דיסקציה, אימונוהיסטוכימיה והרכבה של מוחות זחלים ודרוזופילה בוגרים להדמיית האונה האופטית

Summary

פרוטוקול זה מתאר שלושה שלבים להכנת אונות אופטיות דרוזופילה בוגרות של זחלים ובוגרים להדמיה: 1) דיסקציות מוחיות, 2) אימונוהיסטוכימיה ו-3) הרכבה. דגש מושם על שלב 3, שכן נדרשים כיווני הרכבה ברורים כדי לדמיין מבנים ספציפיים של האונה האופטית.

Abstract

האונה האופטית דרוזופילה , המורכבת מארבעה נוירופילים: למינה, מדולה, לובולה ולוחית לובולה, היא מערכת מודל מצוינת לחקר המנגנונים ההתפתחותיים המייצרים גיוון עצבי ומניעים הרכבת מעגלים. בהינתן הארגון התלת-ממדי המורכב שלה, ניתוח האונה האופטית דורש להבין כיצד הנוירופילים הבוגרים שלה ואבותיה הזחלים ממוקמים ביחס זה לזה ולמוח המרכזי. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, צביעה חיסונית והרכבה של מוחות זחלים ובוגרים לצורך דימות של האונה הראייתית. דגש מיוחד מושם על הקשר בין כיוון הרכבה לבין הארגון המרחבי של האונה הראופטית. אנו מתארים שלוש אסטרטגיות הרכבה בזחל (קדמי, אחורי ורוחבי) ושלוש בזחל הבוגר (קדמי, אחורי ואופקי), שכל אחת מהן מספקת זווית הדמיה אידיאלית למבנה אונה אופטית מובחן.

Introduction

מערכת הראייה דרוזופילה, המורכבת מהעין המורכבת והאונה האופטית שמתחתיה, הייתה מודל מצוין לחקר התפתחות ותפקוד מעגלים עצביים. בשנים האחרונות, האונה האופטית בפרט התפתחה כמערכת רבת עוצמה שבה ניתן לחקור תהליכים נוירו-התפתחותיים כגון נוירוגנזה וחיווט מעגלים 1,2,3,4,5,6,7,8. הוא מורכב מארבעה נוירופילים: למינה, מדולה, לובולה וצלחת לובולה (שני האחרונים מרכיבים את קומפלקס הלובולה)1,2,3,4,5,6. Photoreceptors מן העין, המטרה נוירונים של lamina ו medulla, אשר מעבדים קלט חזותי ולהעביר אותם neuropils של קומפלקס lobula 1,2,3,4,5,6. נוירוני הקרנה בקומפלקס הלובולה שולחים לאחר מכן מידע חזותי למרכזי עיבוד מסדר גבוה יותר במוח המרכזי ^1,5,9. הארגון המורכב של האונה הראייתית, המתחייב מהצורך לשמור על רטינוטופיה ולעבד סוגים שונים של גירויים חזותיים, הופך אותה למערכת אטרקטיבית לחקר האופן שבו מורכבים מעגלים עצביים מתוחכמים. יש לציין כי המדולה חולקת קווי דמיון בולטים הן בארגון והן בהתפתחות שלה עם הנוירורשתית, אשר מזה זמן רב מהווה מודל להתפתחות מעגלים עצביים^של בעלי חוליות ^3,8.

התפתחות האונה האופטית מתחילה במהלך האמבריוגנזה, עם מפרט של ~ 35 תאים אקטודרמליים היוצרים את הפלקוד האופטי 2,4,5,6,7,8. לאחר בקיעת הזחל, הפלקוד האופטי מחולק לשתי פרימורדיה נפרדות: 1) מרכז ההתרבות החיצוני (OPC), המייצר את תאי העצב של הלמינה והמדולה החיצונית, ו-2) מרכז ההתרבות הפנימי (IPC), המייצר תאי עצב של קומפלקס המדולה והלובולה הפנימית 4,5,6,10 . בזחל המאוחר של הכוכב השני, התאים הנוירואפיתליאליים של OPC ו- IPC מתחילים להפוך לנוירובלסטים שלאחר מכן מייצרים נוירונים באמצעות תאי אם גנגליון ביניים 4,5,11,12. נוירובלסטים של האונה האופטית מעוצבים על ידי גורמי שעתוק מוגבלים מרחבית וזמנית, הפועלים יחד כדי ליצור גיוון עצבי בצאצאיהם 11,12,13,14. בגולם, המעגלים של נוירופילס האונה האופטית מורכבים באמצעות תיאום של מספר תהליכים, כולל מוות תאי מתוכנת ^11,15, נדידה עצבית^12,16, מיקוד אקסונלי/דנדריטי^10,17, היווצרות סינפסות^18,19 וסיבובי נוירופיל^10,17.

במאמר זה אנו מתארים את המתודולוגיה שבאמצעותה מנתחים מוחות זחלים ובוגרים, מכתימים את מערכת החיסון ומרכיבים אותם לצורך הדמיה של האונה הראייתית. בהינתן הארגון התלת-ממדי המורכב שלה, ניתוח האונה האופטית דורש להבין כיצד הנוירופילים הבוגרים שלה ואבותיה הזחלים ממוקמים ביחס זה לזה ולמוח המרכזי. לפיכך, אנו שמים דגש מיוחד על האופן שבו האוריינטציה של הרכבה מתייחסת לארגון המרחבי של מבני האונה האופטית. אנו מתארים שלוש אסטרטגיות הרכבה עבור מוחות זחלים (קדמיים, אחוריים ורוחביים) ושלוש עבור מוחות בוגרים (קדמי, אחורי ואופקי), שכל אחת מהן מספקת זווית אופטימלית לדימות אוכלוסיית אב או נוירופיל ספציפיים של האונה האופטית.

Protocol

1. הכנת מוחות הזחלים לדימות קונפוקלי

1. דיסקציות
   הערה: לפני תחילת הדיסקציה, הכינו את התמיסות (4% פורמלדהיד במי מלח חוצצים פוספט (PBS)) ו-PBT (0.1-0.3% טריטון ב-PBS). הפתרון לתקן צריך להיות ממוקם על קרח במהלך הדיסקציה. למרות שמקביע פרפורמלדהיד (PFA) משמש בפרוטוקול זה, אסטרטגיות תיקון חלופיות (באמצעות PLP²⁰ או PEM²¹) תוארו עבור אפיטופים ספציפיים. עבור דיסקציות זחל, שני זוגות של מלקחיים (Dumont #5 או #55s) נדרשים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים נוספים.
   1. התחל על ידי מילוי כל באר של צלחת לנתח עם 400 μL של 1x PBS. השתמשו בזוג מלקחיים כדי לקטוף בעדינות זחלי כוכב שלישי נודדים הזוחלים על החלק הפנימי של הבקבוקון. מניחים את הזחלים בבאר הראשונה של התבשיל המלא PBS.
   2. לוקחים זחל אחד ומעבירים אותו לבאר האמצעית. בעזרת היד הלא דומיננטית, החזיקו את גוף הזחל למטה בבסיס הבאר.
   3. בעזרת היד הדומיננטית, אחזו בעדינות בוו הפה של הזחל והתרחקו מהגוף. מוח הזחל צריך להיות מחובר לוו הפה ולרקמת עזר אחרת והוא יירד כאשר הרקמה נמשכת משם.
   4. מוציאים דיסקים דמיוניים ומעבירים את מוח הזחל לבאר השלישית של צלחת הדיסקציה. הדיסקים הדמיוניים הם רקמות אפיתל המקיפות את מוח הזחל, המייצרות מבנים בוגרים כגון האנטנות, העיניים, הרגליים והכנפיים²⁰. אם נשארים על הרקמה, הדיסקים הדמיוניים עלולים לחסום את ההכתמה החיסונית התקינה של מוח הזחל.
      1. כדי להסיר את הדיסקים הדמיוניים, השתמש בזוג מלקחיים כדי לאחוז בחוזקה במוח דרך חוט העצב הגחוני. בעזרת זוג מלקחיים נוסף, תלשו בעדינות את הדיסקים.
      2. הסר את דיסק העין בזהירות, שכן הוא עוטף את פני השטח של אונות המוח. כדי להסיר את דיסק העין, השתמש בזוג מלקחיים כדי להחזיק את המוח כנגד בסיס הצלחת. במקום להחזיק את המוח דרך חוט העצב הגחוני, השתמשו במלקחיים כדי לתפוס קלות את אונת המוח תוך זהירות לא ללחוץ על האונה. בעזרת זוג מלקחיים נוסף, משכו בעדינות את דיסק העין.
         הערה: הדיסק הדמיוני של העין יוליד בסופו של דבר פוטורצפטורים של הרשתית. למי שמעוניין לחקור קישוריות עצבית בין הרשתית לאונה הראייתית, ניתן להשאיר את דיסק העין במוח. עם זאת, למי שמעוניין אך ורק במבני האונה האופטית, מומלץ להסיר את דיסק העין מכיוון שהוא עלול לפגוע באיכות התמונה בשל מיקומו על פני המוח.
   5. חזור על שלבים 1.1.2\u20121.1.4 עד שייאסף מספר מספיק של מוחות (או שיחלפו 30 דקות של זמן נתיחה). הדיסקציות לא אמורות להימשך יותר מ-30 דקות כדי להבטיח ששלמות הרקמה לא תיפגע.
   6. לאחר סיום תקופת הדיסקציה, השתמש בפיפט P200 כדי להסיר בזהירות PBS מהבאר השלישית. ודא כי כמות קטנה של נוזל נשאר בבאר כדי לשמור על המוח שקוע.
      הערה: חיוני לשמור על המוח שקוע בנוזל בכל נקודות הפרוטוקול. אם הרקמה מתייבשת, איכות הכתם עלולה להיפגע על ידי אוטופלואורסצנטיות לא רצויה בתמונה הקונפוקלית.
   7. הוסף 500 μL של תמיסת תיקון קר לתוך הבאר השלישית. השתמשו בזוג מלקחיים כדי לערבב את הנוזל בעדינות, ואפשרו למוח להסתחרר בצלחת. מכסים את הכלי במגלשת זכוכית ומניחים אותו על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר קיבוע רקמות.
   8. הסר את פתרון הקיבוע ולשטוף את המוח עם 400 μL PBT, 5 פעמים.
      הערה: טריטון הוא חומר ניקוי ב-PBT שמונע מהמוח להידבק זה לזה או לצלחת, ומכין את הרקמה לחדירת נוגדנים אופטימלית.
2. אימונוהיסטוכימיה
   הערה: ישנם מספר נוגדנים ראשוניים הזמינים מבנק Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) שניתן להשתמש בהם כדי לסמן מבנים ספציפיים של אונה אופטית או סוגי תאים. DE-Cadherin מסמן את הנוירואפיתליה IPC ו-OPC, Bruchpilot (Brp) מסמן את הנוירופיל המתפתח ואת תוויות התחש למינה ונוירוני לובולה (כמו גם תת-קבוצה קטנה של נוירוני מדולה). בנוסף, Elav יכול לשמש כדי לסמן נוירונים, Prospero כדי לסמן תאי אם גנגליון ו Repo כדי לזהות גליה.
   1. הכן את תמיסת הנוגדנים הראשונית על ידי הוספת נוגדנים ל- PBT עד לנפח כולל של 100 μL. ניתן להשתמש בחומר חוסם (10% סרום עיזים רגיל) למניעת קשירה לא ספציפית בין הנוגדן הראשוני לרקמה 20,22,23. הנוגדנים המשמשים בפרוטוקול זה מסמנים באופן ספציפי רקמת מוח ללא צורך בחומרים חוסמים.
   2. הסר את השטיפה הסופית שלאחר הקיבוע והוסף את תמיסת הנוגדנים העיקרית. ודא שיש רק כמות קטנה של PBT בבאר לפני הוספת תמיסת הנוגדנים. לאחר הוספת התמיסה, ערבבו בעדינות את המוח עם מלקחיים 5\u201210 פעמים. מכסים במגלשת זכוכית, אוטמים בסרט מעבדה ודגרים ב-4°C למשך הלילה.
      1. לחלופין, אם קיים שייקר אורביטלי בקירור, הניחו את הצלחת על השייקר כדי לייעל את הדגירה למשך הלילה.
         הערה: ניתן לבצע לחילופין את הדגירה הראשונית של הנוגדנים ואת כל השלבים הבאים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. נפח הדגירות הראשוניות והמשניות יכול להישאר 100 μL, אך שלבי השטיפה צריכים להתבצע עם 800 μL או יותר של PBT.
   3. לאחר הדגירה, לשטוף את הנוגדנים העיקריים עם PBT כמו בשלב 1.1.8 של החלק הקודם.
      הערה: יש לשמור את תמיסת הנוגדנים העיקרית ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C מכיוון שניתן לעשות בה שימוש חוזר לניסויים הבאים. נוגדנים ראשוניים רבים ניתנים לשימוש חוזר עד ארבע פעמים.
   4. הוסיפו 400 μL של PBT למוח לשטיפה סופית. מכסים את המנה במגלשה, אוטמים בסרט מעבדה ומניחים אותה על שייקר מסלול במהירות נמוכה (100 סל"ד) ובטמפרטורת החדר (RT) למשך ~4 שעות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן להשאיר את המוח בשטיפה במשך 2\u20123 ימים בטמפרטורה של 4°C.
   5. הכן את תמיסת הנוגדנים המשנית בנפח כולל של 100 μL.
      הערה: בפרוטוקול זה, כל הנוגדנים המשניים משמשים בדילול של 1:500, ללא חומרים חוסמים.
   6. הסר את שטיפת PBT מהבאר והוסף את תמיסת הנוגדנים המשנית. מערבבים את הרקמה בתמיסה באמצעות זוג מלקחיים. מכסים את המנה בשקופית ובסרט מעבדה. הניחו את המנה על שייקר מסלול ב- RT למשך תקופת דגירה מינימלית של שעתיים. מכיוון שנוגדנים משניים מכילים פלואורופורים רגישים לאור, כסו את המנה ברדיד אלומיניום.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן להשאיר את המוח בתמיסת נוגדנים משנית למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
   7. לשטוף את הנוגדנים המשניים כמתואר בשלב 1.2.3. הוסיפו 400 μL של PBT למוח לשטיפה סופית. מכסים את המנה בשקופית, אוטמים בסרט מעבדה ונייר כסף. הניחו את המוח על שייקר ב-RT למשך 4 שעות.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן להשאיר את המוח בשטיפה במשך 2\u20123 ימים בטמפרטורה של 4°C.
3. הרכבה
   1. יש להסיר את שטיפת ה-PBT הסופית ולהחליף בשתי טיפות של אמצעי הרכבה בטוחים לפלואורסצנטיות. הנח טיפה ממדיית ההרכבה במרכז שקופית.
   2. העבר מוחות מהבאר אל הטיפה במגלשה באמצעות מלקחיים. כדי להימנע מפגיעה באונות הראייה, המוח יכול להיות מוחזק על ידי חוט העצב הגחוני בזמן המעבר למגלשה.
   3. הרכיבו את המוחות בהתאם לאסטרטגיות ההרכבה הבאות (איור 1A).
      1. הצד הקדמי כלפי מעלה
         הערה: למעוניינים לדמיין את תקע המדולה, הלמינה או הלובולה הקדמי, כיוון הרכבה זה הוא אידיאלי. הדרך הטובה ביותר להבחין בין תושבות קדמיות לעומת אחוריות היא על ידי בחינת המיקום של חוט העצב הגחוני ביחס לאונות המוח.
         1. השתמשו בכיוון הקדמי כדי לצפות בחוט העצב הגחוני המקרין החוצה מעל האונות (איור 1B).
      2. הצד האחורי למעלה
         הערה: כיוון זה מומלץ למי שמעוניין להמחיש את הקצוות האחוריים של OPC (pOPC) או IPC ^10,11.
         1. השתמשו בכיוון האחורי כדי לראות את חוט העצב הגחוני מקרין החוצה מתחת לאונות המוח (איור 1C).
      3. מבט רוחבי
         הערה: כיוון הרכבה רוחבי משמש כדי לדמיין את הסהר של נוירוני תקע למינה, מדולה או לובולה בשני הצירים הגב-גחוני והקדמי-אחורי במישור אחד (איור 1G).
         1. עבור הר רוחבי, לפצל את אונות המוח זו מזו כדי ליפול שטוח על הצד שלהם, כאשר תקע lamina ו lobula פונה כלפי מעלה.
         2. באמצעות שני זוגות של מלקחיים חדים, לפצל את חוט העצב הגחוני לשניים, החל מהמקום שבו החוט מתחבר לאונות. שימו לב ששתי האונות כבר נפרדות זו מזו, כאשר חוט העצב הגחוני מחזיק אותן בשלמותן. לכן, לפצל את חוט העצב הגחוני מנקודת המחשוף בין האונות, כדי להפריד ביניהם. לאחר מכן הפכו כל אונת מוח וחיברו את חוט העצב הגחוני לצדדיהם כשהמשטחים הרוחביים פונים כלפי מעלה.
            הערה: עבור תושבת תצוגה רוחבית, מומלץ להשתמש במחט טונגסטן עם קצה דק כדי לכוון את אונת המוח על צידה. כדי לדמיין בבירור את כיוון האונות ואת כיוון חוט העצבים הגחוני בעת הרכבה, ניתן להתאים את תאורת המיקרוסקופ. אם משתמשים במקור אור LED של צוואר אווז, יש למקם את צוואר האווז במקביל לפני השטח של המגלשה לקבלת ראות ברורה. כמו כן, ניתן להגביר או להקטין את עוצמת התאורה כדי לשפר את הניגודיות בין מבני המוח ולספק בהירות בזמן ההרכבה.
   4. הניחו טיפה קטנה של PBS משני צדי המצע המכיל את המוחות. הניחו כיסוי אחד על כל טיפה, וכיסוי אחרון החליק על המוח. הקצה הימני והשמאלי של הכיסוי העליון צריכים להישען על שתי הכיסויים האחרים (איור 1A).
      הערה: לפני הנחת כיסוי מעל המוח, יש לבנות גשר. עובי מוחות הזחלים הוא כ-200 מיקרומטר, ולכן, כדי לשמור על שלמות הרקמה, נוצר גשר שמגדיל את המרחק בין החלקת הכיסוי לפני השטח של המגלשה.
   5. אטמו את שולי הגשר בלק כדי לאבטח את המוחות המורכבים.
   6. דמיינו את המוח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

2. הכנת מוחות בוגרים לדימות קונפוקלי

1. דיסקציות
   הערה: נתיחות מוח של מבוגרים מאתגרות יותר ממוחות של זחלים ודורשות טיפול זהיר. מומלץ מאוד להשתמש לפחות בזוג אחד של מלקחיים עדינים במיוחד (Dumont #55) עבור חלק זה של הפרוטוקול.
   1. הרדימו זבובים עם_CO2, באמצעות מחט או משטח זבובים, והניחו אותם על מגבון מעבדה או מגבת נייר מעל קרח (כדי לשמור אותם מורדמים).
   2. הוסף 400 μL של PBS לכל שלוש הבארות של צלחת הזכוכית. השתמשו בזוג מלקחיים כדי לתפוס בעדינות זבוב בוגר אחד בכנפיים והניחו אותו בבאר הראשונה של המנה.
   3. השתמש בזוג מלקחיים המוחזקים ביד הלא דומיננטית כדי להחזיק את בית החזה של הזבוב כנגד בסיס הבאר. בעזרת היד הדומיננטית, משכו בעדינות את הראש משאר הגוף.
   4. מעבירים את הראש לבאר השנייה. לעתים קרובות, הראש יצוף ב- PBS ויכול להיות קשה לטיפול. השתמש זוג מלקחיים להחזיק אותו על בסיס הבאר על ידי proboscis.
   5. מקלפים אזור של הקוטיקולה בין העיניים באמצעות שתי המלקחיים. מכיוון שהמוח יושב ממש מתחת לקוטיקולה, היו עדינים ככל האפשר כדי למנוע פגיעה ברקמה הבסיסית. המשיכו לקלף את הקוטיקולה חתיכה אחר פיסה, עד שהמוח נחשף. הסר כל רקמת אביזר (כלומר, רשתית, קנה הנשימה, שקי אוויר) שעלולה להישאר מחוברת למוח.
      הערה: הסרת הרשתית תוארה בפרוטוקולים קודמים^22,24, אך ניתן גם להפריד את הלמינה משאר האונה הראייתית. זה שימושי עבור אלה שרוצים ללמוד את medulla או lobula מורכבים, שכן lamina יושב על פני השטח עלול לחסום הדמיה של אלה נוירופילס האונה האופטית בעת הדמיה. כדי להסיר את הלמינה, השתמש בזוג מלקחיים חדים כדי למשוך בעדינות את הכניסה בין הלמינה לבין נוירופילס medulla. הלמינה תתחיל לאט לאט להתקלף מהמדולה. חזור על תנועה זו עד להסרת הלמינה כולה. בתהליך זה חשוב לשמור על אחיזה איתנה במוח. השתמשו בזוג מלקחיים נוסף כדי להחזיק את המוח כנגד בסיס הצלחת על-ידי מיקומם כך שהחלק העליון והתחתון של המוח המרכזי יתאימו באופן מושלם בין קצות המלקחיים. אחיזה איתנה סביב המוח המרכזי תמנע נזק לא רצוי לאונה הראייתית.
   6. העבירו את המוח הנקי לבאר השלישית. חזור על שלבים 2.1.2\u20122.1.6 עד לקבלת מספר מספיק של מוחות או עד שיחלוף פרק זמן דיסקציה מרבי של 30 דקות.
   7. הסר את PBS בבאר השלישית והוסף 500 μL של פתרון תיקון. ודאו שהמוח לא מתייבש כאן או במהלך כל שלבי השטיפה, שכן הדבר יוביל לפלואורסצנטיות רקע בתמונות הקונפוקליות. כסו את המנה במגלשת זכוכית ואפשרו למוח לדגור בתיקון במשך 20 דקות ב- RT.
   8. לאחר קיבוע, לשטוף את המוח עם 400 μL של PBT, 5 פעמים.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לכסות את המוח במגלשת זכוכית ובסרט מעבדה ולהשאיר אותו בשטיפה למשך 2 ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. עבור חוקרים חדשים במערכת, ייתכן שיהיה קל יותר להשאיר רקמת עזר על המוח לפני ובמהלך הקיבוע. זה יאפשר לחוקרים למקסם את מספר דגימות המוח המתקבלות בתקופת דיסקציה נתונה. לאחר שהרקמה תוקנה ונשטפה, ניתן לנקות בזהירות את המוח לפני הוספת תמיסת נוגדנים ראשונית. מוחות בוגרים עם רקמת עזר נוטים לצוף, ולכן מסתכנים בהתייבשות. כתוצאה מכך, מומלץ להשתמש בזוג מלקחיים כדי לרכז בזהירות את כל המוחות במרכז הצלחת עם הוספת תמיסת תיקון, ולנקות את המוח מיד לאחר הקיבוע.
2. אימונוהיסטוכימיה
   1. בצע אימונוהיסטוכימיה כמתואר עבור מוח הזחל בסעיף 1.2.
   2. נוגדנים ראשוניים שימושיים מה- DSHB כוללים את אלה המוזכרים בפרוטוקול של אימונוהיסטוכימיה של הזחלים בסעיף 1.2. עיין בטבלת החומרים לקבלת רשימה מלאה של נוגדנים ודילולים מתאימים.
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות במהלך שלבי השטיפה עבור מוחות בוגרים, שכן הם עלולים לצוף על פני השטח של תמיסת השטיפה ולהסתכן בהתייבשות בצידי הבאר כאשר התמיסה מוסרת (מה שיוביל לפלואורסצנטיות רקע). תרגול טוב הוא להחזיק את פיפטה ביד אחת כדי להוסיף או למשוך נוזלים, וזוג מלקחיים ביד השנייה כדי לשמור על המוח שקוע.
3. הרכבה
   1. לפני שלב ההרכבה, בצע שטיפה סופית עם PBS (במקום PBT). PBS גורם למוחות להיות מעט דביקים, מה שמאפשר להם להישאר בכיוון הרצוי במהלך ההרכבה.
   2. הסירו את השטיפה הסופית והוחלפו בשלוש טיפות של אמצעי הרכבה בטוחים לפלואורסצנטיות. הניחו טיפה ממדיית ההרכבה במרכז שקופית מיקרוסקופ.
   3. העבר מוחות מהבאר אל הטיפה במגלשה באמצעות מלקחיים. כדי להימנע מפגיעה באונות הראייה ולמנוע מהרקמה להתייבש, שלפו בזהירות את המוח באמצעות פעולה נימית. סגרו באיטיות זוג מלקחיים סביב המוח עד שכמות קטנה של נוזל המכיל את המוח נמשכת בין הקצות.
      הערה: בעת העברת המוח למגלשה, היזהר לא לסגור את המלקחיים מכיוון שזה יפגע במוח. לחלופין, פיפטה P200 יכולה לשמש להעברת המוח. חתכו את קצה הקצה כדי להרחיב את הפתח ושטפו מראש עם PBT כדי למנוע מהמוח להידבק לחלק הפנימי של הקצה.
   4. הרכיבו את המוחות בהתאם לאסטרטגיות הבאות (איור 2A).
      1. הצד הקדמי כלפי מעלה
         הערה: כדי להמחיש תאי עצב מסוג למינה ומדולה, כוונו את המוח עם הצד הקדמי כלפי מעלה (איור 2B). ניתן להשיג זאת על ידי בחינת האנטומיה והעקמומיות של אונות האנטנה המרכזיות.
         1. בעזרת זוג מלקחיים, סובבו בעדינות את המוח על צדו כדי לבחון הן את הצד הקדמי והן את הצד האחורי. שימו לב שבצד הקדמי, העקמומיות של המוח בולטת ואונות האנטנה בולטות מעט החוצה מהמרכז.
      2. הצד האחורי למעלה
         1. מקמו את המוחות כשהצד האחורי (השטוח) פונה כלפי מעלה ואונות האנטנה כלפי מטה (איור 2C).
            הערה: זה יקרב את לוחית הלובולה והלובולה למשטח ההדמיה והוא אידיאלי למי שמעוניין לדמיין נוירונים מורכבים של לובולה.
      3. תצוגה אופקית
         הערה: כדי להמחיש את כל האישונים של האונה האופטית בו-זמנית, השתמשו באסטרטגיית הרכבה אופקית (איור 2G). בכיוון זה, גופי תאים עצביים, מסלולים אקסונליים וארבוריזציה דנדריטית ניתן לדמיין באותו מישור.
         1. בתחילה, לכוון את המוח עם הצד הקדמי למעלה. בעזרת מחט טונגסטן, הטו בעדינות את המוח ב-90° כלפי מעלה כך שהוא ישב על הצד הגבי שלו כשאונות האנטנה שלו פונות החוצה. בדקו שגם הצד הקדמי וגם הצד האחורי של המוח נראים בכיוון זה.
   5. במקום גשר החלקת כיסוי, השתמש בחימר כדי להגביה את החלקת הכיסוי מהמגלשה. השימוש בחימר מאפשר הרכבה מחדש של המוח לאחר הדמיה (המתוארת בחלק הדיון).
      1. הניחו פיסת חימר קטנה בכל פינה של פתק כיסוי. ודא שכל פיסת חימר היא יחסית באותו עובי. חתיכות החרסית צריכות להיות בעובי של 0.5-1 מ"מ. הניחו בעדינות את הכיסוי על המוח והפעילו לחץ קל על הפינות. הכיסוי צריך מיד לתפוס את הנוזל וליצור חותם. השקופית מוכנה כעת להדמיה.
         הערה: לאחסון לטווח ארוך של המגלשה, מומלץ לאטום את הכיסוי עם לק ולאחסן בטמפרטורה של 4°C הרחק מאור.

תוצאות

תמונות קונפוקליות של זחלים ואונות אופטיות בוגרות המותקנות בכיוונים המתוארים בפרוטוקול מוצגות באיור 1 ובאיור 2.

איור 1 מראה סכמות ופרוסות קונפוקליות מייצגות של מוחות זחלים הממוקמים באוריינטציה הקדמית, האחורית והצידית. בכיוו?...

Discussion

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לכתמים חיסוניים במוחות של זחלים ודרוזופילה בוגרת ומרכיבים אותם בכמה כיוונים. בעוד ששיטות להכתמת זחלים ומוחות בוגרים תוארו בעבר 22,23,24,27,28, אסטרטגיות הרכבה להדמיה אופ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506