher Störungen verwendet47,48,49, und menschliche Perfusionsorgankultursysteme für das vordere Segment haben zuvor ein einzigartiges Ex-vivo-Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von erhöhtem IOP50,51,52 bereitgestellt.

Um den translaminaren Druck im Zusammenhang mit IOD und ICP im menschlichen Auge zu untersuchen, haben wir erfolgreich ein translaminares autonomes Zweikammersystem (TAS) entworfen und entwickelt, das IOD und ICP unabhängig voneinander regulieren kann, indem wir posteriore Segmente von menschlichen Spenderaugen verwenden. Es ist das erste Ex-vivo-Humanmodell, das den translaminaren Druck untersucht und die biomechanischen Wirkungen von TLPG auf das ONH nutzt.

Dieses ex vivo humane TAS-Modell kann verwendet werden, um zelluläre und funktionelle Modifikationen zu entdecken und zu klassifizieren, die aufgrund einer chronischen Erhöhung von IOD oder ICP auftreten. In diesem Bericht beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren, Einrichten und Überwachen des TAS-Modells des menschlichen hinteren Segments. Das Protokoll wird es anderen Forschern ermöglichen, dieses neuartige Ex-vivo-Druckmodell des menschlichen hinteren Segments effektiv zu reproduzieren, um die pathogenese biomechanischer Erkrankungen zu untersuchen.

Protokoll

Die Augen wurden gemäß den Bestimmungen der Deklaration von Helsinki für die Forschung mit menschlichem Gewebe gewonnen.

HINWEIS: Augen aus seriösen Augenbanken (z. B. Lions Eye Institute for Transplant, Research, Tampa FL) wurden innerhalb von 6-12 Stunden nach dem Tod geerntet und Spenderserum wurde auf Hepatitis B, Hepatitis C und das humane Immunschwächevirus 1 und 2 getestet. Sobald sie eingegangen waren, wurden die Augen innerhalb von 24 Stunden im TAS-Modell seziert und eingerichtet. Zu den Ausschlusskriterien gehörte jede Augenpathologie. Augen wurden nicht aufgrund von Alter, Rasse oder Geschlecht ausgeschlossen. Um die Lebensfähigkeit der Netzhaut nach Erhalt zu gewährleisten, wurden retinale Explantate von den Gewebespendern geerntet und 7 und 14 Tage lang kultiviert (ergänzende Abbildung 1). Diese Netzhäute wurden ebenfalls dissoziiert und züchteten gesunde RGCs in Kultur für 7 Tage mit positiver Färbung für RGC-Marker, RNA-bindendes Protein mit multiplem Spleißen (RBPMS) sowie positiver Neurofilament-Leichtkettenfärbung (NEFL) in ihren Neurofilamenten (Ergänzende Abbildung 2). .

1. Vorbereitung und Sterilisation von Geräten und Zubehör

  1. Eine vollständige Liste der benötigten Verbrauchsmaterialien sowie Lieferanten- und Katalognummern finden Sie in der Materialtabelle.
  2. Vor dem Gebrauch sterilisieren Sie alle Geräte und Instrumente durch Autoklavieren oder verwenden Sie Ethylenoxidampullen.

2. Vorbereitung des Perfusionsmediums

  1. Fügen Sie 1% Penicillin Streptomycin (10.000 U/ml Penicillin, 10.000 μg/ml Streptomycin in 0,85% NaCl) und 1% L-Glutamin (200 mM) auf 1.000 ml hohe Glucose Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) hinzu.
  2. Sterilisieren Sie das Perfusionsmedium, indem Sie es durch einen 0,22 μm-Filter führen.

3. Einrichtung des translaminaren autonomen Systems (TAS)

  1. Richten Sie Zulaufspritzen (IOP- und ICP-Reservoirs) ein.
    1. 30 ml des Perfusionsmediums (Abschnitt 2) in eine 30 ml Spritze geben. Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an der 30 ml Spritze. Befestigen Sie einen 0,22 μm hydrophilen Filter am 3-Wege-Absperrhahn. Schließen Sie einen 15 G Luer Stummeladapter an den hydrophilen 0,22 μm-Filter an.
    2. Entfernen Sie Luftblasen aus dem Spritzenaufbau. Befestigen Sie den Schlauch am 15 G Luer Stummeladapter. Schließen Sie den seitlichen Anschluss des Absperrhahns mit einem unbelüfteten Universalverschluss. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups.
    3. Kennzeichnen Sie eine Spritze als intrakraniellen Druck (CH1 ICP) und die andere Spritze als Kanal 2 Augeninnendruck (CH2 IOP).
  2. Richten Sie Ausflussspritzen (IOP- und ICP-Reservoirs) ein.
    1. Befestigen Sie einen 3-Wege-Absperrhahn an einer 30 ml Spritze. Befestigen Sie einen 15 G Luer-Stummeladapter am 3-Wege-Absperrhahn. Befestigen Sie den Schlauch am 15 G Luer Stummeladapter.
    2. Schließen Sie den seitlichen Anschluss des Absperrhahns mit einem unbelüfteten Universalverschluss. Wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt zwei Setups. Kennzeichnen Sie eine Spritze als CH1 ICP und die andere Spritze als CH2 IOP.

4. Vorbereitung der menschlichen Ganzaugenkugel

HINWEIS: Wenn ganze Augen empfangen werden, befolgen Sie das folgende Verfahren, um das vordere Segment vom hinteren Segment des Auges zu trennen. Wenn die Augen halbiert empfangen werden, beginnen Sie mit Schritt 4.4.

  1. Legen Sie ein ganzes Auge für 2 min in Povidon-Jod-Lösung.
  2. Spülen Sie das Auge in steriler phosphatgepufferter Lösung (PBS), um das Povidon-Jod abzuspülen. Wiederholen Sie dies 2 Mal.
  3. Entfernen Sie die Adnexa mit einer Pinzette und einer Schere von der gesamten Augenkugel. Halbieren Sie das Auge am Äquator, um das vordere und hintere Segment des Auges zu trennen.
  4. Entfernen Sie die Sehnervenscheide. Entfernen Sie den Glaskörper aus dem hinteren Segment.
  5. Schneiden Sie bei Bedarf zusätzliche Sklera aus dem hinteren Segment ab, um eine gute Passform auf der runden Kuppel der IOP-Kammer (unten) zu gewährleisten. Stellen Sie mit einer Pinzette sicher, dass die Netzhaut gleichmäßig über die Rückseite des Segments verteilt ist.
  6. Einrichtung der IOP-Kammer (unten)
    1. Platzieren Sie das menschliche hintere Segment in der IOP-Kammer (untere) Kammer des TAS über der runden Kuppel mit dem Sehnerv nach oben.
    2. Versiegeln Sie das hintere Segment mit dem Epoxidharz-O-Ring mit vier Schrauben und sorgen Sie so für eine dichte Abdichtung.
    3. Setzen Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Ports der IOP-Kammer (unten) ein. Die IOP-Zulaufspritze mit mediumhaltigem Schlauch wird in den IN-Anschluss und die leere IOP-Auslaufspritze mit Schlauch in den OUT-Anschluss eingesetzt.
    4. Verwenden Sie die Push/Pull-Methode, um das Perfusionsmedium langsam in den Einströmanschluss zu infundieren, um die hintere Augenmuschel zu füllen, während Sie gleichzeitig das Perfusionsmedium langsam durch die Ausflussspritze herausziehen, um Luftblasen aus den Leitungen zu entfernen. Hören Sie auf, Medium zu infundieren, sobald sowohl die IN- als auch die OUT-Röhren frei von Luftblasen sind.
    5. Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Position. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus der IOP IN-Anschlussfilterbaugruppe und füllen Sie sie mit insgesamt 30 ml Medium nach. Setzen Sie die 30-ml-Spritze wieder in die Filtereinheit ein.
  7. Aufbau der ICP-Kammer (oben)
    1. Platzieren Sie die ICP-Kammer /den Deckel über der Rückseite des hinteren Segments. Stellen Sie sicher, dass sich der Sehnerv in der oberen Kammer befindet. Verschließen Sie die obere Kammer mit vier Schrauben.
    2. Setzen Sie den Schlauch in die IN- und OUT-Ports der ICP-Kammer (oben) ein. Die ICP-Zulaufspritze mit mediumhaltigem Schlauch wird in den IN-Anschluss und die leere ICP-Auslaufspritze mit Schlauch in den OUT-Anschluss eingesetzt.
    3. Ziehen Sie das Medium vorsichtig und langsam in den IN-Anschluss, um die ICP-Kammer zu füllen und Luftblasen mit der Push/Pull-Methode aus den Leitungen zu entfernen. Stoppen Sie das Infusionsmedium, sobald die ICP-Kammer sowie der IN- und OUT-Schlauch frei von Luftblasen sind.
    4. Verriegeln Sie die Absperrhähne in der Aus-Position. Entfernen Sie die 30-ml-Spritze aus dem ICP in der Portfilterbaugruppe und füllen Sie sie mit insgesamt 30 ml Medium nach. Setzen Sie die 30-ml-Spritze wieder in die Filtereinheit ein.

5. Einrichtung des Datenaufzeichnungssystems

HINWEIS: Das Datenaufzeichnungssystem besteht aus einer 8-Kanal-Stromquelle, einem Mehrkanal-Brückenverstärker, hydrostatischen Druckmessumformern und einem Computer mit Datenerfassungssoftware (siehe Materialtabelle). Im Folgenden wird beschrieben, wie Sie das System einrichten und kalibrieren.

  1. Schließen Sie das Netzkabel an die Rückseite der 8-Kanal-Stromquelle an und schließen Sie es an ein Batteriesicherungsgerät an.
  2. Schließen Sie das USB-Kabel von der 8-Kanal-Stromquelle an die Rückseite des Computers an.
  3. Schließen Sie die 8-Kanal-Stromquelle über das mitgelieferte I2C-Kabel an den Mehrkanal-Bridge-Verstärker an.
  4. Verbinden Sie die Bajonett Neill-Concelman (BNC) Kabel mit den Kanaleingängen vor der 8-Kanal-Stromquelle und dem Ende der Kabel mit den entsprechenden Kanälen auf der Rückseite des Mehrkanalverstärkers.
  5. Schließen Sie die Wandlerkabel an die Vorderseite des Mehrkanalverstärkers an.
  6. Installieren Sie die Datenerfassungssoftware auf dem Computer.
    1. Führen Sie das Installationsprogramm für die Datenerfassungssoftware von der mitgelieferten Software-CD aus.
    2. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Computerbildschirm.
    3. Wenn die Installation abgeschlossen ist, wählen Sie Fertig stellen aus.
  7. Schalten Sie die 8-Kanal-Stromquelle ein.
  8. Schalten Sie den Computer ein und starten Sie die Datenerfassungssoftware.
    1. Wählen Sie Datei | Neu.
    2. Wählen Sie Setup- | Kanaleinstellungen. Wählen Sie drei Kanäle aus (unten links auf dem Bildschirm). Benennen Sie in der Spalte Kanaltitel die Kanäle wie folgt um: CH1 ICP; CH2-IOP; CH3 TLPG (IOP-ICP).
    3. Wählen Sie 2 mV für den Bereich auf allen Kanälen. Wählen Sie in der Spalte Berechnung die Option Keine Berechnung für die Kanäle 1 und 2 aus.
    4. Wählen Sie in der Spalte Berechnung die Option Arithmetik für Kanal 3 aus. Im Abschnitt Formel : Wählen Sie Kanäle/CH2; Wählen Sie arithmetisch "-"; Wählen Sie Kanäle/CH1. Wählen Sie im Abschnitt Ausgabe die Option mmHg aus. Wählen Sie OK aus. Wählen Sie erneut OK aus.
  9. Richten Sie die hydrostatischen Druckmessumformer ein und kalibrieren Sie sie.
    ANMERKUNG: Hydrostatische Druckmessumformer müssen vor Versuchen mit der folgenden Methode kalibriert werden.
    1. Schließen Sie die hydrostatischen Druckmessumformer an die Wandlerleitungen an, die am Mehrkanal-Brückenverstärker befestigt sind.
    2. Befestigen Sie eine mit Luft gefüllte 30-ml-Spritze an der Seitenöffnung des CH1-Druckmessumformers (ICP). Befestigen Sie das Blutdruckmessgerät an der Unterseite des CH1 (ICP) Druckmessumformers.
    3. Zeigen Sie im Diagramm die Seite der Datenerfassungssoftware an, stellen Sie die Abtastgeschwindigkeit ein, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben der Abtastzeit klicken und 100 auswählen. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste in den Bereich CH1 (ICP) der Seite.
    4. Wählen Sie Bridge Amp. Wählen Sie Netzfilter. Wählen Sie Null und warten Sie, bis das System auf Null gesetzt ist, und achten Sie darauf, den Druckmessumformer nicht zu bewegen.
    5. Drücken Sie die weißen Laschen des Druckmessumformers zusammen und drücken Sie Luft durch den Messumformer, bis 40 mmHg auf dem Blutdruckmessgerät erhalten sind. Lassen Sie die weißen Laschen los, und entfernen Sie die Spritze und das Blutdruckmessgerät.
    6. Wählen Sie auf der Seite Einheitenumrechnung das Zeichen "Minus (-)" aus. Markieren Sie das höchste Plateau, um 40 mmHg anzuzeigen. Klicken Sie auf den Pfeil für Punkt 1, und geben Sie 40 ein.
    7. Markieren Sie das unterste Plateau, um 0 mmHg anzuzeigen. Klicken Sie auf den Pfeil für Punkt 2, und geben Sie 0 ein. Wählen Sie mmHg für die Einheiten aus. Wählen Sie OK aus.
    8. Wählen Sie OK (Bridge Amp Seite). Wiederholen Sie die Schritte 9.1–9.7 für CH2 (IOP) mit 100 mmHg für das höchste Plateau und 0 für das unterste Plateau.
  10. Schließen Sie die TAS/posteriore Segmenteinheit an das Datenerfassungssystem an.
    1. Legen Sie die TAS/posteriore Segmenteinheit in einen Inkubator (37 °C, 5% CO2). Schließen Sie den ICP-Schlauch vom OUT-Anschluss an den CH1 (ICP)-Druckmessumformer an.
    2. Schließen Sie den IOP-Schlauch vom OUT-Anschluss an den CH2-Druckmessumformer (IOP) an.
    3. Befestigen Sie die Spritzen-Setups (ICP und IOP) mit Medium von den IN-Ports am Ringständer.
    4. Wählen Sie auf der Seite Diagrammansicht die Option Stichprobe starten aus. Stellen Sie die Sampling-Geschwindigkeit ein, indem Sie mit der linken Maustaste auf den Pfeil neben der Sampling-Zeit klicken und Slow und 1 min auswählen.
    5. Stellen Sie die Spritzen am Ringständer nach oben oder unten ein, um den ICP- und IOP-Druck entsprechend den Protokollanforderungen zu regulieren.
    6. Führen Sie alle 48-72 h eine systemische Auffüllung des Mediums im System durch die Push-and-Pull-Methode durch.

6. Datenabruf und -analyse

  1. Öffnen Sie die Datendatei in der Datenerfassungssoftware.
  2. Klicken Sie im Abschnitt Data Pad auf das Symbol Mehrere zu Data Pad hinzufügen . Ein neues Fenster wird angezeigt.
    1. Wählen Sie im Abschnitt Suchen mit die Option Zeit aus dem Dropdown-Menü aus.
    2. Wählen Sie im Abschnitt Auswählen alle 1 Stunde aus den Dropdown-Menüs aus.
    3. Wählen Sie im Abschnitt Schritt durch die Option Gesamte Datei aus, und klicken Sie dann auf Hinzufügen.
  3. Klicken Sie im Abschnitt Data Pad auf das Symbol Data Pad View . Markieren Sie alle Daten und kopieren Sie sie in eine Tabelle.
  4. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichungen für IOP, ICP und TLPG pro 24 h. Ordnen Sie die Daten mithilfe der Pivot-Tabellenoption in einem Tabellenkalkulationsprogramm und einem Diagramm zusammen.

7. Immunhistochemie und Hämatoxylin- und Eosinfärbung der hinteren Segmente

  1. Entfernen Sie die hinteren Augensegmente nach verschiedenen Zeitpunkten aus dem TAS-Modell und fixieren Sie formalin vor der Paraffinisierung.
  2. Schneiden Sie die Augen, um sagittale Gewebeebenen zu erzeugen.
  3. Deparaffinisieren Sie die paraffin-eingebetteten Segmente mit einer 100% Xylol, 95% Ethanol, 50% Ethanol Lösung.
  4. Waschen Sie die Objektträger mit PBS für 10 min und blockieren Sie sie mit einem Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h.
  5. Markierungsabschnitte mit primären Antikörpern: Anti-Kollagen IV (Extrazelluläre Matrix (ECM) Marker, NB120-6586, 1:100) und Anti-Laminin (ECM-Marker, NB300-144, 1:100, Anti-RBPMS (RGC-Marker), GTX118619, 1:50).
  6. Nachweis der primären Antikörper mit Alexa Fluor sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Kaninchen, A11008, 1:500).
  7. Halten Sie die Zellkerne mit DAPI-Anti-Fade-Lösung auf.
  8. Erfassen Sie Bilder der gefärbten Schnitte und Phasenbilder mit 4x- und 10x-Objektivlinsen mit einem Fluoreszenzmikroskop (siehe Materialtabelle).
  9. Für die Hämatoxylin- und Eosin (H & E) -Färbung verarbeiten Sie die Abschnitte in einem automatisierten Färbesystem (siehe Materialtabelle) zur Deparaffinisierung mit einem 100%, Xylol 95% Ethanol, 50% Ethanollösung und färben Sie es mit H & E.
  10. Nehmen Sie Bilder mit den 4x- und 10x-Objektivlinsen mit einem Mikroskop mit einer Hellfeldlichtquelle auf.

Ergebnisse

Design und Kreation des translaminaren autonomen Systems
Die translaminare Druckdifferenz ist ein potenzieller Schlüsselmechanismus in der Pathogenese verschiedener Krankheiten, einschließlich glaukom. Zu den Anwendungen des beschriebenen Modells gehören unter anderem die Untersuchung von Glaukom (erhöhter IOD, möglicherweise verminderter ICP), traumatischer Hirnverletzung (erhöhter ICP) und langfristiger Exposition gegenüber schwerelosigkeitsassoziierter Sehbehinderung (erhöhter ICP, erhöhte...

Diskussion

Menschliches postmortales Gewebe ist eine besonders wertvolle Ressource für die Erforschung humaner neurodegenerativer Erkrankungen, da die Identifizierung potenzieller Medikamente, die in Tiermodellen entwickelt wurden, auf den Menschen übertragbar sein muss47. Die Auswirkungen der menschlichen IOD-Erhöhung sind gut belegt, aber es wurden nur minimale Untersuchungen zu abnormalen ONH-translaminaren Druckänderungen durchgeführt. Obwohl mehrere Tiermodelle und endliche Modelle des menschlichen...

Offenlegungen

Die Autoren des Manuskripts haben keine potenziellen Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung dieses Projekts erfolgte durch Ermessensfonds von Dr. Colleen M. McDowell. Diese Arbeit wurde zum Teil durch einen uneingeschränkten Zuschuss von Research to Prevent Blindness, Inc. an das UW Madison Department of Ophthalmology and Visual Sciences unterstützt. Wir danken Drs. Abt F. Clark und Weiming Mao für ihre technische Unterstützung mit dem Perfusionsorgankulturmodell. Wir danken dem Lions Eye Institute for Transplant and Research (Tampa, FL) für die Bereitstellung der menschlichen Spenderaugen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
#122, 1-1/8" Inside x 1-5/16" Outside Diam, Viton O-Ring, 3/32" Thick,
755 Durometer 50 Pack		AmazonB07DRGPPZJ
114 Buna-N O-Ring, 70A Durometer, Black, 5/8" ID, 13/16" OD, 3/32" Width (Pack of 100)AmazonB000FMYRHK
30 mL Syringes without NeedleVitality Medical302832
3-Way Stopcock, 2 Female Luer Locks, Swivel Male Luer Lock, Vented CapQOSINA2C6201
4-40 X 1/2 PH PAN MS SS/CHROME & appropriate sized phillips screwdriverBrikksen Stainless Steel FastnersPPMSSSCH4C.5 
ANPROLENE 16 LARGE AMPULEFisher ScientificNC9085343 
BetadinePurduePUR1815001EACH 
Corning 100 x 20mm tissue-culture treated culture dishesSigma-AldrichCLS430167-100EA 
Corning L-glutamine SolutionFisher ScientificMT25005CI
Covidien 3033 Curity Gauze Sponge, 4" x 4", 12-Ply, Sterile, 1200/CSMed Plus Medical SupplyCOV-3033-CS
Dressing Forceps Delicate Curved (serrated)KatenaK5-4010
Dumont #5 - Fine ForcepsF.S.T.11254-20
Eye Scissors Standard CurvedKatenaK4-7410
Falcon 150 x 15mm Plain Sterile Disposable Petri DishesCapitol Scientific351058
Fisherbrand 4 oz. Specimen ContainersFisher Scientific16-320-730
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-54
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-55
Fisherbrand Instant Sealing Sterilization PouchesFisher Scientific01-812-58
HyClone Dulbecco's Modified Eagles MediumFisher ScientificSH3024302
HyClone Penicillin Streptomycin 100X SolutionFisher ScientificSV30010
Hydrophilic Filter with Female Luer Lock Inlet, Male Luer Slip Outlet, Blue and ClearQosina28217
Hydrostatic pressure transducers, DELTRAN ® II, Catalog # DPT-200 with a 3CC/HR flow rateAD instrumentsDPT-200
JG15-0.5HPX 15 Gauge 0.5" NT Premium Series Dispensing Tip 50/BoxJenson GlobalJG15-0.5HPX 15
Keyence B2?X710 microscopeKeyenceB2-X710
LabChart 8AD instrumentsLabChart 8
Leica ST5020 Multi-stainerLeicaST5020
Non-Vented Universal Luer Lock Cap, WhiteQOSINA65811
Octal Bridge Amp (Model # FE228)AD instrumentsFE228
Pharmco Products ETHYL ALCOHOL, 200 PROOFFisher ScientificNC1675398
Phosphate Buffered Solution (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
PowerLab 8/35 (Model # PL3508)AD instrumentsPL3508
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPIThermoFisherP36935
Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water Straight Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 NPT MaleMcMAster-Carr7880T113
Push-to-Connect Tube Fitting with Universal Thread for Air and Water, Adapter, 1/8" Tube OD x 1/8 PipeMcMAster-Carr51235K101
Saint-Gobain Tygon S3 E-3603 Flexible Tubing 500 ft.Fisher Scientific14-171-268
Superblock T20Fisher ScientificPI37536
Surgical Scissors - Sharp-BluntF.S.T.14001-14
Tissue Forceps Delicate 1x2 Teeth CurvedKatenaK5-4110
Translaminar Autonomous System (TAS)University of North Texas Health Science CenterN/A
USA Size 030 O-ring Buna-N, B1000, 70 Durometer, Black, Buna-N
(NBR, Nitrile, Buna)		Marco Rubber & PlasticsB1000-030

Referenzen

  1. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. The British Journal of Ophthalmology. 96 (5), 614-618 (2012).
  2. Bastawrous, A., et al. Posterior segment eye disease in sub-Saharan Africa: review of recent population-based studies. Tropical Medicine & International Health. 19 (5), 600-609 (2014).
  3. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye. 18 (11), 1089-1095 (2004).
  4. Burgoyne, C. F. A biomechanical paradigm for axonal insult within the optic nerve head in aging and glaucoma. Experimental Eye Research. 93 (2), 120-132 (2011).
  5. Quigley, H. A., Addicks, E. M. Chronic experimental glaucoma in primates. II. Effect of extended intraocular pressure elevation on optic nerve head and axonal transport. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 19 (2), 137-152 (1980).
  6. Quigley, H. A., Addicks, E. M., Green, W. R., Maumenee, A. E. Optic nerve damage in human glaucoma. II. The site of injury and susceptibility to damage. Archives of Ophthalmology. 99 (4), 635-649 (1981).
  7. Howell, G. R., et al. Axons of retinal ganglion cells are insulted in the optic nerve early in DBA/2J glaucoma. The Journal of Cell Biology. 179 (7), 1523-1537 (2007).
  8. Johnson, E. C., Jia, L., Cepurna, W. O., Doser, T. A., Morrison, J. C. Global changes in optic nerve head gene expression after exposure to elevated intraocular pressure in a rat glaucoma model. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 48 (7), 3161-3177 (2007).
  9. Howell, G. R., et al. Molecular clustering identifies complement and endothelin induction as early events in a mouse model of glaucoma. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1429-1444 (2011).
  10. Qu, J., Jakobs, T. C. The Time Course of Gene Expression during Reactive Gliosis in the Optic Nerve. PloS one. 8 (6), 67094 (2013).
  11. Berdahl, J. P., Fautsch, M. P., Stinnett, S. S., Allingham, R. R. Intracranial pressure in primary open angle glaucoma, normal tension glaucoma, and ocular hypertension: a case-control study. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 49 (12), 5412-5418 (2008).
  12. Berdahl, J. P., Allingham, R. R. Intracranial pressure and glaucoma. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (2), 106-111 (2010).
  13. Morgan, W. H., et al. The correlation between cerebrospinal fluid pressure and retrolaminar tissue pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 39 (8), 1419-1428 (1998).
  14. Leske, M. C., Connell, A. M., Wu, S. Y., Hyman, L. G., Schachat, A. P. Risk factors for open-angle glaucoma. The Barbados Eye Study. Archives of Ophthalmology. 113 (7), 918-924 (1995).
  15. Quigley, H. A., Green, W. R. The histology of human glaucoma cupping and optic nerve damage: clinicopathologic correlation in 21 eyes. Ophthalmology. 86 (10), 1803-1830 (1979).
  16. Burgoyne, C. F., Downs, J. C., Bellezza, A. J., Hart, R. T. Three-dimensional reconstruction of normal and early glaucoma monkey optic nerve head connective tissues. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (12), 4388-4399 (2004).
  17. Diekmann, H., Fischer, D. Glaucoma and optic nerve repair. Cell and Tissue Research. 353 (2), 327-337 (2013).
  18. Nickells, R. W., Howell, G. R., Soto, I., John, S. W. Under pressure: cellular and molecular responses during glaucoma, a common neurodegeneration with axonopathy. Annual Review of Neuroscience. 35, 153-179 (2012).
  19. Burgoyne, C. F., Downs, J. C. Premise and prediction-how optic nerve head biomechanics underlies the susceptibility and clinical behavior of the aged optic nerve head. Journal of Glaucoma. 17 (4), 318-328 (2008).
  20. Sigal, I. A., Ethier, C. R. Biomechanics of the optic nerve head. Experimental Eye Research. 88 (4), 799-807 (2009).
  21. Sigal, I. A., Flanagan, J. G., Tertinegg, I., Ethier, C. R. Modeling individual-specific human optic nerve head biomechanics. Part I: IOP-induced deformations and influence of geometry. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 8 (2), 85-98 (2009).
  22. Morgan, J. E., Jeffery, G., Foss, A. J. Axon deviation in the human lamina cribrosa. The British Journal of Ophthalmology. 82 (6), 680-683 (1998).
  23. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  24. Berdahl, J. P., Allingham, R. R., Johnson, D. H. Cerebrospinal fluid pressure is decreased in primary open-angle glaucoma. Ophthalmology. 115 (5), 763-768 (2008).
  25. Fleischman, D., Allingham, R. R. The role of cerebrospinal fluid pressure in glaucoma and other ophthalmic diseases: A review. Saudi Journal of Ophthalmology. 27 (2), 97-106 (2013).
  26. Morgan, W. H., et al. Optic disc movement with variations in intraocular and cerebrospinal fluid pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 43 (10), 3236-3242 (2002).
  27. Feola, A. J., et al. Deformation of the Lamina Cribrosa and Optic Nerve Due to Changes in Cerebrospinal Fluid Pressure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (4), 2070-2078 (2017).
  28. Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. Journal of Neurobiology. 59 (1), 162-180 (2004).
  29. Kermer, P., Klocker, N., Bahr, M. Neuronal death after brain injury. Models, mechanisms, and therapeutic strategies in vivo. Cell and Tissue Research. 298 (3), 383-395 (1999).
  30. Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscience. 125 (4), 903-920 (2004).
  31. Kipnis, J., et al. Neuronal survival after CNS insult is determined by a genetically encoded autoimmune response. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 21 (13), 4564-4571 (2001).
  32. Isenmann, S., Wahl, C., Krajewski, S., Reed, J. C., Bahr, M. Up-regulation of Bax protein in degenerating retinal ganglion cells precedes apoptotic cell death after optic nerve lesion in the rat. The European Journal of Neuroscience. 9 (8), 1763-1772 (1997).
  33. Kermer, P., et al. Caspase-9: involvement in secondary death of axotomized rat retinal ganglion cells in vivo. Brain research. Molecular Brain Research. 85 (1-2), 144-150 (2000).
  34. Kermer, P., Klocker, N., Labes, M., Bahr, M. Inhibition of CPP32-like proteases rescues axotomized retinal ganglion cells from secondary cell death in vivo. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 18 (12), 4656-4662 (1998).
  35. Kikuchi, M., Tenneti, L., Lipton, S. A. Role of p38 mitogen-activated protein kinase in axotomy-induced apoptosis of rat retinal ganglion cells. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (13), 5037-5044 (2000).
  36. Barron, K. D., Dentinger, M. P., Krohel, G., Easton, S. K., Mankes, R. Qualitative and quantitative ultrastructural observations on retinal ganglion cell layer of rat after intraorbital optic nerve crush. Journal of Neurocytology. 15 (3), 345-362 (1986).
  37. Misantone, L. J., Gershenbaum, M., Murray, M. Viability of retinal ganglion cells after optic nerve crush in adult rats. Journal of Neurocytology. 13 (3), 449-465 (1984).
  38. Bahr, M. Live or let die - retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends in Neurosciences. 23 (10), 483-490 (2000).
  39. Klocker, N., Zerfowski, M., Gellrich, N. C., Bahr, M. Morphological and functional analysis of an incomplete CNS fiber tract lesion: graded crush of the rat optic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 110 (12), 147-153 (2001).
  40. Del Amo, E. M., et al. Pharmacokinetic aspects of retinal drug delivery. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 134-185 (2017).
  41. Rousou, C., et al. A technical protocol for an experimental ex vivo model using arterially perfused porcine eyes. Experimental Eye Research. 181, 171-177 (2019).
  42. Vézina, M. . Assessing Ocular Toxicology in Laboratory Animals. , 1-21 (2012).
  43. de Boo, J., Hendriksen, C. Reduction strategies in animal research: a review of scientific approaches at the intra-experimental, supra-experimental and extra-experimental levels. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (4), 369-377 (2005).
  44. Kirk, R. G. W. Recovering The Principles of Humane Experimental Technique: The 3Rs and the Human Essence of Animal Research. Science, Technology, & Human Values. 43 (4), 622-648 (2018).
  45. Burden, N., Chapman, K., Sewell, F., Robinson, V. Pioneering better science through the 3Rs: an introduction to the national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research (NC3Rs). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 198-208 (2015).
  46. Singh, J. The national centre for the replacement, refinement, and reduction of animals in research. Journal of Pharmacology and Pharmacotherapeutics. 3 (1), 87-89 (2012).
  47. White, K., et al. Effect of Postmortem Interval and Years in Storage on RNA Quality of Tissue at a Repository of the NIH NeuroBioBank. Biopreservation and Biobanking. 16 (2), 148-157 (2018).
  48. Ervin, J. F., et al. Postmortem delay has minimal effect on brain RNA integrity. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 66 (12), 1093-1099 (2007).
  49. Heinrich, M., Matt, K., Lutz-Bonengel, S., Schmidt, U. Successful RNA extraction from various human postmortem tissues. International Journal of Legal Medicine. 121 (2), 136-142 (2007).
  50. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  51. Gottanka, J., Chan, D., Eichhorn, M., Lutjen-Drecoll, E., Ethier, C. R. Effects of TGF-beta2 in perfused human eyes. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 45 (1), 153-158 (2004).
  52. Pang, I. H., McCartney, M. D., Steely, H. T., Clark, A. F. Human ocular perfusion organ culture: a versatile ex vivo model for glaucoma research. Journal of Glaucoma. 9 (6), 468-479 (2000).
  53. Aryee, M. J., Gutierrez-Pabello, J. A., Kramnik, I., Maiti, T., Quackenbush, J. An improved empirical bayes approach to estimating differential gene expression in microarray time-course data: BETR (Bayesian Estimation of Temporal Regulation). BMC Bioinformatics. 10, 409 (2009).
  54. Feola, A. J., et al. Finite Element Modeling of Factors Influencing Optic Nerve Head Deformation Due to Intracranial Pressure. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (4), 1901-1911 (2016).
  55. Downs, J. C. Optic nerve head biomechanics in aging and disease. Experimental Eye Research. 133, 19-29 (2015).
  56. Downs, J. C., Roberts, M. D., Burgoyne, C. F. Mechanical environment of the optic nerve head in glaucoma. Optometry and Vision Science. 85 (6), 425-435 (2008).
  57. Downs, J. C., et al. Viscoelastic characterization of peripapillary sclera: material properties by quadrant in rabbit and monkey eyes. Journal of Biomechanical Engineering. 125 (1), 124-131 (2003).
  58. Wagner, A. H., et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues. Experimental Eye Research. 111, 105-111 (2013).
  59. Pels, E., Beele, H., Claerhout, I. Eye bank issues: II. Preservation techniques: warm versus cold storage. International Ophthalmology. 28 (3), 155-163 (2008).
  60. Reinhard, K., et al. Hypothermia Promotes Survival of Ischemic Retinal Ganglion Cells. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (2), 658-663 (2016).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

NeuroscienceAugeninnendruckintrakranieller Drucktranslaminarer Druckgradientretinale GanglienzellenSehnervenkopfPerfusionsorgankultur

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten