התקנה בקנה מידה קטן לבדיקת רעילות אצות של ננו חומרים וחומרים קשים אחרים

Summary

אנו מדגימים בדיקות רעילות אצות לחומרים קשים (למשל, חומרים צבעוניים או ננו חומרים) באמצעות התקנה מוארת אנכית עם LED.

Abstract

נתוני Ecotoxicity הם דרישה לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH). בדיקת רעילות אצות משמשת לעתים קרובות בהערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. על מנת להשיג אמינות גבוהה ושחזור הפיתוח של קווים מנחים מתוקנים הוא חיוני. לבדיקת רעילות אצות, הקווים המנחים דורשים תנאים יציבים ואחידים של פרמטרים כגון pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. ננו-חומרים וחומרים קשים אחרים לכאורה יכולים להפריע לאור ולגרום לשינוי גדול בתוצאות שהושגו הפוגעות בקבלה הרגולטורית שלהם. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו LEVITATT (LED אנכי תאורה טבלה עבור בדיקות רעילות אצות). ההתקנה משתמשת בתאורת LED מלמטה ומאפשרת התפלגות אור הומוגני ובקרה בטמפרטורה, תוך מזעור הצללה תוך-מדגם. ההתקנה ממטבת את נפח הדגימה לכמת ביומסה ומבטיחה בו זמנית זרימה מספקת של CO₂ כדי לתמוך בצמיחה אקספוננציאלית של אצות. בנוסף, ניתן להתאים את החומר של מיכלי הבדיקה כדי למזער את ההסחתה וההתבוללות. בעת בדיקת חומרים צבעוניים או מתלי חלקיקים, השימוש בנורות LED מאפשר גם להגדיל את עוצמת האור ללא ייצור חום נוסף. העיצוב הקומפקטי ודרישות הציוד המינימליות מגדילים את האפשרויות ליישום ה-LEVITATT במגוון רחב של מעבדות. בעוד תואם עם הנחיות ISO ו-OECD מתוקננת לבדיקת רעילות אצות, LEVITATT גם הראה שונות בין-מדגם נמוך יותר עבור שני חומרים הפניה (3,5-Dicholorophenol ו K₂Cr₂O_{7) ושלושה}ננו חומרים (ZnO, CeO_2,ו BaSO₄₎בהשוואה למבחנות Erlenmeyer וצלחת microtiter.

Introduction

בדיקת הרעילות של אצות היא אחת משלוש בדיקות חובה בלבד המשמשות ליצירת נתוני רעילות אקולוגית הנדרשים לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH¹ ו-TSCA (ארה"ב).). לשם כך פותחו הנחיות למבחן אצות מתוקנות על ידי ארגונים בינלאומיים (למשל, ISO ו-OECD). תקני בדיקה וקווים מנחים אלה רושמים תנאי בדיקה אידיאליים במונחים של pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. עם זאת, שמירה על תנאי בדיקה יציבים במהלך בדיקות אצות היא למעשה קשה והתוצאות סובלות מבעיות עם רבייה ואמינות עבור מגוון של חומרים כימיים וננו חומרים (המכונה לעתים קרובות "חומרים קשים")^2. רוב התקנות הקיימות לבדיקת רעילות אצות פועלות בכמויות גדולות יחסית (100-250 מ"ל) הממוקמות על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור. הגדרה כזו מגבילה את מספר ריכוזי הבדיקה ומשכפלת כמויות ברות השגה וגביות של תרבות אצות וחומר בדיקה. בנוסף, הגדרות אלה לעתים נדירות יש שדה אור אחיד תנאי תאורה אמינים קשה יותר להשיג במבחנות גדולות, בין השאר כמו עוצמת האור פוחתת אקספוננציאלית ככל שהאור נע ובחלקו בשל גיאומטריית הבקבוקון. הגדרות חלופיות כוללות מיקרוטיטר^{פלסטיק 3 צלחות המכילות נפחי} מדגם קטנים שלא מאפשרים נפחי דגימה נאותים כדי למדוד pH, מדידות ביומסה נוספות, חילוץ פיגמנטים או ניתוחים אחרים הדורשים דגימה הרסנית. אחד האתגרים המסוימים באמצעות הגדרות קיימות לבדיקת רעילות אצות של ננו חומרים וחומרים יוצרים השעיות צבעוניות הוא הפרעה או חסימה של האור הזמין לתאי אצות, המכונה לעתים קרובות^{"הצללה" 4,,5}. הצללה עלולה להתרחש בתוך בקבוקונים על ידי חומר הבדיקה ו/או אינטראקציות בין חומר הבדיקה לבין תאי הצלחות, או הצללה יכולה להתרחש בין בקבוקונים, בשל מיקומם ביחס זה לזה ומקור האור.

השיטה מבוססת על התקנה של בדיקת רעילות אצות בקנה מידה קטן שהציגה ארנסברג ואח'^6, המאפשרת בדיקה בהתאם לתקנים כגון OECD 2017 ו-ISO 8692⁷⁸. השיטה ממוטבת עוד יותר כדי לטפל במגבלות שצוינו לעיל על ידי: 1) ניצול טכנולוגיית תאורת LED כדי להבטיח תנאי תאורה אחידים עם ייצור חום מינימלי, 2) מתן נפח מדגם הולם לניתוח כימי/ביולוגי תוך שמירה על רמת pH קבועה, CO₂ ו-3) המאפשר שימוש בחומר מיכל בדיקה רב-תכליתי לבדיקת חומרים או חומרים נדיפים בעלי פוטנציאל פתרון גבוה.

Protocol

1. תיאור ההתקנה של LEVITATT

1. השתמש בקבוקונים זכוכית מבריק 20 מ"ל(איור 1,הכנס 1) המאפשר חדירה קלה. לחלופין, ניתן להשתמש בבקבוקונים מפלסטיק הניתנים להעברה קלה. מכמת את עוצמת האור באמצעות מד פוטומטר.
2. השתמש לפחות 4 מ"ל מתלה מבחן בתחילת הבדיקה כדי לאפשר כימות של ביומסה ואפיון / כימות של ננו חומרים במהלך ואחרי דגירה(איור 1,להוסיף 2).
3. להתאים את בקבוקונים מבריק 20 מ"ל עםכובע (איור 1,להוסיף 3) שבו חור קטן נקדח (כ 1 מ"מ קוטר) כדי לאפשר חילופי CO₂ עם האווירה. החלפה זו חיונית כדי להבטיח רמות pH ו-CO_{2 יציבות במהלך} הבדיקה.
4. עבור חומרים נדיפים, השתמש בכובע טפלון מצופה אוויר כדי לאפשר CO₂ העשרה של headspace באמצעות מזרק^{9 או} מבחנות סגורות לחלוטין ללא שלב גז שבו CO 2 נשמר_בפתרון על ידי מערכת מאגר נתרן מועשר (NaHCO₃)^{מאגר 10}.
5. הדקו את הבקבוקונים עם מהדקים המותקן על המעטפת החיצונית(איור 1,הכנס 4).
6. השתמש במקור אור LED הממוקם מתחת בקבוקוניהבדיקה (איור 1, הכנס 5) מתן תאורת פלורסנט אחידה של "cool-white" או "אור יום" סוג ועוצמת אור בטווח 60-120 μE∙m^-2∙^{-1 נמדד בטווח אורך} הגל פוטוסינתטי יעיל של 400 טנ"מ עד 700 טנ"מ. ההתקנה משתמשת בעוצמת אור מתכווננת בטווח של 5-160 μE∙m^-2∙^-1 על-ידי התאמת עמעם אור למקור. הדבר מאפשר בדיקה בעוצמות אור גבוהות ונשומות יותר.
7. הר את ההתקנה על שייקר מסלולי כדי להרגיז דגימות לאורך כל הבדיקה. זה שומר את התאים בהשעיה חופשית ומקל על_{CO 2 העברה המונית} מאווירלמים (איור 1,הכנס 6).
8. מניחים את ההתקנה בחדר מבוקר טמפרטורה או ארון תרמוסטי כדי לשמור על טמפרטורות יציבות לאורך כל הבדיקות(איור 1, הכנס 7).

איור 1: תמונה של טבלת תאורה אנכית LED עבור בדיקות רעילות אצות (LEVITATT). 1) 20 מ"ל זכוכית scintillation בקבוקונים עבור דגירה, 2) 4 מדגם מ"ל לניתוח, 3) מכסה עם חור קדוח עבור חילופי CO_2, 4) מעטפת עבור תנאי אור מוגדרים, 5) מקור אור LED הממוקם במרכז המעטפת, 6) שייקר מסלולית לתסיסה במהלך הניסוי, ו 7) ארון תרמוסטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

2. הכנת אצות בינוניות

1. מדד ISO 8692 אצות החברה מורכב מארבעה פתרונות מניות שונים. שקלו את הכמות המתאימה של מלחים ודיללו במים אולטרה-תכליתיים לפי שולחן 1.

פתרונות מלאי	מזין	ריכוז בתמיסת מלאי	ריכוז בתמיסת בדיקה
1: מקרונו-ונים	NH4Cl	1.5 גר'/ל	15 מ"ג/L (N: 3.9 מ"ג/ל')
	MgCl2∙6H2O	1.2 גר'/ל	12 מ"ג/L (מ"ג: 2.9 מ"ג/L)
	CaCl2∙2H2O	1.8 גר'/ל	18 מ"ג/L (Ca: 4.9 מ"ג/L)
	MgSO4∙7H2O	1.5 גר'/ל	15 מ"ג/ל') (S: 1.95 מ"ג/ל')
	KH2PO4	0.16 ג'/ל'	1.6 מ"ג/ל' (P: 0,36 מ"ג/L)
2: פה-אדטה	פ"ק 3∙6H2O	64 מ"ג/L	64 μg / L (פה: 13 μg / L)
	Na2EDTA∙2H2O	100 מ"ג/ל'	100 μg/ L
3: רכיבי מעקב	H3BO3a	185 מ"ג/L	185 μg/L (ב: 32 μg/L)
	MnCl2∙4H2O	415 מ"ג/ל'	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ת.ז.2	3 מ"ג/L	3 μg/L (Zn: 1.4 μg/L)
	CoCl2∙6H2O	1.5 מ"ג/L	1.5 μg/L (Co: 0.37 μg/L)
	CuCl2∙2H2O	0.01 מ"ג/L	0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L)
	Na2MoO4∙2H2O	7 מ"ג/ל'	7 μg /L (מו: 2.8 μg / L)
4: NaHCO3	3(000)3	50 גר'/ל	50 מ"ג/ל' (C: 7.14 מ"ג/L)

טבלה 1: ריכוזים של חומרים מזינים בפתרונות מלאי עבור אצות צמיחה בינונית

הערה:_{ניתן לפרק}את H 3 BO₃ על-ידי הוספת 0.1 M NaOH. EDTA יש להסיר בעת בדיקת מתכות, כדי למנוע עור עם יונים מתכת. לחטא את פתרונות המניות על ידי סינון קרום (אומר נקבוביות קוטר 0.2 μm) או על ידי autoclaving (120 ° C, 15 דקות). אין לעשות פתרונות מלאי autoclave 2 ו 4, אבל לחטא אותם על ידי סינון קרום. אחסן את הפתרונות בחושך ב- 4 °C.

2. כדי לייצר 1 L של אצות צמיחה בינונית, להעביר 500 מ"ל מים אולטרה-אפורים מחטאים לתוך בקבוקון נפחי נפח 1 L ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון מניות 1: Macronutrients, 1 מ"ל של פתרון מניות 2: Fe-EDTA, 1 מ"ל של פתרון מניות 3: רכיבי עקבות, ו 1 מ"ל של פתרון מניות 4: NaHCO₃.
3. מלא עד 1 ל' במים אולטרה-תכליתיים מחטאים, תעצור את הבקבוקון ונענע ביסודיות כדי להפוך את מדיום גידול האצות להומוגני.
4. לערבב את הפתרון לפני השימוש על ידי השארתו לילה במגע עם האוויר או על ידי מבעבע עם סטרילי, אוויר מסונן במשך 30 דקות. לאחר שיווי המשקל, להתאים את ה-pH, במידת הצורך, ל- pH 8.1 ± 0.2, עם 1 M HCl או 1 M NaOH.

3. הגדרת מבחן אצות

הערה: דיאגרמת זרימה של הליך בדיקת אצות מוצגת באות 2.

איור 2: דיאגרמת זרימה של כיוונון בדיקת אצות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

1. הכינו פתרון מניות של תרכובת הבדיקה בריכוז הבדיקה הגבוה ביותר הרצוי במדיום גידול אצות המוכן על פי שלב 2. להכנת פתרונות/השעיות למניות, עקבו אחר ה-OECD 201 (לתרכובות מסיסות) או OECD 318 (לננו-חומרים).
2. למדוד את ה-pH בפתרון המניות. אם הוא סוטה יותר מיחידה אחת ממדיום צמיחת אצות, להתאים את ה-pH ל 8 עם או 1 M HCl או 1 M NaOH.
3. חשב את אמצעי האחסון inoculum הדרוש כדי להגיע לריכוז תא סופי של 1 x 10^{4 תאים} /מ"ל בפתרון בדיקה 25 מ"ל.
   הערה: האינוקולום צריך לבוא מתרבות של תת-קפיטטה הגדלה באופן אקספוננציאלי של Raphidocelis שגדלה באופן אקספוננציאלי באמצעות ההתקנה של LEVITATT.
4. לחשב את כמות פתרון המניות כדי להוסיף לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל כדי להשיג את ריכוזי הבדיקה הרצויים. הגורם בין כל ריכוז לא יעלה על 3.2.
5. סמן בקבוקון נפח אחד 25 מ"ל עבור כל ריכוז שנבחר ותוביל נוסף של 25 מ"ל מנוקב נפח מסומן בקרה.
6. הוסף את כמות תמיסת המניות של תרכובת הבדיקה הדרושה כדי להגיע לריכוזים הרצויים לבקבוקון נפח 25 מ"ל. אל תוסיף פתרון מניות לפקד.
7. הוסף את המדיום לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל כדי להגיע לנפח של כ-20 מ"ל.
8. הוסף את נפח inoculum מחושב בשלב 3.3 לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל. הוסף את המדיום לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל לנפח כולל סופי של 25 מ"ל.
9. תעצור את המבחנות ומערבבים ביסודיות על ידי הפיכת הבקבוקונים פעמיים אנכית.
10. להעביר 0.4 מ"ל מכל בקבוקון לתוך בקבוקונים כובע בורג בודד ולהוסיף 1.6 מ"ל של אצטון (רווי MgCO_{3): מדגם}אחד עבור כל ריכוז בדיקה ואת הבקרה. סגור את המכסים בחוזקה ואחסן בחושך בטמפרטורת החדר עד מדידות פלואורסצסצנציה (סעיף 4).
11. Pipet 4 מ"ל של כל פתרון בדיקה לתוך בקבוקונים מבריקים 20 מ"ל (3 שכפולים לכל ריכוז ו 5 שכפולים עבור הבקרה). לעזאזל עם המכסים על בקבוקונים מבריקים. זכור כי המכסים חייב להיות חור קדוח (כ 1 מ"מ קוטר) כדי לאפשר חילופי CO_2.
12. לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות, צינור 0.4 מ"ל מכל בקבוקון לתוך בקבוקונים של מכסה בורג ולהוסיף 1.6 מ"ל של אצטון (רווי ב-MgCO_3). סגור את המכסים בחוזקה ואחסן בחושך בטמפרטורת החדר עד מדידות פלואורסצסצנציה (סעיף 4).
13. לאחר הדגימה האחרונה נלקח ב 72 שעות, בעדינות מאגר שלושת משכפלים עבור ריכוז נתון במבחנה אחת למדוד את ה-pH. חזור על כל הריכוזים והפקד. ה-pH לא צריך לסטות יותר מ- 1.5 יחידות מה- pH הראשוני עבור כל הדגימות שנמדדו.
14. שחררו את הנוזלים הנותרים לתוך מיכל פסולת תוך כך שהם מחוקים ותקנות מוסדיים.

4. ניתוח דגימות בדיקת אצות

1. השתמש בספקטרופוטומטר פלואורסצנס כדי למדוד את ביומסה אצות (כאן מבוטא כמו כלורופיל A). פליטת השיא של כלורופיל A היא 420 00 00 000 00:00-10:00-00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00
2. מדוד את הפלואורסנסנס של כל מדגם בודד שלוש פעמים וחשב את הערך הממוצע עבור כל מדגם.
3. השתמש במשוואה 1 כדי לחשב את קצב הצמיחה. ניתן להשתמש בפלואורסנצנס (יחידות יחסיות) הנמדדות ישירות כפרמטר ביומסה במשוואה 1.
   משוואה 1: μ = (ב N_t – ב N₀) / t
   כאשר μ הוא קצב הצמיחה (d^-1), N₀ הוא הביומסה הראשונית, N_t הוא הביומסה בזמן t, ו t הוא אורך תקופת הבדיקה (ד). הערה, N₀ ו- N_t צריכים לבוא לידי ביטוי באותה יחידה.
4. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי להתאים עקומת רגרסיה לא ליניארית (לדוגמה, פונקציית לוג-לוגיסטי או Weibull) לנתוני קצב הצמיחה כדי להשיג ערכי ריכוז אפקטיביים ב- 10%, 20% ו- 50% עיכוב. במידע המשלים ניתנת דוגמה של קוד להשתלבות בתוכנה הסטטיסטית R באמצעות חבילת DRC^11.

תוצאות

בדיקה ראשונית עם חומר התייחסות מתבצעת כדי לקבוע את הרגישות של זן אצות. חומרים עזר המשמשים באופן קבוע עבור R. תת-קפיטטה הם אשלגן dichromate ו 3,5-Dichlorphenol^7,,8. איור 3 וטבלה 2 מציגים תוצאה מייצגת של בדיקת אצות, כולל התאמת עקומה ויציאות סטטיסט...

Discussion

Phytoplankton ממירה אנרגיה סולארית ופחמן דו חמצני חומר אורגני ובכך מחזיק תפקיד מרכזי במערכת האקולוגית הימית. מסיבה זו, בדיקות עיכוב קצב הצמיחה אצות כלולים כאחד משלוש בדיקות רעילות ימית חובה הנדרשים להערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. היכולת לבצע בדיקת רעילות אצות אמינה ותורגלית היא המפתח בהקשר ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086