JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren einen RT-LAMP-Test für den Nachweis von TiLV in Tilapia-Fischen mit einfachen Instrumenten über einen relativ kurzen Zeitraum im Vergleich zu herkömmlichen RT-PCR-Techniken. Dieses Protokoll kann dazu beitragen, die epidemische Ausbreitung von TiLVD, insbesondere in Entwicklungsländern, zu kontrollieren.

Zusammenfassung

Die Tilapia-Seevirus-Krankheit (TiLVD), eine sich abzeichnende Viruserkrankung in Tilapia, die durch das Tilapia-Seevirus (TiLV) verursacht wird, ist eine anhaltende Herausforderung in der Aquakulturindustrie, die in vielen Teilen der Welt zu einer massenhaften Morbidität und Sterblichkeit von Tilapia geführt hat. Ein wirksamer, schneller und genauer diagnostischer Test für TiLV-Infektionen ist daher notwendig, um die anfängliche Infektion zu erkennen und die Ausbreitung der Krankheit in der Aquakulturlandwirtschaft zu verhindern. In dieser Studie wird eine hochempfindliche und praktische Reverse-Transkriptionsschleifen-Schleife-vermittelte isothermale Amplifikation (RT-LAMP) Methode vorgestellt, um Tilapia-Seevirus im Fischgewebe zu erkennen. Ein Vergleich der RT-qPCR- und RT-LAMP-Assays infizierter Proben ergab positive Ergebnisse in 63 (100%) und 51 (80,95%) Proben. Darüber hinaus ergab eine Analyse nicht infizierter Proben, dass alle 63 nicht infizierten Gewebe sowohl bei den RT-qPCR- als auch bei den RT-LAMP-Assays negative Ergebnisse lieferten. Die Kreuzreaktivität mit fünf Krankheitserregern in Tilapia wurde mit RT-LAMP bewertet, und alle Tests zeigten negative Ergebnisse. Sowohl die Leber- als auch die Schleimproben von infizierten Fischen zeigten vergleichbare Ergebnisse mit der RT-LAMP-Methode, was darauf hindeutet, dass Schleim in RT-LAMP als nicht-tödlicher Test verwendet werden kann, um das Töten von Fischen zu vermeiden. Abschließend zeigten die Ergebnisse, dass der vorgestellte RT-LAMP-Assay eine effektive Methode zum TiLV-Nachweis im Tilapiagewebe innerhalb von 1 h bietet. Die Methode wird daher als Screening-Tool in landwirtschaftlichen Betrieben zur schnellen Diagnose von TiLV empfohlen.

Einleitung

Tilapia See Viruskrankheit (TiLVD) ist eine Viruserkrankung in Tilapia(Oreochromis spp.), die Berichten zufolge Tilapia Todesfälle in vielen Regionen der Welt verursacht, einschließlich Asien1,2, Afrika, und Amerika. Die Krankheit wurde erstmals während der Massensterblichkeit von Tilapia im Jahr 2009 in Israel erkannt, wo die Zahl der wilden Tilapia im Kinneret-See dramatisch von 257 auf 8 Tonnen proJahr2 sank. Die Krankheit wird durch das Tilapia-Seevirus (TiLV) verursacht, das der Familie Amnoonviridae als neue Gattung Tilapinevirus und einer neuen Art Tilapia Tilapinevirus3zugeordnet wurde. Die genetische Charakterisierung von TiLV zeigte, dass es sich bei dem Virus um ein neuartiges umhülltes, negativ-sinnliches, einsträngiges RNA-Virus handelt, das 10 Segmente hat, die 10 Proteine1,2,4kodieren. Verschiedene Tilapia-Arten der Gattung Sarotherodon, Oreochromis, und Tilapine und andere warme Wasserfische (z.B. Riesen-Gourami (Osphronemus goramy)) haben sich als anfällig für TiLV2,5erwiesen. Derzeit verbreitet sich dieses Virus weiterhin weltweit, möglicherweise durch die Bewegung von infizierten lebenden Fischen6,7, während das Risiko einer viralen Übertragung über gefrorene Tilapia oder sein Produkt begrenzt ist8. Eine erhebliche Sterblichkeit aufgrund einer TiLV-Infektion hat das Potenzial, erhebliche negative wirtschaftliche Auswirkungen auf die Tilapia-Industrie zu haben. Zum Beispiel wurden die wirtschaftlichen Auswirkungen des Sommersterblichkeitssyndroms in Ägypten im Zusammenhang mit einer TiLV-Infektion auf 100MillionenUS-Dollar 9 berechnet. Daher ist es wichtig, eine schnelle und angemessene Diagnosemethode zu entwickeln, um die Bekämpfung dieser Krankheit in Fischfarmen zu erleichtern.

Bisher basiert die Diagnose TiLVD auf molekularen Assays, viraler Isolation und Histopathologie. Für die TiLV-Diagnose10,11wurden verschiedene PCR-Protokolle und Primer entwickelt. Zum Beispiel wurde eine SYBR-Grün-basierte Reverse-Transkriptions-quantitative PCR-Methode (RT-qPCR) mit der Empfindlichkeit entwickelt und validiert, nur zwei Kopien/L des Virus zuerkennen. Andere PCR-Methoden für die TiLV-Erkennung sind TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, geschachtelte RT-PCR12und semi-nested RT-PCR13. Diese Methoden erfordern jedoch ausgeklügelte Laborausrüstung und relativ lange Zeiträume, um aufgrund der Komplexität der Reaktionen Ergebnisse zu erzielen, was sie für die Feldanwendung ungeeignet macht.

Der schleifenvermittelte isotherme Amplifikationstest (LAMP) ist ein schneller, einfacher und praktischer For-Field-Anwendung14,15. Die Technik verwendet das Prinzip einer Strangverschiebungsreaktion, während die Amplifikationsreaktion unter isothermen Bedingungen ohne einen ausgeklügelten und teuren Thermischen Cycler14,15läuft. Daher werden verstärkte LAMP-Produkte oder RT-LAMP-Produkte in leiterartigen Bändern mit Agarose-Gel-Elektrophorese mit einem fluoreszierenden Fleck entweder zur sicheren Visualisierung von DNA oder RNA14 oder zur Beobachtung mit bloßem Auge auf das Vorhandensein von Trübung oder einem weißen Niederschlag16,17,18analysiert. Aus diesen Gründen wurde diese Technik für den Nachweis verschiedener Fischpathogene vor Ort17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Der Zweck dieser Studie war es, einen schnellen, empfindlichen und genauen RT-LAMP-Test für die TiLV-Erkennung zu etablieren. Der RT-LAMP-Test bietet ein Screening auf TiLV in Fischproben innerhalb von 30 min. Die Technik kann für die Diagnose und Überwachung von TiLVD angewendet werden.

Protokoll

Dieses Experiment, das die Verwendung von tierischem Gewebe beinhaltete, wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee der Kasetsart University, Bangkok, Thailand (Protokollnummer ACKU61-VET-009) genehmigt.

1. Gewebesammlung

  1. Euthanisieren Tilapia-Fische mit einer Überdosierung von Nelkenöl (d. h. mehr als 3 ml/L). Tricain-Methansulfonat kann als Alternative zu Nelkenöl verwendet werden.
  2. Verwenden Sie sterile Mayo-Schere und Zange, um den Bauch der postmortalen Tilapia zu schneiden und etwa 30–50 mg Lebergewebe zu verbrauchen, oder mit einem Mikroskop-Abdeckungglas, sammeln Sie 100 L Schleim, indem Sie die Fischhautschicht längs (von vorderzu- bis nachhinten) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr kratzen.
  3. Fahren Sie sofort mit dem RNA-Extraktionsschritt fort oder halten Sie die entnommene Probe bis zum Experiment bei 80 °C. Da intakte RNA empfindlicher ist als DNA, verwenden Sie RNase-freie Materialien und Reagenzien während der RNA-Extraktion.

2. RNA-Extraktion

  1. Um die RNA aus dem Lebergewebe zu extrahieren, fügen Sie 30–50 mg des Tilapiagewebes in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr mit 600–1.000 l Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenz(Materialtabelle)ein und pulverisieren die Probe bis zur Homogenisierung mit einem Handgewebehomogenisator. Die Gewebeproben benötigen ca. 10% des Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenzes. Für die Schleimproben nur 300 l des Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenzes (3:1) verwenden.
    VORSICHT: Das Guanidinium-Säure-Phenol-Extraktionsreagenz ist giftig; daher muss die Handhabung mit Sorgfalt erfolgen. Schutzausrüstungen wie Schutzbrillen, ein Laborkleid und Sicherheitshandschuhe müssen getragen werden.
  2. Zentrifugieren Sie die homogenisierte Probe bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur und übertragen Sie den Überstand in ein neues steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  3. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 95% Ethanol in das Rohr und mischen Sie gut.
  4. Übertragen Sie die Lösung in eine Spin-Säule (Materialtabelle), die in einem Sammelrohr und einer Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur platziert ist. Verwerfen Sie den Durchfluss, und übertragen Sie die Spinspalte in ein neues Sammelrohr.
  5. Fügen Sie der Säule und zentrifugieren den Bereich 400 l RNA-Vorwaschreagenz (Materialtabelle) bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur hinzu, bevor Sie den Durchfluss entsorgen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
    HINWEIS: Um die RNA Pre-Wash vorzubereiten, fügen Sie 10 ml 95% Ethanol zu 40 ml RNA Pre-Wash Konzentrat hinzu.
  6. Fügen Sie der Säule und zentrifugieren 700 l RNA-Waschpuffer (Materialtabelle) bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur hinzu. Übertragen Sie die Säule in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
    HINWEIS: Um den RNA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 52 ml 95% Ethanol zu 12 ml RNA Wash Buffer Konzentrat hinzu.
  7. Elute die RNA-Probe in der Spin-Säulen-Matrix mit 100 l nukleasefreies Wasser und Zentrifuge bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur.
  8. Messen Sie die Konzentration der extrahierten RNA mit einem Mikrovolumenspektrophotometer und verdünnen Sie die RNA mit nukleasefreiem Wasser auf eine gewünschte Konzentration.
    HINWEIS: Der qualifizierte Absorptionswert von OD260/OD280 reicht von 1,6 bis 1,9, was auf die akzeptable RNA-Reinheit für den RT-LAMP-Test hinweist.
  9. Fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort, oder halten Sie die Probe bis zur Verwendung bei 80 °C.

3. Primer-Design

  1. Verwenden Sie Primer Explorer Version 4, um die spezifischen Primer für den RT-LAMP zu entwerfen. Gehen Sie zur Website, https://primerexplorer.jp/e/, und klicken Sie auf die Schaltfläche PrimerExplorer V4.
  2. Wählen Sie die Datei mit den Sequenzen von Segment 3 von TiLV im FASTA-Format aus, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Primer Design.
    HINWEIS: Rufen Sie die Sequenzen im FASTA-Format von der GenBank-Beitrittsnummer KX631923 ab, die tilapia lake virus TV1 Segment 31darstellt.
  3. Um die Primer zu entwerfen, geben Sie die folgenden Grundparameter ein:
    - Ein GC-Gehalt von 40%–60%
    - Ein Amplicon von 280 Basenpaaren (bp)
    - Eine ähnliche Schmelztemperatur (Tm) unter Primern mit einer maximalen Differenz von 5 °C
    ANMERKUNG: Die Primer dürfen sich nicht ergänzen
    1. Vermeiden Sie Sequenzbereiche, die anfällig für die Bildung von Sekundärstrukturen sind.
    2. Wählen Sie die Dimer-Primer-Analyse mit einem Minimum von 3,5 € für ein optimales Design für das größte G aus, und wählen Sie die Enden der Primer mit einem Maximum von 4 € für ein optimales Design für das kleinere G aus.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Generieren.
    HINWEIS: Nachdem die Software die Verarbeitung der Eingabedaten abgeschlossen hat, werden die Primer-Ergebnisse angezeigt (Abbildung 1).

4. RT-LAMP-Test

  1. Bereiten Sie einen RT-LAMP-Master-Mix vor, der 2,5 l 1x SD II-Reaktionspuffer, 3 l mit 6 mM MgSO4, 1,4 l mit 1,4 mM dNTP-Set, 4 l mit 0,8 m Betain, 1,3 l mit 0,052 ml Calcein-Mischung, 1 ,6 l TiLV-F3-Primer, 1 L mit 1,6 M TiLV-B3-Primer, 1 l 0,2-M-TiLV-BIP-Primer, 1 l 0,2-M-TiLV-FIP-Primer, 1 l 0,3-U-BST-DNA-Polymerase, 1 L 0,1 U AMV-Reverse-Transkriptase und 3,8 l nukleasefreies Wasser pro Reaktion.
    HINWEIS: Bereiten Sie einen überschüssigen Master-Mix vor, der mindestens 10 % des gesamten Reaktionsvolumens umfasst.
  2. Geben Sie 22 l des RT-LAMP-Master-Mix in ein steriles 1,5-Mikrozentrifugenrohr.
  3. Fügen Sie dem Reaktionsröhrchen 3 l der extrahierten RNA hinzu und mischen Sie die Probe durch Wirbeln. Verwenden Sie für die Negativkontrolle destilliertes Wasser anstelle von RNA-Materialien.
  4. Inkubieren Sie die Reaktion bei 65 °C für 60 min, gefolgt von 80 °C für 10 min, um die Reaktion zu beenden.
  5. Beobachten Sie nach der Inkubation die farbmetrischen Veränderungen visuell mit bloßem Auge. Ein positives Ergebnis erscheint als fluoreszierende grüne Farbe.

5. Agarose-Gel-Elektrophorese

  1. Bereiten Sie ein 1,5% w/v Agarose-Gel vor, indem Sie 0,6 g Agarosepulver in 40 ml 1x TAE-Puffer aufhängen. Schmelzen Sie die Mischung, indem Sie sie in einer Mikrowelle für 3-5 min erwärmen, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist, und wirbeln, um zu mischen.
  2. Lassen Sie die Agarose abkühlen, bis die Temperatur 65 °C erreicht. 40 ml der Agarose-Lösung auf ein Geltablett geben und der Gelform einen Kamm hinzufügen.
  3. Lassen Sie das Agarose-Gel auf Raumtemperatur für 20 bis 30 min einstellen, bis es vollständig erstarrt ist. Dann entfernen Sie den Kamm und legen Sie das Gel in den Geltank.
  4. Fügen Sie einen Laufpuffer hinzu, um die Oberfläche des Gels im Geltank zu bedecken.
  5. Fügen Sie jedem Bohrkörper 10 L der RT-LAMP-Probe und 2 l 6x Gel-Ladepuffer hinzu. Fügen Sie der Referenzspur 5 l einer 1 kb DNA-Leiter hinzu.
  6. Schließen Sie den Deckel an der Kathode und die Anode an, die an ein Netzteil angeschlossen ist. Schalten Sie das Netzteil ein, stellen Sie es auf eine konstante 100 V und laufen Sie für 40 min.
  7. Nach Abschluss der Geltrennung das Gel aus der Gelschale entfernen. Dann färben Sie das abgetropfte Gel mit Ethidiumbromid (EtBr) in einer Konzentration von 10 mg/ml für 7 min und restain es in destilliertem Wasser für 5 min.
    VORSICHT: EtBr ist giftig und gilt als krebserregend; Seien Sie daher vorsichtig, wenn Sie diesen Agenten verwenden.
  8. Setzen Sie das Gel UV-Licht mit einem Gel-Dokumentationssystem aus, in dem Bänder auftreten, und machen Sie ein Bild des Gels.

6. Komplementäre DNA-Synthese (cDNA)

  1. Bereiten Sie einen cDNA-Synthese-Master-Mix vor, der 2 l 5x RT-Puffer, 0,5 l Primer-Mix, 0,5 l RT-Enzym und 2 l nukleasefreies Wasser pro Reaktion enthält.
    HINWEIS: Bereiten Sie überschüssige Master-Mix bestehend aus 1x der Reaktion aufgrund eines potenziellen Verlustes während der Pipettierung.
  2. Geben Sie 5 l des Master-Mix in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
  3. 100 ng der verdünnten extrahierten RNA (erhalten aus Schritt 2.8) in das Reaktionsrohr geben, mischen und nach unten drehen, um die gesamte Mischung auf den Boden des Gefäßes zu bewegen.
  4. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 42 °C für 60 min, gefolgt von 98 °C für 5 min in einer PCR-Maschine. Bewahren Sie die cDNA bis zur Verwendung bei 20 °C auf.

7. RT-qPCR

  1. Bereiten Sie einen TiLV qPCR-Master-Mix vor, der 0,3 l mit 10 ,M Reverse primer, 0,3 l von 10 'M Vorwärtsgrundierung, 5 'L mit 2x SYBR Green DNA Polymerase und 0,4 'L Nuklease-freies Wasser pro Reaktion enthält. Verwenden Sie die folgenden Primer und Steuerelemente:
    Vorwärtsgrundierung (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
    Reverse Primer (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGAGAAGTTCT-3'
  2. Geben Sie 6 l des TiLV qPCR Master-Mix in jede Bohrung des qPCR-Streifens, der mit dem verwendeten Echtzeit-Thermocycler kompatibel ist.
  3. Fügen Sie 4 l der cDNA-Vorlage, Negativkontrolle (nukleasefreies Wasser), Positivkontrolle (10 pg/l) und pTiLV (Plasmid)10 oder seriell verdünntes TiLV-Plasmid in den Brunnen ein, und mischen Sie jede Probe durch Flicken. Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung durch.
  4. Legen Sie die qPCR-Reaktionen in den programmierten Echtzeit-Thermocycler. Stellen Sie das qPCR-Programm so ein, dass die Inkubation 3 min bei 95 °C durchgeführt wird, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 10 s und 60 °C für 30 s vor dem Schmelzkurvenschritt, in dem die Temperatur von 65 °C auf 95 °C in Schritten von 0,5 °C/5 s ansteigen muss.
  5. Führen Sie die Datenanalyse durch Auswerten der Amplifikations- und Schmelzkurven durch und berechnen Sie dann die Anzahl der TiLV-Kopien mithilfe der Standardkurve, die aus den Daten gewonnen wird, mit den seriell verdünnten Plasmiden.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde ein RT-LAMP-Test entwickelt, um eine TiLV-Infektion in Tilapia zu erkennen. Die getesteten Proben wurden zwischen 2015 und 2016 von 14 Farmen in verschiedenen Teilen Thailands entnommen. Die infizierten und nicht infizierten Fische wurden in erster Linie auf der Grundlage physikalischer Diagnosen und des Auftretens von symptomatischer TiLVD gruppiert. TiLV-Infektion wurde anschließend mit RT-PCR nach dem Entnahmeprozess bestätigt. Als Auswertungsmethoden der LAMP-Amplicons (A...

Diskussion

Die Aquakulturindustrie ist ständig von Virusinfektionen bedroht, die erhebliche wirtschaftliche Verluste verursachen9,23,28. Zum Beispiel stellt die aufstrebende TiLV eine große Bedrohung für Tilapia produzierende Länder in vielen Teilen der Welt1,6,9. Bisher gab es keine spezifischen Therapeutika zur Verhinderung von TiLVD. Währe...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Das Projekt wird vom Thailand Research Fund (TRF) Förderstück RDG6050078 und dem Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand im Rahmen des Higher Education Research Promotion and National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand, finanziert. Die Forschung wird zum Teil durch das Graduate Program Stipendium der Graduate School, Kasetsart University, unterstützt. Die Autoren danken Dr. Kwanrawee Sirikanchana für die Erzählung des Videos und Piyawatchara Sikarin für die Bearbeitung des Videos.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue collection:
Clove oilBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)ThermoFisher Scientific Corp.15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction bufferBiotechrabbitBR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaineSigma-AldrichB2629
Calcein mixtureMerck1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
Nuclease-free waterInvitrogen10320995
Elite dry bath incubator, single unitMajor ScienceEL-01-220
Gel electrophoresis:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
DNA gel loading dye (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
DNA ladder and markersVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)Bio-Rad1704487
PowerPac HC power supplyBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
UV sample trayBio-Rad1708271
NαBI imagerNeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Nuclease-free water, sterile waterMultiCell809-115-CL
8-tube PCR strips, whiteBio-RadTLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, opticalBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
General equipment and materials:
Mayo scissorsN/A
ForcepsN/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrifugeCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tipsQuality Scientific PlasticsTF series
Corning Isotip filtered tipsMerckCLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NESTWuxi NEST Biotechnology615601

Referenzen

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Immunologie und InfektionAusgabe 159Tilapia SeevirusDiagnoseTilapiaRT LAMPRT qPCRScreening Tool

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten