Nanomalzemeler ve Diğer Zor Maddelerin Alg Toksisitesi Testi için Küçük Ölçekli Kurulum

Özet

Led ile dikey olarak aydınlatılmış bir kurulum kullanarak zor maddeler (örneğin, renkli maddeler veya nanomalzemeler) için alg toksisite testi gösteriyoruz.

Özet

Ekotoksisite verileri, kimyasalların Avrupa ve uluslararası düzenlemelere (örneğin REACH) göre pazar öncesi ve sonrası tescili için bir gerekliliktir. Alg toksisite testi kimyasalların düzenleyici risk değerlendirmesinde sıklıkla kullanılmaktadır. Yüksek güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik elde etmek için standartlaştırılmış kılavuzların geliştirilmesi hayati önem taşımaktadır. Alg toksisite testi için, kurallar pH, sıcaklık, karbondioksit düzeyleri ve ışık yoğunluğu gibi parametrelerin kararlı ve düzgün koşullarını gerektirir. Nanomalzemeler ve diğer sözde zor maddeler ışık la karışarak elde edilen sonuçlarda büyük bir değişime neden olabilir ve bu da onların düzenleyici kabullerini engelleyebilir. Bu zorlukları gidermek için LEVITATT (Alg Toksisite Testleri için LED Dikey Aydınlatma Tablosu) geliştirdik. Kurulum, aşağıdan LED aydınlatmayı kullanarak homojen bir ışık dağılımı ve sıcaklık kontrolü sağlarken aynı zamanda numune içi gölgelemi en aza indirir. Kurulum biyokütle nicelleştirme için örnek hacmi optimize eder ve aynı zamanda yosun üstel büyümesini desteklemek için CO₂ yeterli bir akını sağlamak yok. Ayrıca, test kaplarının malzemesi adsorpsiyon ve volatilization en aza indirmek için özel olarak uyarlanabilir. Renkli maddeler veya partikül süspansiyonlar test ederken, LED ışıklarıkullanımı da ek ısı üretimi olmadan ışık yoğunluğunu artırmak için izin verir. Kompakt tasarım ve minimum ekipman gereksinimleri, LEVITATT'ın çok çeşitli laboratuvarlarda uygulanması olanaklarını artırır. Alg toksisite testi için standart ISO ve OECD yönergelerine uygun olmakla birlikte, LEVITAT ayrıca iki referans madde (3,5-Dicholorophenol ve K₂Cr₂O₇₎ve üç nanomalzeme (ZnO, CeO₂ve BaSO₄₎için erlenmeyer şişeleri ve mikrotiter plakalara göre daha düşük bir numune arası değişkenlik gösterdi.

Giriş

Alg toksisite testi, avrupa ve uluslararası düzenlemeler (örneğin REACH¹ ve TSCA (ABD) tarafından kimyasalların pazar öncesi ve sonrası kaydı için gerekli olan ekotoksisite verilerini oluşturmak için kullanılan üç zorunlu testten biridir. Bu amaçla, uluslararası kuruluşlar (örneğin, ISO ve OECD) tarafından standartlaştırılmış alg test yönergeleri geliştirilmiştir. Bu test standartları ve yönergeleri, pH, sıcaklık, karbondioksit seviyeleri ve ışık yoğunluğu açısından ideal test koşullarını öngörülmüştür. Ancak, alg testi sırasında istikrarlı test koşullarının korunması pratikte zordur ve sonuçlar kimyasal maddeler ve nanomalzemeler (genellikle "zor maddeler" olarak anılacaktır) bir dizi için tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik ile ilgili sorunlar muzdarip². Mevcut alg toksisite test kurulumlarının çoğu nispeten büyük hacimlerde (100-250 mL) bir kuvöz içinde bir orbital shaker üzerinde bulunan çalışır. Böyle bir kurulum test konsantrasyonlarının sayısını sınırlar ve elde edilebilir ve yüksek hacimli alg kültürü ve test materyalini çoğaltır. Ayrıca, bu kurulumlar nadiren tek tip bir ışık alanı var ve güvenilir aydınlatma koşulları daha büyük şişelerde elde etmek daha zordur, Kısmen ışık yoğunluğu katlanarak azalır daha fazla ışık seyahat ve kısmen şişe geometrisi nedeniyle. Alternatif kurulumlar, pH, ek biyokütle ölçümleri, pigment ekstraksiyonu veya yıkıcı örnekleme gerektiren diğer analizleri ölçmek için yeterli numune alma hacimlerine izin vermeyen küçük numune hacimleri içeren plastik mikrotiter³ plakalardan oluşur. Nanomalzemeler ve renkli süspansiyonlar oluşturan maddelerin alg toksisite testi için mevcut kurulumları kullanarak belirli bir sorun girişim veya alg hücreleri için kullanılabilir ışık engelleme, genellikle "gölgeleme"^4,,⁵olarak anılacaktır . Test materyali ve/veya test materyali ile alg hücreleri arasındaki etkileşimler şişeler içinde gölgeleme oluşabilir veya şişeler arasında birbirlerine ve ışık kaynağına göre konumlamaları nedeniyle gölgeleme oluşabilir.

Yöntem, Arensberg ve ark.⁶ tarafından tanıtılan ve OECD 201⁷ve ISO 8692⁸gibi standartlara uygun olarak test edilmesine olanak tanıyan küçük ölçekli alg toksisite testi kurulumuna dayanmaktadır. Yöntem daha yukarıda belirtilen sınırlamaları gidermek için optimize edilmiştir: 1) minimum ısı üretimi ile düzgün ışık koşulları sağlamak için LED ışık teknolojisini kullanarak, 2) sabit pH korurken kimyasal / biyolojik analiz için yeterli örnek hacmi sağlayan, CO₂ düzeyleri, ve 3) uçucu maddelerin veya maddelerin test etmek için çok yönlü test konteyner malzeme kullanımını sağlayan yüksek bir sorpsiyon potansiyeli ile.

Protokol

1. LEVITATT kurulumunun tanımı

1. Işık penetrasyonuna izin veren 20 mL sintillasyon cam şişeleri(Şekil 1, insert 1) kullanın. Alternatif olarak, hafif penetrable plastik şişeler kullanılabilir. Bir fotometre kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün.
2. Biyokütlenin ölçülmesine ve kuluçka sırasında ve sonrasında nanomalzemelerin karakterizasyonu/nicelemesi için testin başında en az 4 mL test süspansiyonu kullanın(Şekil 1, insert 2).
3. Atmosferle CO₂ değişimi için küçük bir delik (yaklaşık 1 mm çapında) delinmiş bir kapak(Şekil 1, insert 3) ile 20 mL sintilasyon şişelerini yerleştirin. Bu değişim, test sırasında sabit pH ve CO₂ düzeylerini sağlamak için çok önemlidir.
4. Uçucu maddeler için, co 2 zenginleştirilmiş sodyum bikarbonat (NaHCO₃) tampon sistemi¹⁰tarafından çözelti içinde_{muhafaza edilir} hiçbir gaz fazı ile bir şırınga⁹ veya tamamen kapalı şişeler kullanarak headspace CO₂ zenginleştirmek için bir hava geçirmez Teflon kaplı kapak kullanın.
5. Dış kasaya takılan kelepçelerle şişeleri sabitle(Şekil 1, insert 4).
6. Test şişelerinin altında yer alan bir LED ışık kaynağı kullanın(Şekil 1, insert 5) "cool-white" veya "gün ışığı" tipinde tek tip floresan aydınlatma ve 400 nm ile 700 nm arasında fotosentetik olarak etkili dalga boyu aralığında ölçülen 60-120 μEμm^{-2-s -1} aralığında bir ışık yoğunluğu sağlar. Kurulum, 5-160 μEμ^{-2 °s-1} aralığında, kaynağa bir ışık dimmer takarak ayarlanabilir ışık yoğunluğunu kullanır. Bu, daha yüksek ve daha düşük ışık yoğunluklarında test edilmesine olanak sağlar.
7. Test süresince numuneleri karıştırmak için kurulumu yörüngesel bir çalkalayıcıya monte edin. Bu da hücreleri serbest süspansiyonda tutar ve havadan suya CO₂ kütle transferini kolaylaştırır(Şekil 1, insert 6).
8. Kurulum, test boyunca sabit sıcaklıkları korumak için sıcaklık kontrollü bir odaya veya termostatik bir kabine yerleştirin(Şekil 1,insert 7).

Şekil 1: Alg Toksisitesi Testleri (LEVITATT) için LED Dikey Aydınlatma Tablosu resmi. 1) Kuluçka için 20 mL cam ışıltı şişeleri, 2) analiz için 4 mL numune, 3) CO₂ değişimi için delinmiş delikli kapak, tanımlanmış ışık koşulları için 4) kasa, 5) kasanın merkezinde bulunan LED ışık kaynağı, 6) deney sırasında ajitasyon için orbital shaker ve 7) termostatik dolap. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Alg büyüme ortamının hazırlanması

1. ISO 8692 alg büyüme ortamı dört farklı stok çözümünden oluşmaktadır. Uygun miktarda tuzları tartın ve Tablo 1'egöre ultra saf suda seyreltin.

Stok çözümleri	Besin	Stok çözeltisinde konsantrasyon	Test çözeltisinde konsantrasyon
1: Makrobesinler	NH4Cl	1.5 g/L	15 mg/L (N: 3.9 mg/L)
	MgCl2,6H2O	1.2 g/L	12 mg/L (Mg: 2.9 mg/L)
	CaCl2,2H2O	1.8 g/L	18 mg/L (Ca: 4.9 mg/L)
	MgSO4,7H2O	1.5 g/L	15 mg/L (S: 1.95 mg/L)
	KH2PO4	0,16 g/L	1.6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA	FeCl3,6H2O	64 mg/L	64 μg/L (Fe: 13 μg/L)
	Na2EDTA2H2O	100 mg/L	100 μg/L
3: Eser elementler	H3BO3a	185 mg/L	185 μg/L (B: 32 μg/L)
	MnCl2,4H2O	415 mg/L	415 μg/L (Mn: 115 μg/L)
	ZnCl2	3 mg/L	3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L)
	CoCl2,6H2O	1.5 mg/L	1.5 μg/L (Co: 0.37 μg/L)
	CuCl2,2H2O	0.01 mg/L	0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L)
	Na2MoO4,2H2O	7 mg/L	7 μg/L (Mo: 2.8 g/L)
4: NaHCO3	NaHCO3	50 g/L	50 mg/L (C: 7.14 mg/L)

Tablo 1: Alg büyüme ortamı için stok çözeltilerinde besin konsantrasyonları

NOT: H₃BO₃ 0,1 M NaOH eklenerek çözülebilir. Metal iyonları ile karmaşıklaşmayı önlemek için, metaller test ederken EDTA çıkarılmalıdır. Membran filtrasyon (ortalama gözenek çapı 0,2 μm) veya otoklavlama (120 °C, 15 dk) ile stok çözeltilerini sterilize edin. 2 ve 4 otoklav stok çözeltisi yapmayın, ancak membran filtrasyon ile sterilize edin. Çözeltileri karanlıkta 4 °C'de saklayın.

2. Alg büyüme ortamının 1 L'sini üretmek için, 500 mL sterilize edilmiş ultrasaf suyu 1 L sterilize edilmiş hacimsel şişeye aktarın ve 10 mL stok çözeltisi 1: Makrobesinler, 1 mL stok çözeltisi 2: Fe-EDTA, 1 mL stok çözeltisi 3: Eser elemanlar ve 1 mL stok çözeltisi 4: NaHCO₃.
3. Sterilize edilmiş ultra saf su ile 1 L'ye kadar doldurun, şişeyi durdurun ve alg büyüme ortamını homojenize etmek için iyice çalkalayın.
4. Solüsyonu kullanmadan önce havayla temas halinde bir gecede bırakarak veya steril, filtrelenmiş havayla köpürerek 30 dakika boyunca dengeleyin. Dengeden sonra pH'ı gerekirse 1 M HCl veya 1 M NaOH ile pH 8.1 ± 0.2 olarak ayarlayın.

3. Alg testinin ayarlanması

NOT: Alg test prosedürünün akış diyagramı Şekil 2'degösterilmiştir.

Şekil 2: Alg test kurulumunun akış diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Adım 2'ye göre hazırlanan alg büyüme ortamında test bileşiğinin stok çözeltisini istenilen en yüksek test konsantrasyonunda hazırlayın. Stok çözümlerinin/süspansiyonların hazırlanması için OECD 201 (çözünür bileşikler için) veya OECD 318 'i (nanomalzemeler için) takip edin.
2. Stok çözeltisindeki pH'ı ölçün. Alg büyüme ortamından birden fazla birim sapıyorsa, pH'ı 1 M HCl veya 1 M NaOH ile 8'e ayarlayın.
3. 25 mL'lik bir test çözeltisinde 1 x 10⁴ hücre/mL'lik son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için gereken inokül hacmini hesaplayın.
   NOT: Inoculum, LEVITATT kurulumu kullanılarak yetiştirilen kontamine olmayan bir şekilde büyüyen Raphidocelis subcapitata kültüründen gelmelidir.
4. İstenilen test konsantrasyonlarını elde etmek için her 25 mL hacimsel şişeye eklenecek stok çözeltisi miktarını hesaplayın. Her konsantrasyon arasındaki faktör 3.2'yi geçmemelidir.
5. Seçilen her konsantrasyon için bir adet 25 mL hacimsel şişe ve 25 mL hacimsel şişe işaretli kontrol işaretli.
6. 25 mL hacimsel şişeye istenilen konsantrasyonlara ulaşmak için gerekli test bileşiğin stok çözeltisi miktarını ekleyin. Denetime stok çözümü not eklemeyin.
7. Yaklaşık 20 mL'lik bir hacme ulaşmak için her 25 mL hacimsel şişeye ortayı ekleyin.
8. Her 25 mL hacimli şişeye adım 3.3'te hesaplanan inokül hacmini ekleyin. Her 25 mL hacimsel şişeye ortayı 25 mL'lik son toplam hacmine ekleyin.
9. Mataraları durdurun ve şişeleri dikey olarak iki kez çevirerek iyice karıştırın.
10. Her şişeden 0,4 mL'lik tek tek vida kapağı şişelerine aktarın ve 1,6 mL aseton ekleyin (MgCO₃ile doymuş): her test konsantrasyonu ve kontrol için bir numune. Kapakları sıkıca kapatın ve floresan ölçümlerine (bölüm 4) kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
11. Her test çözeltisinin 4 mL'si 20 mL sintillasyon şişelerine (konsantrasyon başına 3 kopya ve kontrol için 5 kopya). Scintillation şişeleri vida kapakları. Kapakların CO₂ değişimi için delinmiş bir delik (yaklaşık 1 mm çapında) olması gerektiğini unutmayın.
12. 24 saat, 48 saat ve 72 h sonra, vida kapağı şişeleri içine her şişe den 0.4 mL pipet ve aseton 1.6 mL ekleyin (MgCO ile doymuş_3). Kapakları sıkıca kapatın ve floresan ölçümlerine (bölüm 4) kadar oda sıcaklığında karanlıkta saklayın.
13. Son numune 72 saat alındıktan sonra, bir şişede belirli bir konsantrasyon için üç kopyayı yavaşça bir araya ve pH'ı ölçün. Tüm konsantrasyonlar ve kontrol için tekrarlayın. ölçülen örneklerin herhangi biri için pH ilk pH'dan 1,5 birimden fazla sapmamalıdır.
14. Kalan sıvıları kurumsal kural ve yönetmeliklere uygun olarak bir atık kabına boşaltın.

4. Alg test örneklerinin analizi

1. Alg biyokütlesini ölçmek için floresan spektrofotometre kullanın (burada klorofil A olarak ifade edilir). Klorofil A için pik emisyon uyarma dalga boyu için 420 nm ve emisyon dalga boyu için 671 nm'dir.
2. Her bir numunenin floresansını üç kez ölçün ve her numunenin ortalama değerini hesaplayın.
3. Büyüme hızını hesaplamak için denklem 1'i kullanın. Ölçülen floresan (bağıl birimler) denklem 1'de biyokütle parametresi olarak doğrudan kullanılabilir.
   Denklem 1: μ = (ln N_t – ln N₀) / t
   μ büyüme hızı (d^-1),N₀ ilk biyokütle, N_t zaman t biyokütle ve t test süresi (d) uzunluğudur. Not, N₀ ve N_t aynı birimde ifade edilmelidir.
4. %10, %20 ve %50 inhibisyon da etkili konsantrasyon değerleri elde etmek için doğrusal olmayan bir regresyon eğrisini (örn. log-logistic veya Weibull fonksiyonu) büyüme hızı verilerine sığdırmak için istatistiksel bir yazılım kullanın. Ek bilgilerde DRC paketi¹¹ kullanarak istatistiksel yazılım R montaj için kod bir örnek verilir.

Sonuçlar

Alg suşunun hassasiyetini belirlemek için referans madde ile ilk test yapılır. Referans maddeler düzenli R. subcapitata için kullanılan potasyum dikromat ve 3,5-Dichlorphenol^7,8. Şekil 3 ve Tablo 2, R'deki DRC paketi büyüme oranlarına uygulandığında eğri montajı ve istatistiksel çıktıları içeren bir alg testinin temsili bir sonucunu göstermektedir.

Tartışmalar

Fitoplankton, güneş enerjisini ve karbondioksiti organik maddeye dönüştürür ve böylece sucul ekosistemde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, alg büyüme hızı inhibisyonu testleri kimyasalların düzenleyici risk değerlendirmesi için gerekli üç zorunlu sutoksisitesi testinden biri olarak dahildir. Güvenilir ve tekrarlanabilir alg toksisitesi testi yapabilme yeteneği bu açıdan çok önemlidir. Erlenmeyer şişeleri kullanılarak yapılan test kurulumları, girişte açıklandığı gibi çeşitli farklıl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Sigma-Aldrich	V179124
Ammonium chloride	Sigma-Aldrich	254134
BlueCap bottles (1L)	Buch & Holm A/S	9072335
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0394
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	255599
Copper(II) chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000	Hitachi
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	236489
LED light source	Helmholt Elektronik A/S	H35161	Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	221279
Orbital shaker	IKA	2980200
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Raphidocelis subcapitata	NORCCA		NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL)	Fisherscientific	11526325
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	415413
Sodium molybdate dihydrate	Sigma-Aldrich	331058
Spring clamp	Frederiksen Scientific A/S	472002
Thermostatic cabinet	VWR	WTWA208450	Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm)	Silvan	22605630165
Volumetric flasks (25 mL)	DWK Life Sciences	246781455
Zinc chloride	Sigma-Aldrich	208086