הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק

Summary

אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.

Abstract

אמנון וירוס מחלת האגם (TiLVD), מחלה נגיפית המתעוררים ב אמנון הנגרמת על ידי וירוס האגם אמנון (Tilvd), הוא אתגר מתמשך בתעשיית מידגה כי הביא את התחלואה ההמוני ואת התמותה של אמנון בחלקים רבים של העולם. יעילה, מהירה, ומדויקת אבחון מדויק עבור זיהום TiLV הוא אפוא הכרחי כדי לזהות את הזיהום הראשוני כדי למנוע את התפשטות המחלה בחקלאות מידגה. במחקר זה, לולאה הפוכה רגיש מאוד ומעשי לולאת איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטה מוצגת לזיהוי וירוס האגם אמנון ברקמת הדג. השוואה של rt-qpcr ו-rt-המנורה בחני של דגימות נגוע חשף תוצאות חיוביות ב 63 (100%) ו 51 (80.95%) דגימות, בהתאמה. יתר על כן, ניתוח של דגימות נגוע הראו כי כל 63 רקמות נגוע הניבו תוצאות שליליות הן RT-qPCR ו-RT-המנורה assays. החוצה הפעילות הצולבת עם חמישה פתוגנים ב אמנון הוערך באמצעות RT-מנורה, וכל הבדיקות הראו תוצאות שליליות. הן הכבד והן דגימות ריר שהתקבלו מדגים נגועים הראו תוצאות דומות באמצעות RT-המנורה שיטה, רומז כי ריר ניתן להשתמש RT-מנורה כמו שיטת לא קטלני כדי למנוע הריגת דגים. לסיכום, התוצאות הראו כי הציג RT-מנורה שיטת מספק שיטה יעילה לזיהוי TiLV ברקמת אמנון בתוך 1 h. לפיכך, השיטה מומלצת ככלי הקרנה בחוות לאבחון מהיר של TiLV.

Introduction

אמנון וירוס מחלת האגם (tilvd) היא מחלה נגיפית ב אמנון (oreochromis spp.) כי הדיווחים גורם מקרי מוות אמנון באזורים רבים של העולם, כולל אסיה^1,2, אפריקה, ואמריקה. המחלה הוכרה לראשונה בתקופת התמותה ההמונית של האמנון ב-2009 בישראל, כאשר מספר האמנון הפראי באגם כנרת צנח באופן דרמטי מ-257 ל -8 טון בשנה². המחלה נגרמת על ידי וירוס באגם האמנון (TiLV), אשר הוקצה המשפחה האמריתיים כסוג חדש tilapinevirus ו אמנון מיני חדש tilapinevirus³. האפיון הגנטי של tilv הראה כי הווירוס הוא הרומן עטוף, שלילי-הגיון, יחיד תקוע וירוס RNA כי יש 10 מקטעים קידוד 10 חלבונים^1,2,4. מינים שונים של אמנון בסוג סרטרדון, oreochromis, ו tilapine ודגי מים חמים אחרים (למשל, גורמי ענק (osphronemus גוראמי) הוכחו להיות רגישים כדי tilv^2,5. כיום, וירוס זה ממשיך להתפשט ברחבי העולם, אולי דרך התנועה של הנגועים דגים חיים^6,7, בעוד הסיכון של שידור נגיפי דרך אמנון קפוא או המוצר שלה הוא מוגבל⁸. תמותה ניכרת בשל זיהום TiLV יש את הפוטנציאל יש השפעה כלכלית מזיקה משמעותית על תעשיית האמנון. לדוגמה, ההשפעה הכלכלית של תסמונת תמותת הקיץ במצרים המשויכת לזיהום TiLV חושבה להיות $100 מיליון⁹. לכן, חשוב לפתח שיטת אבחון מהירה ונאותה כדי להקל על השליטה במחלה זו בחוות הדגים.

עד עכשיו, האבחנה של TiLVD התבססה על מולקולרית הספר, בידוד נגיפי, ו histopathology. פרוטוקולים מסוגים שונים של PCR והתחל פותחו עבור אבחון TiLV^10,11. למשל, שיטת SYBR ירוק מבוססי הפוכה PCR כמותי (RT-qPCR) שיטה עם רגישות לזהות כמה כמו שני עותקים/μL של הווירוס פותחה ואומת עבור הזיהוי TiLV¹⁰. שיטות ה-PCR האחרות לזיהוי TiLV כוללות את ה-PCR הכמותי של TaqMan¹¹, RT-pcr², מקונן rt-pcr¹², ומקונן למחצה, rt-pcr¹³. עם זאת, שיטות אלה דורשות ציוד מעבדה מתוחכם ופרקי זמן מורחבים יחסית כדי להניב תוצאות בשל מורכבות התגובות, מה שהופך אותם לאינם מתאימים ליישום שדה.

האיזותרמי לולאה בתיווך הגברה (מנורה) הוא יישום מהיר, פשוט ופרקטי לשדה^14,15. הטכניקה מעסיקה את העיקרון של תגובת העתקה סטרנד, בעוד תגובת הגברה פועלת בתנאים איזותרמי ללא מתוחכם ויקר הציקלאה תרמית^14,15. כתוצאה מכך, מוצרים מנורה מוגברת או RT-מנורה מוצרים מנותח בלהקות כמו הסולם באמצעות אגקום ג ' ל ג'ל עם כתם פלורסנט עבור או הדמיה בטוחה של DNA או RNA¹⁴ או התבוננות עם עין בעירום לנוכחות של עכירות או לבנים מעלה^16,17,18. מסיבות אלה, טכניקה זו שימש לזיהוי באתר של פתוגנים דגים שונים^{17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27}. מטרת מחקר זה היה להקים מהירה, רגיש, מדויק RT-מנורה שיטת זיהוי TiLV. The RT-מנורה מציעה הקרנה של TiLV בדגימות דגים בתוך 30 דקות. ניתן ליישם את הטכניקה לאבחון ומעקב של TiLVD.

Protocol

ניסוי זה, שהיה מעורב בשימוש ברקמת בעלי חיים, אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים והשתמש בוועדה של אוניברסיטת Kasetsart, בנגקוק, תאילנד (פרוטוקול מספר ACKU61-VET-009).

1. אוסף רקמות

1. המתת חסד דגים באמצעות מנת יתר של שמן הציפורן (כלומר, יותר מ 3 מ"ל/L). מתיונין טריקיין יכול לשמש כחלופה לשמן הציפורן.
2. השתמש מספריים ומלקחיים סטרילי לחתוך לפתוח את הבטן של האמנון הנתיחה שלאחר המוות ואת הבלו כ 30-50 מ ג של רקמת הכבד, או באמצעות זכוכית לכסות מיקרוסקופ, לאסוף 100 μL של ריר על ידי גירוד שכבת העור דגים longitudinally (מאחורי לאחוריים) לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה של 1.5 mL.
3. המשך לשלב החילוץ של ה-RNA מיד או שמור על המדגם שנאסף ב--80 ° c עד לניסוי. כמו רנ א שלם רגיש יותר מ-DNA, להשתמש RNase-חינם חומרים ריאגנטים במהלך חילוץ RNA.

2. הוצאת רנ א

1. כדי לחלץ את ה-RNA מן רקמת הכבד, להוסיף 30-50 מ"ג של רקמת האמנון לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL המכיל 600 – 1000 μL של guanidinium-חומצה-להפקת פנול מגיב (שולחן החומרים), ו לרסק את המדגם עד הומוגנית באמצעות יד החזיק רקמות ההומובית. דגימות הרקמה דורשות בערך 10%. מהפקת חומצות החומצה-פנול עבור דגימות הריר, השתמש רק 300 μL של שאיבת החומצות-חומצה-פנול מגיב (3:1).
   התראה: בריאנידיניום-חומצה-פנול מגיב החילוץ רעיל; לכן, הטיפול חייב להתבצע בזהירות. ציוד מגן, כגון משקפי בטיחות, שמלת מעבדה וכפפות בטיחות, חייב להיות שחוק.
2. צנטריפוגה את המדגם הומוגניים ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולהעביר את supernatant לתוך צינור חדש סטרילי 1.5 mL מיקרוצנטריפוגה.
3. הוסיפו נפח שווה של 95% אתנול לצינור וערבבו היטב.
4. להעביר את הפתרון לתוך טור ספין (טבלה של חומרים) ממוקם בצינור אוסף וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השמט את הזרימה והעבר את עמודת הסחרור לצינור אוסף חדש.
5. הוסף 400 μL של מגיב טרום השטיפה של RNA (טבלה של חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר לפני מחיקת הזרימה-through. . חזור על השלב הזה עוד פעם אחת
   הערה: כדי להכין את ה-RNA Pre-לשטוף, להוסיף 10 מ ל של 95% אתנול ל 40 מ ל של RNA לשטוף מראש לרחוץ.
6. הוסף 700 μL של מאגר שטיפת RNA (טבלת חומרים) אל העמודה ואת צנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את העמודה לשפופרת מיקרוצנטריפוגה סטרילית 1.5 mL.
   הערה: כדי להכין מאגר לשטוף RNA, להוסיף 52 mL של 95% אתנול ל 12 מ ל של RNA מאגר לשטוף להתרכז.
7. Elute לדוגמה RNA שנלכד במטריקס טור הספין עם 100 μL של nuclease-מים חינם וצנטריפוגה ב 10,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר.
8. למדוד את הריכוז של ה-RNA שחולצו באמצעות ספקטרוסקופיה מיקרוvolume ולדלל את ה-RNA לריכוז הרצוי באמצעות מים בחינם nuclease.
   הערה: ערך הספיגה המוסמך של OD260/OD280 נע בין 1.6 ל-1.9, ומציין את טוהר ה-RNA המקובל לצורך שיטת ה-RT-מנורה.
9. המשך לשלב הבא באופן מיידי, או השאר את המדגם בשעה 80 ° צ' עד השימוש.

3. פריימר עיצוב

1. השתמש פריימר Explorer גירסה 4 כדי לעצב את צבעי היסוד הספציפיים עבור RT-מנורה. עבור אל אתר האינטרנט, הhttps://primerexplorer.jp/e/ולחץ על לחצן V4 של PrimerExplorer.
2. בחר את הקובץ המכיל את רצפי קטע 3 של TiLV בפורמט FASTA ולאחר מכן לחץ על לחצן עיצוב פריימר .
   הערה: לאחזר את הרצפים בפורמט FASTA מKX631923 מספר ההצטרפות של GenBank, המייצג וירוס אמנון לייק TV1 קטע 3¹.
3. כדי לעצב את התחל, הקלט את הפרמטרים הבסיסיים הבאים:
   -תוכן GC של 40% – 60%
   -אמפליקון של ≥ 280 זוגות בסיס (bp)
   -טמפרטורת ההיתוך דומה (Tm) בין התחל עם הבדל מרבי של 5 ° c
   הערה: אסור להתחל להשלים אחד את השני
   1. הימנע מאזורי רצף הנוטים להרכיב מבנים משניים.
   2. בחרו את האנליזה הדיפית עם מינימום של 3.5 לקבלת עיצוב אופטימלי לΔG הגדול ביותר, ובחרו את קצות התחל בעיצוב מיטבי של הΔG הקטנים.
4. לחץ על לחצן צור .
   הערה: לאחר שהתוכנה מסתיימת בעיבוד נתוני הקלט, התוצאות התחל יוצגו (איור 1).

4. RT-שיטת מנורה

1. להכין לערבב מנורות RT-מנורה המכיל 2.5 μL של 1 x SD II מאגר התגובה, 3 μL של 6 מ"מ MgSO₄, 1.4 μl של 1.4 מ"מ מערכת dntp, 4 μl של 0.8 M בקובץ, 1.3 μl של 0.052 מילימטר calcein, 1 μl של 1.6 μm ליטר-F3, 1 μm, מתוך 1.6 Μv-B3 פריימר, 1 μl של 0.2 ΜM-bip-cp פריימר, 1 μl של 0.2 ΜV-FIP פריימר, 1 μl של 0.3 יו. אן. אנ. איי פולימראז, 1 μl של 0.1 U amv הפוכה הטרנססקריפט, ו 3.8 μl של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
   הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל לפחות 10% מנפח התגובה הכולל.
2. לחלק 22 μL של שילוב מנורה מנורת RT-המנורה לצינור 1.5 מיקרוצנטריפוגה סטרילי.
3. הוסף 3 μL של ה-RNA שחולצו לצינור התגובה, ולערבב את המדגם על ידי vortexing. לשליטה השלילית, השתמשו במים מזוקקים במקום בחומרי RNA.
4. דגירה התגובה ב 65 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 80 ° צ' עבור 10 דקות כדי לסיים את התגובה.
5. לאחר הדגירה, להתבונן באופן חזותי שינויים הצביעה בעין בעירום. תוצאה חיובית תופיע כצבע ירוק פלורסנט.

5. אגבה ג'ל

1. הכינו 1.5% w/v agarose ג'ל על ידי השעיית 0.6 g של אבקת agarose ב 40 mL של 1 x טה מאגר. ממיסים את התערובת על ידי חימום אותו במיקרוגל במשך 3 – 5 דקות עד שהאגקם מומס לחלוטין, ומערבולת לערבב.
2. הניחו לאגקם להתקרר עד שטמפרטורת הטמפרטורה תגיע ל-65 ° c. יוצקים 40 mL של הפתרון agarose על מגש ג'ל ולהוסיף מסרק לתבנית ג'ל.
3. אפשר לג ג'ל להגדיר בטמפרטורת החדר במשך 20 – 30 דקות עד שהוא מתחזק לחלוטין. ואז להסיר את המסרק ולמקם את ג'ל במיכל ג'ל.
4. הוסף מאגר פועל כדי לכסות את המשטח של ג'ל במיכל הג.
5. הוסף 10 μL של הדגם RT-מנורה ו 2 μL של שישה x ג'ל טעינת מאגר לכל טוב. הוסף 5 μL של סולם DNA של 1 kb לנתיב ההתייחסות.
6. חבר את המכסה המצורף לקתודה והאנדה המחובר לספק כוח. הפעל את ספק הכוח, להגדיר אותו קבוע 100 V, ולרוץ עבור 40 דקות.
7. לאחר שסיימו את ההפרדה ג'ל, הסירו את הג ממגש הג. ואז להכתים את ג'ל סחוט באמצעות אתידיום ברומיד (EtBr) בריכוז של 10 מ"ג/mL עבור 7 דקות ו restain אותו מים מזוקקים עבור 5 דקות.
   התראה: EtBr הוא רעיל ונחשב מסרטן; לכן, היזהר בעת השימוש סוכן זה.
8. לחשוף את ג'ל לאור UV באמצעות מערכת התיעוד ג'ל שבו מופיעים להקות, ולצלם את הג.

6. סינתזה של דנ א (cDNA) משלימה

1. להכין מיקס cDNA שילוב מאסטר המכיל 2 μL של 5x RT מאגר, 0.5 μL של פריימר לערבב, 0.5 μL של האנזים RT, ו 2 μL של nuclease-מים חינם לכל תגובה.
   הערה: הכינו מיקס מאסטר עודף הכולל 1 x את התגובה עקב אובדן פוטנציאלי במהלך הליטוף.
2. מערבבים 5 μL של המיקס הראשי לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי 1.5 mL.
3. הוסף 100 ng של RNA המחולצים (שהושג משלב 2.8) לצינור התגובה, לערבב ספין למטה כדי להעביר את כל התערובת לתחתית הכלי.
4. מודיית את התגובות ב 42 ° c עבור 60 דקות, ואחריו 98 ° צ' עבור 5 דקות במכונת ה-PCR. יש לאחסן את cDNA ב-20 ° צ' עד השימוש.

7. RT-qPCR

1. להכין שילוב מאסטר TiLV qPCR המכיל 0.3 μL של 10 μM הפוכה פריימר, 0.3 μL של 10 μM קדימה פריימר, 5 μL של 2x SYBR ירוק DNA פולימראז, ו 0.4 μL של nuclease-מים ללא תשלום לכל תגובה. השתמש בבקרי התחל ובפקדים הבאים:
   פריימר קדימה (TiLV-112F): 5 '-מסכת מעבר
   פריימר הפוכה (TiLV-112R): 5 '-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3 '
2. לחלק 6 μL של מיקס מאסטר TiLV qPCR לתוך כל טוב של רצועת qPCR תואם את הציקלייה תרמית בזמן אמת בשימוש.
3. הוסף 4 μL של תבנית cDNA, שליטה שלילית (nuclease-מים ללא תשלום), בקרה חיובית (10 pg/μL), ו pTiLV (פלבאמצע)¹⁰ או מדולל באופן סדרתי tilv פלמיד לבאר, ולערבב כל מדגם על ידי מצליף. . לנהל כל דוגמא בטרילקטה
4. הציבו את התגובות qPCR לתוך הציקלור התרמי בזמן אמת מתוכנת. הגדר את התוכנית qPCR כדי לבצע את הדגירה ב 95 ° c עבור 3 דקות, ואחריו 40 מחזורים של 95 ° צ' עבור 10 s ו60 ° c עבור 30 לפני השלב עקומת ההיתוך שבו הטמפרטורה צריך לעלות מ-65 ° c כדי 95 ° c במרווחים של ° צלזיוס/5.
5. נהל את ניתוח הנתונים על-ידי הערכת עקומות הגברה והתכה ולאחר מכן חשב את מספר עותקי TiLV באמצעות העקומה הסטנדרטית שמתקבלת מהנתונים באמצעות הפלמידים המדולל באופן סדרתי.

תוצאות

במחקר זה, שיטת RT-המנורה פותחה כדי לזהות זיהום TiLV ב אמנון. דגימות נבדק נאספו 14 חוות ממוקם בחלקים שונים של תאילנד בין 2015 ו 2016. הדגים נגוע ולא נגוע היו מקובצים בעיקר בהתבסס על אבחנות פיזיות הופעות של TiLVD סימפטומים. זיהום TiLV אושר לאחר מכן באמצעות RT-PCR לאחר תהליך האיסוף. האלקטרופורזה בג ג'ל ואיתור צ...

Discussion

תעשיית מידגה מאוימת ברציפות על ידי זיהומים נגיפי הגורמים הפסדים כלכליים ניכרים^9,23,28. למשל, tilv המתעוררים מהווה איום גדול למדינות מניבות אמנון בחלקים רבים של העולם^1,6,9. עד עכשיו, לא היו therapeut...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue collection:
Clove oil	Better Pharma	N/A
Tricaine methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)	ThermoFisher Scientific Corp.	15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)	Geneaid	GZR100
Direct-zol RNA Kit:	Zymo Research	R2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction buffer	Biotechrabbit	BR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)	Sigma-Aldrich	7487-88-9
dNTP set	Bioline	BIO-39053
Betaine	Sigma-Aldrich	B2629
Calcein mixture	Merck	1461-15-0
Bst DNA polymerase	Biotechrabbit	BR1101301
AMV reverse transcriptase	Promega	M510A
Nuclease-free water	Invitrogen	10320995
Elite dry bath incubator, single unit	Major Science	EL-01-220
Gel electrophoresis:
Agarose	Vivantis Technologies	PC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) buffer	Sigma-Aldrich	SRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- Tris	Vivantis Technologies	PR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSURE	Merck Millipore	1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec	Sigma-Aldrich	V800170-500G
Neogreen	NeoScience Co., Ltd.	GR107
DNA gel loading dye (6X)	ThermoFisher Scientific Corp.	R0611
DNA ladder and markers	Vivantis Technologies	PC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)	Bio-Rad	1704487
PowerPac HC power supply	Bio-Rad	1645052
Gel Doc EZ System	Bio-Rad	1708270
UV sample tray	Bio-Rad	1708271
NαBI imager	Neogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT Kit	Toyobo	FSQ-101
Viva cDNA Synthesis Kit	Vivantis Technologies	cDSK01	An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)	ThermoFisher Scientific Corp.	ND-2000
T100 Thermal Cycler	Bio-Rad	1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725120
Nuclease-free water, sterile water	MultiCell	809-115-CL
8-tube PCR strips, white	Bio-Rad	TLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, optical	Bio-Rad	TCS0803
CFX96 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad	1855196
General equipment and materials:
Mayo scissors		N/A
Forceps		N/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)	Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60	LioFuge	CM610
Corning LSE mini microcentrifuge	Corning	6765
Pipettes	Rainin	Pipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tips	Quality Scientific Plastics	TF series
Corning Isotip filtered tips	Merck	CLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST	Wuxi NEST Biotechnology	615601