JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы демонстрируем тестирование токсичности водорослей на сложные вещества (например, цветные вещества или наноматериалы) с помощью установки, освещенной вертикально со светодиодом.

Аннотация

Данные об экотоксичности являются обязательным требованием для предварительной и постпроданной регистрации химических веществ европейскими и международными правилами (например, REACH). Тест на токсичность водорослей часто используется при оценке регулятивного риска химических веществ. Для достижения высокой надежности и воспроизводимости жизненно важно разработать стандартизированные руководящие принципы. Для тестирования токсичности водорослей руководящие принципы требуют стабильных и равномерных условий таких параметров, как рН, температура, уровень двуокиси углерода и интенсивность света. Наноматериалы и другие так называемые сложные вещества могут мешать свету, вызывая большие различия в полученных результатах, препятствующих их регулятивной принятию. Для решения этих проблем мы разработали LEVITATT (LED Vertical Illumination Table для испытаний токсичности водорослей). Установка использует светодиодное освещение снизу, что позволяет однородное распределение света и контроль температуры, а также минимизации внутри образец затенения. Установка оптимизирует объем выборки для количественной оценки биомассы и в то же время обеспечивает достаточный приток CO2 для поддержки экспоненциального роста водорослей. Кроме того, материалы тестовых контейнеров могут быть адаптированы для минимизации adsorption и volatilization. При тестировании цветных веществ или суспензий частиц использование светодиодных фонарей также позволяет увеличить интенсивность света без дополнительной тепловой генерации. Компактный дизайн и минимальные требования к оборудованию увеличивают возможности для внедрения LEVITATT в широком диапазоне лабораторий. В соответствии со стандартизированными руководящими принципами ИСО и ОЭСР по тестированию токсичности водорослей, LEVITATT также показал более низкую межпробную изменчивость для двух эталонных веществ (3,5-dicholorophenol и K2Cr2O7)и трех наноматериалов (NonO, CeO2, и BaSO4) по сравнению с Флябами и микротлорными пластинами Erlenmeyer.

Введение

Тест на токсичность водорослей является одним из трех обязательных тестов, используемых для получения данных об экотоксичности, необходимых для предварительной и постпродающей регистрации химических веществ европейскими и международными правилами(например, REACH 1 и TSCA (США)). С этой целью международные организации (например, ИСО и ОЭСР) разработали стандартизированные руководящие принципы тестирования на водоросли. Эти стандарты и руководящие принципы тестирования предписывают идеальные условия тестирования с точки зрения рН, температуры, уровня углекислого газа и интенсивности света. Тем не менее, поддержание стабильных условий испытаний во время испытаний водорослей на практике трудно и результаты страдают от проблем с воспроизводимостью и надежностью для целого ряда химических веществ и наноматериалов (часто называют "трудные вещества")2. Большинство существующих установок по тестированию токсичности водорослей работают с относительно большими объемами (100-250 мл), расположенными на орбитальном шейкере внутри инкубатора. Такая установка ограничивает количество тестовых концентраций и воспроизводит достижимые и большие объемы водорослей культуры и испытательного материала. Кроме того, эти установки редко имеют равномерное световое поле и надежные условия освещения, кроме того, трудно получить в больших колбы, отчасти как интенсивность света уменьшается экспоненциально дальше свет путешествует и отчасти из-за геометрии колбы. Альтернативные установки включают пластиковые микротитр3 пластины, содержащие небольшие объемы выборки, которые не позволяют адекватные объемы выборки для измерения рН, дополнительные измерения биомассы, извлечения пигмента или других анализов, требующих разрушительной выборки. Одной из конкретных проблем, использующих существующие установки для тестирования токсичности водорослей наноматериалов и веществ, образующих цветные суспензии является вмешательство или блокирование света, доступного для водорослей клеток, часто называют "затенение"4,5. Затенение может происходить во флаконах испытательным материалом и/или взаимодействиями между испытательным материалом и клетками водорослей, или затенение может происходить между флаконами, из-за их позиционирования относительно друг друга и источника света.

Метод основан на мелкомасштабной установке теста токсичности водорослей, введенной Arensberg et al.6, которая позволяет проводить тестирование в соответствии с такими стандартами, как OECD 2017и ISO 86928. Метод дополнительно оптимизирован для устранения ограничений, о которых говорилось выше: 1) с использованием технологии светодиодного освещения для обеспечения равномерных условий освещения с минимальной теплосысловой, 2) обеспечивая достаточный объем выборки для химического/биологического анализа при сохранении постоянногорН, уровня CO 2 и 3), позволяющего использовать универсальный испытательный контейнерный материал для тестирования летучих веществ или веществ с высоким потенциалом сорбиона.

протокол

1. Описание установки LEVITATT

  1. Используйте 20 мл сцинтилляционных стеклянных флаконов(рисунок 1, вставьте 1), что позволяет проникновение света. Кроме того, можно использовать легкие пластиковые флаконы. Количественная оценка интенсивности света с помощью фотометра.
  2. Используйте по крайней мере 4 мл тестовой подвески в начале теста, чтобы обеспечить количественную оценку биомассы и для характеристики / количественной оценки наноматериалов во время и после инкубации(рисунок 1, вставьте 2).
  3. Fit 20 мл сцинтилляционных флаконов с крышкой(рисунок 1, вставьте 3), где небольшое отверстие пробурено (примерно 1 мм в диаметре), чтобы позволить CO2 обмена с атмосферой. Этот обмен имеет решающее значение для обеспечения стабильного уровня рН и CO2 во время тестирования.
  4. Для летучих веществ, используйте герметичной тефлоновой крышкой, чтобы позволить CO2 обогащения головного пространства с помощьюшприца 9 или полностью закрыты фляг без газовой фазы, в которой CO2 поддерживается в растворе обогащенного бикарбоната натрия (NaHCO3)буферная система 10.
  5. Закрепите флаконы зажимами, установленными на внешней оболочке(рисунок 1, вставка 4).
  6. Используйте светодиодный источник света, расположенный нижетестовых флаконов (рисунок 1, вставьте 5), обеспечивающий равномерное флуоресцентное освещение типа «круто-белый» или «дневной свет» и интенсивность света в диапазоне от 60 до 120МКМ -2-1, измеренный в фотосинтетически эффективном диапазоне длин волн от 400 нм до 700 нм. Установка использует регулируемую интенсивность света в диапазоне 5-160МКМ -2-1, при установке света тусклым к источнику. Это позволяет проводить тестирование при все более высокой и низкой интенсивности света.
  7. Намонтировать установку на орбитальном шейкере, чтобы агитировать образцы в течение всего срока испытания. Это держит клетки в свободной подвеске и облегчаетпередачу массы CO 2 из воздуха в воду(рисунок 1, вставьте 6).
  8. Поместите установку в комнату с температурным контролем или термостатический шкаф для поддержания стабильных температур на протяжении всеготестирования (рисунок 1, вставьте 7).

figure-protocol-2615
Рисунок 1: Изображение светодиодной вертикальной таблицы освещения для испытаний токсичности водорослей (LEVITATT). 1) 20 мл стеклянных сцинтилляционных флаконов для инкубации, 2) 4 мл образца для анализа, 3) крышка с пробуренные отверстия для обмена CO2, 4) корпус для определенных условий освещения, 5) светодиодный источник света, расположенный в центре корпуса, 6) орбитальный шейкер для агитации во время эксперимента, и 7) термостатический шкаф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Подготовка среды роста водорослей

  1. Среда роста водорослей ISO 8692 состоит из четырех различных фондовых решений. Взвесить соответствующее количество солей и разбавить в ультрапурной воде в соответствии с таблицей 1.
Фондовые решенияПитательных веществКонцентрация в фондовом раствореКонцентрация в тестовом решении
1: МакронутриентыNH4Cl1,5 г/л15 мг/л (N: 3,9 мг/л)
MgCl2No6H2O1,2 г/л12 мг/л (Мг: 2,9 мг/л)
CaCl2No2H2O1,8 г/л18 мг/л (Ca: 4,9 мг/л)
МгСО4No7Ч2O1,5 г/л15 мг/л (S: 1,95 мг/л)
KH2PO4 0,16 г/л1,6 мг/л (P: 0,36 мг/л)
2: Фе-ЭДТАFeCl3No6H2O64 мг/л64 мкг/л (Fe: 13 мкг/л)
Na2ЭДТА-2Ч2O100 мг/л100 мкг/л
3: Элементы трассировкиH3BO3a 185 мг/л185 мкг/л (B: 32 мкг/л)
MnCl2No4H2O415 мг/л415 мкг/л (Mn: 115 мкг/л)
ЗннКл2 3 мг/л3 мкг/л (Ен: 1,4 мкг/л)
CoCl2No6H2O1,5 мг/л1,5 мкг/л (Ко: 0,37 мкг/л)
CuCl2No2H2O0,01 мг/л0,01 мкг/л (Ку: 3,7 нг/л)
Na2Моо 4No2Ч2O7 мг/л7 мкг/л (Мо: 2,8 мкг/л)
4: NaHCO3НаХКО3 50 г/л50 мг/л (C: 7,14 мг/л)

Таблица 1: Концентрация питательных веществ в фондовых растворах для среды роста водорослей

ПРИМЕЧАНИЕ: H3BO3 может быть распущен путем добавления 0.1 M NaOH. EDTA следует удалить при тестировании металлов, чтобы избежать у сложности с ионами металла. Стерилизовать фондовые растворы путем мембранной фильтрации (средний диаметр поры 0,2 мкм) или путем автоклавирования (120 градусов по Цельсию, 15 мин). Не автоклав фондовых растворов 2 и 4, но стерилизовать их путем мембранной фильтрации. Храните растворы в темноте при 4 градусах Цельсия.

  1. Чтобы произвести 1 л среды роста водорослей, перенесите 500 мл стерилизованной ультрапурной воды в стерилизованную объемную колбу объемом 1 л и добавьте 10 мл раствора бульона 1: Macronutrients, 1 мл биржевого раствора 2: Fe-EDTA, 1 мл запасного раствора 3: элементы trace и 1 мл запасного раствора 4: NaHCO3.
  2. Заполните до 1 л стерилизованной ультрачистой водой, остановите колбу и тщательно встряхните, чтобы гомогенизировать среду роста водорослей.
  3. Equilibrate раствор перед использованием, оставив его на ночь в контакте с воздухом или восходящей с стерильным, фильтрованным воздухом в течение 30 минут. После эквилибрации отрегулируйте рН, при необходимости, до рН 8,1 ± 0,2, либо с 1 M HCl или 1 M NaOH.

3. Настройка водорослей тест

ПРИМЕЧАНИЕ: Диаграмма потока процедуры испытания водорослей показана на рисунке 2.

figure-protocol-7348
Рисунок 2: Диаграмма потока установки водорослей испытания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

  1. Подготовье запасное решение испытательного соединения при желаемой самой высокой тестовой концентрации в среде роста водорослей, подготовленной в соответствии с шагом 2. Для подготовки фондовых решений/приостановки следуйте ОЭСР 201 (для растворимых соединений) или ОЭСР 318 (для наноматериалов).
  2. Измерьте рН в биржевом растворе. Если он отклоняется более чем на одну единицу от среды роста водорослей, отрегулируйте рН до 8 либо с 1 M HCl или 1 M NaOH.
  3. Рассчитайте объем инокулума, необходимый для достижения конечной концентрации клеток 1 х10 4 клеток/мл в тестовом растворе 25 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: inoculum должны исходить от культуры незагрязнено экспоненциально растет Raphidocelis subcapitata выросли с использованием установки LEVITATT.
  4. Рассчитайте количество запасов раствора, чтобы добавить к каждому 25 мл объемной колбы, чтобы получить желаемые концентрации теста. Коэффициент между каждой концентрацией не должен превышать 3,2.
  5. Отметь одну томтрическую колбу объемом 25 мл для каждой выбранной концентрации и дополнительную 25-метровую томтрическую колбу.
  6. Добавьте количество запасов раствора испытательного соединения, необходимого для достижения желаемых концентраций, в объемную колбу 25 мл. Не добавляйте решение по акциям в элемент управления.
  7. Добавьте среду к каждой томной колбе объемом 25 мл, чтобы достичь объема около 20 мл.
  8. Добавьте объем инокулума, рассчитанный в шаге 3,3 к каждой томной колбе 25 мл. Добавьте среду к каждой томной колбе объемом 25 мл до конечного общего объема 25 мл.
  9. Остановите колбы и тщательно перемешайте, повернув колбы два раза по вертикали.
  10. Передача 0,4 мл из каждой колбы в отдельные флаконы винт крышка и добавить 1,6 мл ацетона (насыщенный MgCO 3 ):один образецдля каждого испытания концентрации и контроля. Закройте крышки плотно и хранить в темноте при комнатной температуре до измерения флуоресценции (раздел 4).
  11. Pipet 4 мл каждого тестового раствора в 20 мл сцинтилляционных флаконов (3 репликации на концентрацию и 5 репликаций для управления). Винт крышки на сцинтилляционные флаконы. Помните, что крышки должны иметь просверленное отверстие (примерно 1 мм в диаметре), чтобы обеспечить обмен CO2.
  12. После 24 ч, 48 ч и 72 ч, пипетка 0,4 мл с каждого флакона в винт колпачок флаконы и добавить 1,6 мл ацетона (насыщенный MgCO3). Закройте крышки плотно и хранить в темноте при комнатной температуре до измерения флуоресценции (раздел 4).
  13. После того, как последний образец взят на 72 ч, аккуратно объединить три репликации для данной концентрации в одном флаконе и измерить рН. Повторите для всех концентраций и контроля. РН не должен отклоняться более чем на 1,5 единицы от первоначального рН для любого из измеренных образцов.
  14. Разгрузите оставшиеся жидкости в контейнер для отходов в соответствии с вашими институциональными правилами и правилами.

4. Анализ образцов водорослей

  1. Используйте флуоресценционный спектрофотометр для измерения биомассы водорослей (здесь выражается как хлорофилл А). Пиковое излучение хлорофилла А составляет 420 нм для возбудимой длины волны и 671 нм для длины волны излучения.
  2. Измерьте флуоресценцию каждого отдельного образца три раза и вычислите среднее значение для каждого образца.
  3. Используйте уравнение 1 для расчета темпов роста. Измеренная флуоресценция (относительные единицы) может быть использована непосредственно в качестве параметра биомассы в уравнении 1.
    Уравнение 1: μ (ln Nt - ln N0) / t
    где μ является скорость роста (d-1), N0 является начальной биомассы, Nт является биомасса на время т, и т является длина испытательного периода (d). Обратите внимание, что N0 и Nt должны быть выражены в одном блоке.
  4. Используйте статистическое программное обеспечение для соответствия нелинейной кривой регрессии (например, функции логистики журнала или Weibull) к данным о темпах роста для получения эффективных значений концентрации на уровне 10%, 20% и 50% ингибирования. В дополнительной информации приводится пример кода для установки в статистическое программное обеспечение R с использованием пакета11 ДРК.

Результаты

Для определения чувствительности штамма водорослей проводится первоначальный тест со эталоном вещества. Справочными веществами, регулярно используемыми для R. subcapitata, являются дихромат калия и 3,5-дихлорфенол7,,8. На рисунке 3 и в т...

Обсуждение

Фитопланктон преобразует солнечную энергию и углекислый газ в органическое вещество и, таким образом, играет ключевую роль в водной экосистеме. По этой причине тесты на ингибирование водорослей включаются в качестве одного из трех обязательных испытаний на водную токсичность, необхо?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было профинансировано PATROLS - Расширенные инструменты для тестирования NanoSafety, Грант соглашение 760813 в рамках Horizon 2020 научно-исследовательской и инновационной программы.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetoneSigma-AldrichV179124
Ammonium chlorideSigma-Aldrich254134
BlueCap bottles (1L)Buch & Holm A/S 9072335
Boric acidSigma-AldrichB0394
Calcium chloride dihydrateSigma-Aldrich208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrateSigma-Aldrich255599
Copper(II) chloride dihydrateSigma-Aldrich307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateSigma-Aldrich E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000Hitachi
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
Iron(III) chloride hexahydrateSigma-Aldrich236489
LED light sourceHelmholt Elektronik A/SH35161Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-Aldrich230391
Manganese(II) chloride tetrahydrateSigma-Aldrich221279
Orbital shakerIKA2980200
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
Raphidocelis subcapitataNORCCANIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)Fisherscientific11526325
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014
Sodium hydroxideSigma-Aldrich415413
Sodium molybdate dihydrateSigma-Aldrich331058 
Spring clampFrederiksen Scientific A/S472002
Thermostatic cabinetVWRWTWA208450Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)Silvan22605630165
Volumetric flasks (25 mL)DWK Life Sciences246781455
Zinc chlorideSigma-Aldrich208086

Ссылки

  1. European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , (2016).
  2. Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
  3. Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
  4. Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
  5. Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
  6. Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
  7. Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
  8. International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
  9. Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
  10. Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
  11. Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
  12. Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
  13. Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
  14. Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
  15. Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
  16. Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
  17. Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
  18. Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
  19. Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
  20. Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
  21. Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
  22. Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
  23. Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
  24. Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

164RaphidocelisOECD 201ISO 8692LEVITATT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены