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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.

Résumé

La maladie du virus du lac de Tilapia (TiLVD), une maladie virale émergente du tilapia causée par le virus du lac tilapia (TiLV), est un défi persistant dans l’industrie aquacole qui a entraîné la morbidité et la mortalité massives du tilapia dans de nombreuses régions du monde. Un essai diagnostique efficace, rapide et précis pour l’infection de TiLV est donc nécessaire pour détecter l’infection initiale et pour empêcher la propagation de la maladie dans l’agriculture aquacole. Dans cette étude, une méthode très sensible et pratique d’amplification isothermale (RT-LAMP) de transcription inverse très sensible et pratique est présentée pour détecter le virus du lac de tilapia dans les tissus du poisson. Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP d’échantillons infectés a révélé des résultats positifs dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. En outre, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs pour les essais RT-qPCR et RT-LAMP. La réactivité croisée avec cinq agents pathogènes dans le tilapia a été évaluée à l’aide de RT-LAMP, et tous les tests ont montré des résultats négatifs. Les échantillons de foie et de mucus obtenus à partir de poissons infectés ont montré des résultats comparables en utilisant la méthode RT-LAMP, suggérant que le mucus peut être utilisé dans RT-LAMP comme un essai non létal pour éviter de tuer des poissons. En conclusion, les résultats ont démontré que l’essai RT-LAMP présenté fournit une méthode efficace pour la détection de TiLV dans le tissu de tilapia dans un rayon de 1 h. La méthode est donc recommandée comme outil de dépistage sur les fermes pour le diagnostic rapide de TiLV.

Introduction

La maladie par le virus du lac de Tilapia (TiLVD) est une maladie virale dans le tilapia(Oreochromis spp.) qui causerait des décès de tilapia dans de nombreuses régions du monde, y compris l’Asie1,2, l’Afrique et l’Amérique. La maladie a été identifiée pour la première fois lors de la mortalité massive du tilapia en 2009 en Israel, où le nombre de tilapia sauvage dans le lac Kinneret a chuté de façon spectaculaire, passant de 257 à 8 tonnes par an2. La maladie est causée par le virus du lac de tilapia (TiLV), qui a été attribué à la famille Amnoonviridae comme un nouveau genre Tilapinevirus et une nouvelle espèce Tilapia tilapinevirus3. La caractérisation génétique de TiLV a montré que le virus est un nouveau, négatif-sens, virus de l’ARN à brin unique qui a 10 segments codant 10 protéines1,2,4. Diverses espèces de tilapia dans le genre Sarotherodon, Oreochromis, et Tilapine et d’autres poissons d’eau chaude (par exemple, gourami géant (Osphronemus goramy))ont été montrés pour être sensibles à TiLV2,5. Actuellement, ce virus continue de se propager à l’échelle mondiale, peut-être par le mouvement de poissons vivants infectés6,7, tandis que le risque de transmission virale via le tilapia congelé ou son produit est limité8. La mortalité importante due à l’infection tiLV a le potentiel d’avoir un impact économique considérablement préjudiciable sur l’industrie du tilapia. Par exemple, l’impact économique du syndrome de mortalité estivale en Égypte associé à l’infection par tiLV a été estimé à 100 millions de dollarsEU 9. Par conséquent, il est important de mettre au point une méthode diagnostique rapide et appropriée pour faciliter le contrôle de cette maladie dans les exploitations piscicoles.

Jusqu’à présent, le diagnostic de TiLVD a été basé sur les essais moléculaires, l’isolement viral, et l’histopathologie. Différents protocoles PCR et amorces ont été développés pour le diagnostic TiLV10,11. Par exemple, une méthode quantitative PCR (RT-QPCR) basée sur le vert SYBR avec la sensibilité de détecter aussi peu que deux copies/L du virus a été développée et validée pour la détection TiLV10. D’autres méthodes PCR pour la détection TiLV comprennent TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, imbriqué RT-PCR12, et semi-niché RT-PCR13. Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de laboratoire sophistiqué et des périodes de temps relativement prolongées pour donner des résultats en raison de la complexité des réactions, ce qui les rend impropres à l’application sur le terrain.

L’essai d’amplification isothermale à médiation en boucle (LAMP) est une application rapide, simple et pratique pour le champ14,15. La technique utilise le principe d’une réaction de déplacement de brin, tandis que la réaction d’amplification fonctionne dans des conditions isothermales sans un cycleur thermique sophistiqué et coûteux14,15. Par conséquent, les produits LAMP amplifiés ou les produits RT-LAMP sont analysés dans des bandes en valeur d’échelle à l’aide d’électrophoresis gel agarose avec une tache fluorescente pour la visualisation sûre de l’ADN ou de l’ARN14 ou l’observation à l’œil nu pour la présence de turbidité ou d’un précipité blanc16,17,18. Pour ces raisons, cette technique a été utilisée pour la détection sur place de différents pathogènes du poisson17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Le but de cette étude était d’établir un essai rapide, sensible et précis de RT-LAMP pour la détection de TiLV. L’essai RT-LAMP offre un dépistage du TiLV dans des échantillons de poissons dans un délai de 30 min. La technique peut être appliquée pour le diagnostic et la surveillance de TiLVD.

Protocole

Cette expérience, qui portait sur l’utilisation de tissus animaux, a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Kasetsart, Bangkok, Thaïlande (numéro de protocole ACKU61-VET-009).

1. Collection de tissus

  1. Euthanasier les poissons tilapia à l’aide d’une surdose d’huile de clou de girofle (c.-à-d. plus de 3 ml/L). Le méthane tricaine peut être utilisé comme alternative à l’huile de clou de girofle.
  2. Utilisez des ciseaux et des forceps stériles pour ouvrir l’abdomen du tilapia post mortem et accisez environ 30 à 50 mg de tissu hépatique, ou à l’aide d’un verre de couverture de microscope, recueillir 100 l de mucus en grattant la couche de peau de poisson longitudinally (de l’antérieur au postérieur) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
  3. Passez immédiatement à l’étape d’extraction de l’ARN ou maintenez l’échantillon recueilli à 80 oC jusqu’à l’expérience. Comme l’ARN intact est plus sensible que l’ADN, utilisez des matériaux et des réactifs sans RNase pendant l’extraction de l’ARN.

2. Extraction d’ARN

  1. Pour extraire l’ARN du tissu hépatique, ajoutez 30 à 50 mg du tissu tilapia à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL contenant 600 à 1 000 lil de réagent d’extraction de phénoïx guanidinium-acide-phénol(tableau des matériaux), et pulvérisez l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit homogène à l’aide d’un homogénéisant de tissus à la main. Les échantillons de tissus nécessitent environ 10 % du réactif d’extraction de phénoïne-acide-acide. Pour les échantillons de mucus, n’utilisez que 300 lil du réactif d’extraction de guanidinium-acide-phénol (3:1).
    CAUTION : Le réactif d’extraction de guanidinium-acide-phénol est toxique ; par conséquent, la manipulation doit être entreprise avec soin. L’équipement de protection, comme les lunettes de sécurité, une robe de laboratoire et des gants de sécurité, doit être porté.
  2. Centrifuge l’échantillon homogénéisé à 10.000 x g pour 30 s à température ambiante, et transférer le supernatant dans un nouveau tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
  3. Ajouter un volume égal d’éthanol à 95 % au tube et bien mélanger.
  4. Transférer la solution dans une colonne de spin (Tableau des matériaux) placée dans un tube de collecte et une centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à température ambiante. Jetez le flux-through, et transférez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte.
  5. Ajouter 400 ll de réactif pré-lavage de l’ARN(tableau des matériaux)à la colonne et la centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à température ambiante avant de jeter le débit. Répétez cette étape une fois de plus.
    REMARQUE : Pour préparer l’ARN Pré-Wash, ajouter 10 ml d’éthanol de 95 % à 40 ml de concentré pré-lavage de l’ARN.
  6. Ajoutez 700 L de tampon de lavage d’ARN(tableau des matériaux) à la colonne et la centrifugeuse à 10 000 x g pendant 2 minutes à température ambiante. Transférer la colonne dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
    REMARQUE : Pour préparer le tampon de lavage d’ARN, ajouter 52 ml d’éthanol de 95 % à 12 ml de concentré tampon de lavage d’ARN.
  7. Elute l’échantillon d’ARN capturé dans la matrice de colonne de spin avec 100 L d’eau sans nucléase et centrifugeuse à 10.000 x g pour 30 s à température ambiante.
  8. Mesurer la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume et diluer l’ARN à une concentration désirée à l’aide d’eau sans nucléase.
    REMARQUE : La valeur d’absorption qualifiée de OD260/OD280 varie de 1,6 à 1,9, ce qui indique la pureté acceptable de l’ARN pour l’essai RT-LAMP.
  9. Passez immédiatement à l’étape suivante, ou gardez l’échantillon à 80 oC jusqu’à l’utilisation.

3. Conception d’apprêt

  1. Utilisez la version 4 d’Primer Explorer pour concevoir les amorces spécifiques pour le RT-LAMP. Rendez-vous sur le site Web, https://primerexplorer.jp/e/ et cliquez sur le bouton V4 PrimerExplorer.
  2. Sélectionnez le fichier contenant les séquences du segment 3 de TiLV en format FASTA, puis cliquez sur le bouton Primer Design.
    REMARQUE: Récupérer les séquences en format FASTA à partir de GenBank numéro d’adhésion KX631923, qui représente tilapia lac virus TV1 segment 31.
  3. Pour concevoir les amorces, entrez les paramètres de base suivants :
    - Une teneur en GC de 40% à 60%
    - Un amplicon de paires de base de 280 euros (bp)
    - Une température de fonte similaire (Tm) chez les amorces avec une différence maximale de 5 oC
    REMARQUE : Les amorces ne doivent pas se compléter les unes les autres
    1. Évitez les régions séquences sujettes à la formation de structures secondaires.
    2. Sélectionnez l’analyse dimer l’amorce avec un minimum de 3,5 euros pour une conception optimale pour le plus grand G, et sélectionnez les extrémités des amorces avec un maximum de 4 euros pour une conception optimale pour les plus petits.
  4. Cliquez sur le bouton Générer.
    REMARQUE : Une fois que le logiciel aura terminé le traitement des données d’entrée, les résultats de l’amorce seront affichés(figure 1).

4. Essai RT-LAMP

  1. Préparer un mélange de maître RT-LAMP contenant 2,5 L de tampon de réaction SD II de 1x, 3 L de MgSO4de 6 mM, 1,4 L de 1,4 mM dNTP ensemble, 4 L de 0,8 M de bétaïne, 1,3 L de mélange de calcéine de 0,052 mM, 1 l de 1,6 M d’amorce TiLV-F3, 1 ll de 1,6 M TiLV-B3 amorce, 1 L de l’apprêt TiLV-FIP de 0,2 M, 1 ll de l’amorce TiLV-FIP de 0,2 M, 1 l de polymérase d’ADN de 0,3 U Bst, 1 l de 0,1 U AMV reverse transcriptase, et 3,8 l d’eau sans nucléase par réaction.
    REMARQUE : Préparer un mélange de maître excédentaire comprenant au moins 10 % du volume total de réaction.
  2. Dispenser 22 L du mélange principal RT-LAMP dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5.
  3. Ajouter 3 L de l’ARN extrait au tube de réaction et mélanger l’échantillon par vortexing. Pour le contrôle négatif, utilisez de l’eau distillée au lieu de matériaux d’ARN.
  4. Incuber la réaction à 65 oC pendant 60 min, suivie de 80 oC pendant 10 minutes pour mettre fin à la réaction.
  5. Après l’incubation, observez visuellement les changements colorimétriques à l’œil nu. Un résultat positif apparaîtra comme une couleur vert fluorescent.

5. Électrophoresis gel Agarose

  1. Préparer un gel agarose de 1,5 % en suspendant 0,6 g de poudre d’agarose dans 40 ml de tampon TAE de 1x. Faire fondre le mélange en le chauffant au micro-ondes pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute et que le tourbillonnement pour mélanger.
  2. Laisser refroidir l’agarose jusqu’à ce que la température atteigne 65 oC. Verser 40 ml de la solution agarose sur un plateau de gel et ajouter un peigne au moule de gel.
  3. Laisser le gel d’agarose fixer à température ambiante pendant 20-30 min jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié. Ensuite, retirer le peigne et placer le gel dans le réservoir de gel.
  4. Ajouter un tampon en cours d’exécution pour couvrir la surface du gel dans le réservoir de gel.
  5. Ajouter 10 L de l’échantillon RT-LAMP et 2 L de tampon de chargement de gel 6x à chaque puits. Ajouter 5 L d’une échelle d’ADN de 1 kb à la voie de référence.
  6. Branchez le couvercle attaché à la cathode et à l’anode reliée à une alimentation. Allumez l’alimentation, réglez-la à une constante de 100 V et courez pendant 40 min.
  7. Après avoir terminé la séparation du gel, retirer le gel du plateau de gel. Ensuite, tachez le gel égoutté à l’aide de bromure d’éthidium (EtBr) à une concentration de 10 mg/mL pendant 7 min et restain dans l’eau distillée pendant 5 min.
    CAUTION: EtBr est toxique et considéré comme cancérogène; par conséquent, soyez prudent lors de l’utilisation de cet agent.
  8. Exposez le gel à la lumière UV à l’aide d’un système de documentation de gel où les bandes apparaissent, et prenez une photo du gel.

6. synthèse complémentaire de l’ADN (ADNC)

  1. Préparer un mélange principal de synthèse de l’ANC contenant 2 L de tampon RT de 5x, 0,5 l de mélange d’amorce, 0,5 l d’enzyme RT et 2 L d’eau sans nucléase par réaction.
    REMARQUE : Préparer le mélange de maître excédentaire comprenant 1x la réaction due à la perte potentielle pendant le tuyauterie.
  2. Dispenser 5 L du mélange principal dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
  3. Ajouter 100 ng de l’ARN extrait dilué (obtenu de l’étape 2.8) au tube de réaction, mélanger et tourner vers le bas pour déplacer tout le mélange au fond du récipient.
  4. Incuber les réactions à 42 oC pendant 60 min, suivie de 98 oC pendant 5 minutes dans une machine PCR. Conserver l’ADN à 20 oC jusqu’à l’utilisation.

7. RT-qPCR

  1. Préparer un mélange de maître TiLV qPCR contenant 0,3 L d’amorce inversée de 10 M, 0,3 L d’apprêt avant de 10 M, 5 L de polymérase à ADN vert SYBR de 2x et 0,4 L d’eau sans nucléa par réaction. Utilisez les amorces et les contrôles suivants :
    Apprêt avant (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
    Apprêt inversé (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3'
  2. Dispenser 6 L du mélange principal TiLV qPCR dans chaque puits de la bande QPCR compatible avec le cycleur thermique en temps réel utilisé.
  3. Ajoutez 4 L du modèle de l’ADNC, contrôle négatif (eau sans nucléase), contrôle positif (10 pg/L) et pTiLV (plasmide)10 ou plasmide dilué en série au puits, et mélangez chaque échantillon en clignotant. Effectuez chaque échantillon en triplicate.
  4. Placez les réactions qPCR dans le cycle thermique en temps réel programmé. Définissez le programme qPCR pour effectuer l’incubation à 95 oC pendant 3 minutes, suivi de 40 cycles de 95 oC pour 10 s et 60 oC pour 30 s avant l’étape de la courbe de fusion dans laquelle la température doit passer de 65 à 95 oC à 0,5 oC/5 screments.
  5. Effectuez l’analyse des données en évaluant les courbes d’amplification et de fusion, puis calculez le nombre de copies TiLV à l’aide de la courbe standard obtenue à partir des données à l’aide des plasmides dilués en série.

Résultats

Dans cette étude, un essai DE RT-LAMP a été développé pour détecter l’infection de TiLV dans le tilapia. Les échantillons testés ont été prélevés dans 14 fermes situées dans différentes parties de la Thaïlande entre 2015 et 2016. Les poissons infectés et non infectés ont été principalement regroupés en fonction des diagnostics physiques et des apparences de TiLVD symptomatique. L’infection de TiLV a été plus tard confirmée utilisant RT-PCR après le processus de collecte. L’électrophoresis d...

Discussion

L’industrie aquacole est continuellement menacée par des infections virales qui causent des pertes économiques importantes9,23,28. Par exemple, le TiLV émergent représente une menace majeure pour les pays producteurs de tilapia dans de nombreuses parties du monde1,6,9. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de thérapeutique spé...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Le projet est financé financièrement par le numéro de subvention du Fonds de recherche thaïlandais (TRF) RDG6050078 et le Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under the Higher Education Research Promotion et National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. La recherche est appuyée en partie par la bourse d’études supérieures de l’École supérieure de l’Université Kasetsart. Les auteurs tiens à remercier le Dr Kwanrawee Sirikanchana pour le récit parlant de la vidéo et Piyawatchara Sikarin pour l’édition de la vidéo.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue collection:
Clove oilBetter PharmaN/A
Tricaine methanesulfonateSigma-AldrichE10521An alternative option to clove oil
RNA extraction:
Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent)ThermoFisher Scientific Corp.15596026
Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent)GeneaidGZR100
Direct-zol RNA Kit:Zymo ResearchR2071
- Direct-zol RNA PreWash
- RNA Wash Buffer
- DNase/RNase-free water
- Zymo-spin IIICG columns
- Collection Tubes
RT-LAMP:
1x SD II reaction bufferBiotechrabbitBR1101301
Magnesium sulfate (MgSO4)Sigma-Aldrich7487-88-9
dNTP setBiolineBIO-39053
BetaineSigma-AldrichB2629
Calcein mixtureMerck1461-15-0
Bst DNA polymeraseBiotechrabbitBR1101301
AMV reverse transcriptasePromegaM510A
Nuclease-free waterInvitrogen10320995
Elite dry bath incubator, single unitMajor ScienceEL-01-220
Gel electrophoresis:
AgaroseVivantis TechnologiesPC0701-500G
Tris-borate-EDTA (TBE) bufferSigma-AldrichSRE0062
Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer:
- TrisVivantis TechnologiesPR0612-1KG
- Acetic acid (glacial), EMSUREMerck Millipore1000632500
- Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), VetecSigma-AldrichV800170-500G
NeogreenNeoScience Co., Ltd.GR107
DNA gel loading dye (6X)ThermoFisher Scientific Corp.R0611
DNA ladder and markersVivantis TechnologiesPC701-100G
Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)Bio-Rad1704487
PowerPac HC power supplyBio-Rad1645052
Gel Doc EZ SystemBio-Rad1708270
UV sample trayBio-Rad1708271
NαBI imagerNeogene Science
cDNA synthesis:
ReverTra Ace qPCR RT KitToyoboFSQ-101
Viva cDNA Synthesis KitVivantis TechnologiescDSK01An alternative option for cDNA synthesis
NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer)ThermoFisher Scientific Corp.ND-2000
T100 Thermal CyclerBio-Rad1861096
RT-qPCR:
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad1725120
Nuclease-free water, sterile waterMultiCell809-115-CL
8-tube PCR strips, whiteBio-RadTLS0851
Flat PCR tube 8-cap strips, opticalBio-RadTCS0803
CFX96 Touch Thermal CyclerBio-Rad1855196
General equipment and materials:
Mayo scissorsN/A
ForcepsN/A
Vortex Genie 2 (vortex mixer)Scientific Industries
Microcentrifuge LM-60LioFugeCM610
Corning LSE mini microcentrifugeCorning6765
PipettesRaininPipete-Lite XLS
QSP filtered pipette tipsQuality Scientific PlasticsTF series
Corning Isotip filtered tipsMerckCLS series
Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NESTWuxi NEST Biotechnology615601

Références

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