JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем RT-LAMP анализ для обнаружения TiLV в тилапии рыбы с использованием простых инструментов в течение относительно короткого периода времени по сравнению с обычными методами RT-PCR. Этот протокол может помочь в борьбе с эпидемическим распространением TiLVD, особенно в развивающихся странах.

Аннотация

Болезнь озерного озера Тилапия (TiLVD), зарождающееся вирусное заболевание в тилапии, вызванное вирусом озера тилапия (TiLV), является постоянной проблемой в аквакультуре, которая привела к массовой заболеваемости и смертности тилапии во многих частях мира. Таким образом, для выявления первоначальной инфекции и предотвращения распространения заболевания в аквакультурном сельском хозяйстве необходим эффективный, быстрый и точный диагностический тест на инфекцию TiLV. В этом исследовании, очень чувствительныи и практические обратной транскрипции цикл опосредованного изотермального усиления (RT-LAMP) метод представлен для обнаружения вируса озера тилапии в рыбной ткани. Сравнение анализов RT-qPCR и RT-LAMP инфицированных образцов показало положительные результаты в 63 (100%) и 51 (80.95%) образцы, соответственно. Кроме того, анализ неинфицированных образцов показал, что все 63 неинфицированных тканей дали отрицательные результаты как для анализов РТ-кПЦР, так и для RT-LAMP. Перекрестная реактивность с пятью патогенами в тилапии оценивалась с помощью RT-LAMP, и все тесты показали отрицательные результаты. Оба печени и слизи образцов, полученных из инфицированных рыб показали сопоставимые результаты с помощью метода RT-LAMP, предполагая, что слизь может быть использована в RT-LAMP как нелетальный ассс, чтобы избежать убийства рыбы. В заключение, результаты показали, что представленный анализ RT-LAMP обеспечивает эффективный метод для обнаружения TiLV в ткани тилапии в течение 1 ч. Поэтому метод рекомендуется в качестве скринингового инструмента на фермах для быстрой диагностики TiLV.

Введение

Болезнь озера Tilapia (TiLVD) является вирусным заболеванием в тилапии(Oreochromis spp.), которая, как сообщается, вызывает смерть от тилапии во многих регионах мира, включая Азию1,2, Африку и Америку. Болезнь была впервые признана во время массовой смертности тилапии в 2009 году в Израиле, где количество диких тилапий в озере Киннерет резко упало с 257 до 8 тонн в год2. Болезнь вызвана вирусом озера Тилапия (TiLV), который был назначен семье Amnoonviridae как новый род Tilapinevirus и новый вид Tilapia tilapinevirus3. Генетическая характеристика TiLV показала, что вирус является новым окутанным, отрицательным смыслом, одноцепочечным РНК-вирусом, который имеет 10 сегментов, кодирующих 10 белков1,,2,,4. Различные виды тилапии в роду Sarotherodon, Oreochromis, и Тилапин и другие теплые рыбы воды (например, гигантские гурами (Osphronemus goramy)) было показано, чтобы быть восприимчивыми к TiLV2,5. В настоящее время этот вирус продолжает распространяться по всему миру, возможно, через движение инфицированных живой рыбы6,7, в то время как риск вирусной передачи через замороженные тилапии или его продукт ограничен8. Существенная смертность от инфекции TiLV может оказать значительно пагубное экономическое воздействие на индустрию тилапии. Например, экономический эффект от летнего синдрома смертности в Египте, связанный с инфекцией TiLV, был рассчитан на US$100 млн9. Соответственно, важно разработать быстрый и надлежащий метод диагностики для облегчения борьбы с этим заболеванием в рыбоводных хозяйствах.

До сих пор диагноз TiLVD был основан на молекулярных анализах, вирусной изоляции и гистопатологии. Для диагностики TiLV10,,11были разработаны различные протоколы ПЦР и грунтовки. Например, sYBR зеленый основе обратной транскрипции количественного ПЦР (RT-qPCR) метод с чувствительностью для обнаружения всего лишь две копии / КЛ вируса была разработана и проверена для обнаружения TiLV10. Другие методы ПЦР для обнаружения TiLV включают TaqMan количественные PCR11, RT-PCR2, вложенный RT-PCR12, и полу-гнездо RT-PCR13. Однако эти методы требуют сложного лабораторного оборудования и относительно длительных периодов времени для получения результатов из-за сложности реакций, что делает их непригодными для применения на местах.

Цикл опосредованное изотермального усиления (LAMP) анализ является быстрым, простым и практичным для поля применения14,15. Техника использует принцип реакции смещения нити, в то время как реакция усиления проходит в изотермических условиях без сложного и дорогого теплового циклизатора14,15. Следовательно, усиленные продукты LAMP или продукты RT-LAMP анализируются в трапа-подобных полосах с использованием электрофореза геля агарозы с флуоресцентным пятном либо для безопасной визуализации ДНК или РНК14, либо наблюдения невооруженным глазом за наличие мутной или белой осадки16,17,18. По этим причинам данная методика была использована для обнаружения на месте различных рыбных патогенов17,,18,,19,,20,,21,,22,,23,,24,,25,,26,,27. Целью данного исследования было создание быстрого, чувствительного и точного исследования RT-LAMP для обнаружения TiLV. Анализ RT-LAMP предлагает скрининг на TiLV в образцах рыбы в течение 30 минут. Методика может быть применена для диагностики и наблюдения TiLVD.

протокол

Этот эксперимент, который включал в себя использование тканей животных, был одобрен Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Касетсарта, Бангкок, Таиланд (протокольный номер ACKU61-VET-009).

1. Коллекция тканей

  1. Эвтанизировать рыбу тилапии с помощью передозировки гвоздики (т.е. более 3 мл/л). Трикаин метанесульфонат может быть использован в качестве альтернативы гвоздики нефти.
  2. Используйте стерильные ножницы майонеза и щипцы, чтобы разрезать живот посмертной тилапии и акцизпримерно примерно 30-50 мг ткани печени, или с помощью микроскопа крышка стекла, собрать 100 л слизи, соскоб слоя кожи рыбы продольно (от передней до задней) в 1,5 мl microcentrifuge трубки.
  3. Немедленно приступайте к этапу извлечения РНК или держите собранный образец на уровне 80 градусов по Цельсию до проведения эксперимента. Поскольку нетронутая РНК более чувствительна, чем ДНК, используйте безробляющие материалы и реагенты во время извлечения РНК.

2. Добыча РНК

  1. Чтобы извлечь РНК из ткани печени, добавьте 30-50 мг ткани тилапии в микроцентрифугную трубку площадью 1,5 мл, содержащую 600–1000 л гванидина-кислотно-фенола,Table of Materialsи распылите образец до однородного с помощью однородного гомогенизатора ткани. Образцы тканей требуют примерно 10% от гуанидиний-кислотно-фенол экстракционного реагента. Для образцов слизи используйте только 300 л из гетанидиний-кислотно-фенол экстрактного реагента (3:1).
    ВНИМАНИЕ: гуанидиний-кислотно-фенол экстракционный реагент является токсичным; следовательно, обращение должно осуществляться с осторожностью. Необходимо носить защитное оборудование, такое как защитные очки, лабораторное платье и защитные перчатки.
  2. Центрифугиговый гомогенизированный образец при температуре 10 000 х г при комнатной температуре и перенесите супернатант в новую стерильную микроцентрифугную трубку размером 1,5 мл.
  3. Добавить равный объем 95% этанола в трубку и хорошо перемешать.
  4. Перенесите раствор в спин-колонку(Таблица материалов),помещенную в коллекторную трубку и центрифугу при температуре 10 000 х г на 30 с при комнатной температуре. Отбросьте протекаемый поток и перенесите вращаемую колонку в новую трубку сбора.
  5. Добавьте 400 qL реагента РНК Pre-Wash(Таблица материалов)в колонку и центрифугу при температуре 10 000 х г на 30 с при комнатной температуре, прежде чем отбросить поток через. Повторите этот шаг еще раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подготовить РНК Pre-Wash, добавить 10 мл 95% этанола до 40 мл РНК Pre-Wash концентрата.
  6. Добавьте 700 кЛ буфера ДЛЯ мытья РНК(Таблица материалов)в колонку и центрифугу при температуре 10 000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Перенесите колонку в стерильную микроцентрифуговую трубку мощностью 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки РНК мыть буфер, добавить 52 мл 95% этанола до 12 мл РНК мыть буфера концентрата.
  7. Выясните образец РНК, захваченный в матрице вращательной колонки с 100 злителем безнуточной воды и центрифугой при температуре 10 000 х г при комнатной температуре.
  8. Измерьте концентрацию извлеченной РНК с помощью микротомного спектрофотометра и разбавьте РНК до нужной концентрации с помощью воды без нуклеаза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Квалифицированная стоимость абсорбции OD260/OD280 колеблется от 1,6 до 1,9, что указывает на приемлемую чистоту РНК для оценки RT-LAMP.
  9. Немедленно приступайте к следующему шагу или держите образец на уровне 80 градусов по Цельсию до использования.

3. Дизайн Праймера

  1. Используйте версию Primer Explorer 4 для разработки конкретных праймеров для RT-LAMP. Перейдите на веб-сайт, https://primerexplorer.jp/e/ и нажмите на кнопку PrimerExplorer V4.
  2. Выберите файл, содержащий последовательности сегмента 3 TiLV в формате FASTA, а затем нажмите кнопку Primer Design.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлекать последовательности в формате FASTA от номера присоединения GenBank KX631923, который представляет вирус озера Tilapia TV1 сегмент 31.
  3. Для проектирования грунтовок ввешай следующие основные параметры:
    - Содержание GC 40%-60%
    - Ампликон из 280 базовых пар (bp)
    - Аналогичная температура плавления (ТМ) среди грунтовок с максимальной разницей в 5 градусов по Цельсию
    ПРИМЕЧАНИЕ: грунтовки не должны дополнять друг друга
    1. Избегайте последовательности регионов, склонных к формированию вторичных структур.
    2. Выберите анализ димера грунтовки с минимумом 3,5 евро для оптимального дизайна для самого большого G, и выберите концы грунтовок с максимумом 4 евро для оптимального дизайна для меньшего ЗГ.
  4. Нажмите кнопку «Создание».
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как программное обеспечение закончит обработку входных данных, будут показаны результаты праймера(рисунок 1).

4. RT-LAMP асссеи

  1. Подготовьте мастер-микс RT-LAMP, содержащий 2,5 л 1x SD II реакционного буфера, 3 л 6 мМ MgSO4, 1,4 мМ dNTP набор, 4 зл 0,8 М бетаин, 1,3 л 0,052 мМ кальцина смеси, 1 л 1,6 мкм TiLV-F3 1 кЛ 1,6 мКм TiLV-B3 грунтовка, 1 л 0,2 мкм TiLV-BIP грунтовка, 1 л 0,2 мкм TiLV-FIP грунтовка, 1 Л л 0,3 U Bst ДНК полимеразы, 1 Л 0,1 U AMV транскриптазы, и 3,8 л безреакции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка избыточной мастер-микс, состоящая не менее 10% от общего объема реакции.
  2. Распределить 22 зл и мастер-микс RT-LAMP в стерильную 1,5 микроцентрифуговую трубку.
  3. Добавьте в реакционную трубку 3 зЛ извлеченной РНК и смешайте образец путем вихря. Для отрицательного контроля используйте дистиллированную воду вместо РНК-материалов.
  4. Инкубировать реакцию при 65 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 80 градусов по Цельсию в течение 10 минут, чтобы прекратить реакцию.
  5. После инкубации визуально наблюдайте за колористыми изменениями невооруженным глазом. Положительный результат будет отображаться как флуоресцентный зеленый цвет.

5. Электрофораз геля Агарозе

  1. Подготовьте 1,5% w/v агарозный гель, приостановив 0,6 г порошка агарозы в 40 мл 1x буфера TAE. Растопить смесь, нагревая ее в микроволновой печи в течение 3-5 минут, пока агароза полностью растворяется, и вихрь, чтобы смешать.
  2. Дайте агарозе остыть до тех пор, пока температура не достигнет 65 градусов по Цельсию. Налейте 40 мл раствора агарозы на лоток геля и добавьте гребень в форму геля.
  3. Разрешить гель агарозы установить при комнатной температуре в течение 20-30 минут, пока он полностью затвердел. Затем снимите гребень и поместите гель в гель бак.
  4. Добавьте бегущий буфер, чтобы покрыть поверхность геля в гелевом баке.
  5. Добавьте 10 злител к каждой скважине 10 злиц образца RT-LAMP и 2 л 6-х гель-буфера для загрузки геля. Добавьте 5 кЛ 1 кБ ДНК лестницы к справочной полосе.
  6. Подключите крышку, прикрепленную к катоду и аноду, подключенному к источнику питания. Включите блок питания, установите его на постоянную 100 В, и запустить в течение 40 минут.
  7. После завершения разделения геля, удалить гель из лотка геля. Затем пятно осушенных гель с помощью бромистого этидия (EtBr) в концентрации 10 мг/мл в течение 7 мин и отдохнуть его в дистиллированной воде в течение 5 мин.
    ВНИМАНИЕ: EtBr является токсичным и считается канцерогеном; поэтому будьте осторожны при использовании этого агента.
  8. Выставить гель на ультрафиолетовый свет с помощью системы документации геля, где появляются полосы, и сфотографировать гель.

6. Дополнительный синтез ДНК (кДНК)

  1. Подготовьте мастер-микс синтеза кДНК, содержащий 2 злиц 5-кратного буфера RT, 0,5 л грунтового микса, 0,5 л фермента RT и 2 злитроводы без нуклеазы воды на реакцию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка избыточной мастер смеси, состоящей из 1x реакции из-за потенциальной потери во время пипетки.
  2. Распределить 5 зЛ мастер смеси в стерильной 1,5 мл микроцентрифуговой трубки.
  3. Добавьте 100 нг разбавленной РНК (полученную со ступени 2.8) в реакционную трубку, перемешайте и закрутите вниз, чтобы переместить всю смесь на дно сосуда.
  4. Инкубировать реакции при 42 градусах по Цельсию в течение 60 минут, а затем 98 градусов по Цельсию в течение 5 минут в машине ПЦР. Храните кДНК при 20 градусах Цельсия до использования.

7. РТ-кПКР

  1. Подготовьте мастерскую смесь TiLV qPCR, содержащую 0,3 зл и 10 мкм обратной грунтовки, 0,3 л из 10 мкм вперед грунтовки, 5 qL 2x SYBR Green DNA полимеразы, и 0,4 л безнужной воды в реакции. Используйте следующие грунтовки и элементы управления:
    Форвард праймер (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAGAGGCAATGGATT-3'
    Обратная грунтовка (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTTCAGTATATAGTTCT-3'
  2. Распределить 6 зл мастер-микс TiLV qPCR в каждую скважину полосы qPCR, совместимую с используемым тепловым циклом в реальном времени.
  3. Добавьте 4 зликат шаблона кДН, отрицательный контроль (безнужная вода), положительный контроль (10 пг/Зл) и pTiLV (плазмид)10 или последовательно разбавленной плазмидной TiLV к скважине, и смешайте каждый образец, щелкая. Проведите каждый образец в тройном.
  4. Поместите реакции qPCR в запрограммированный тепловой цикл в реальном времени. Установите программу qPCR для выполнения инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 3 мин, а затем 40 циклов 95 градусов по Цельсию для 10 с и 60 градусов по Цельсию на 30 с до шага плавильной кривой, в котором температура должна увеличиться с 65 градусов по Цельсию до 95 градусов по Цельсию при приращениях 0,5 градуса по Цельсию.
  5. Проведите анализ данных, оценивая кривые усиления и плавления, а затем вычисляйте количество копий TiLV с помощью стандартной кривой, полученной из данных, используя последовательно разбавленные плазмиды.

Результаты

В этом исследовании, RT-LAMP асссе был разработан для обнаружения инфекции TiLV в тилапии. Испытания были собраны на 14 фермах, расположенных в разных частях Таиланда в период с 2015 по 2016 год. Инфицированные и неинфицированные рыбы были в основном сгруппированы на основе физических диагнозов и...

Обсуждение

Аквакультура промышленности постоянно находится под угрозой вирусных инфекций, которые вызывают значительные экономические потери9,23,28. Например, возникающие TiLV представляет собой серьезную угрозу для тилапии-производителей во мног...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Проект финансируется финансово Таиланд исследовательский фонд (TRF) грант номер RDG6050078 и Центр передовых исследований в области сельского хозяйства и продовольствия, Институт перспективных исследований, Университет Касетарт, Бангкок, Таиланд в рамках высшего образования научно-исследовательский фонд и Национальный исследовательский университет проекта Таиланда, Управление Высшего образования комиссии, Министерство образования, Таиланд. Исследование частично поддерживается стипендией для выпускников Высшей школы, Университет Касетсарта. Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кванрави Сириканчана за рассказ о видео и Piyawatchara Сикарина для редактирования видео.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue collection:
Clove oilBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)ThermoFisher Scientific Corp.15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction bufferBiotechrabbitBR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaineSigma-AldrichB2629
Calcein mixtureMerck1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
Nuclease-free waterInvitrogen10320995
Elite dry bath incubator, single unitMajor ScienceEL-01-220
Gel electrophoresis:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
DNA gel loading dye (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
DNA ladder and markersVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)Bio-Rad1704487
PowerPac HC power supplyBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
UV sample trayBio-Rad1708271
NαBI imagerNeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Nuclease-free water, sterile waterMultiCell809-115-CL
8-tube PCR strips, whiteBio-RadTLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, opticalBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
General equipment and materials:
Mayo scissorsN/A
ForcepsN/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrifugeCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tipsQuality Scientific PlasticsTF series
Corning Isotip filtered tipsMerckCLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NESTWuxi NEST Biotechnology615601

Ссылки

  1. Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
  2. Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
  3. Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
  4. Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
  5. Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
  6. Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , (2017).
  7. Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
  8. Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
  9. Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
  10. Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
  11. Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
  12. Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
  13. Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
  14. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), 63 (2000).
  15. Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
  16. Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
  17. Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
  18. Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
  19. Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
  20. Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
  21. Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
  22. Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
  23. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
  24. Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
  25. Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
  26. Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
  27. Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
  28. Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
  29. Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
  30. Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
  31. Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
  32. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  33. Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
  34. Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
  35. Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
  36. Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
  37. Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
  38. Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
  39. Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159RT LAMPRT qPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены