Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique

Résumé

Ce protocole décrit trois étapes pour préparer les lobes optiques de la drosophile larvaire et adulte à l’imagerie : 1) dissections cérébrales, 2) immunohistochimie et 3) montage. L’accent est mis sur l’étape 3, car des orientations de montage distinctes sont nécessaires pour visualiser des structures spécifiques du lobe optique.

Résumé

Le lobe optique de la drosophile , composé de quatre neuropilles : la lame, la moelle, le lobula et la plaque lobula, est un excellent système modèle pour explorer les mécanismes de développement qui génèrent la diversité neuronale et pilotent l’assemblage des circuits. Compte tenu de son organisation tridimensionnelle complexe, l’analyse du lobe optique nécessite de comprendre comment ses neuropils adultes et ses progéniteurs larvaires sont positionnés les uns par rapport aux autres et par rapport au cerveau central. Nous décrivons ici un protocole de dissection, d’immunomarquage et de montage de cerveaux larvaires et adultes pour l’imagerie du lobe optique. Un accent particulier est mis sur la relation entre l’orientation du montage et l’organisation spatiale du lobe optique. Nous décrivons trois stratégies de montage chez la larve (antérieure, postérieure et latérale) et trois chez l’adulte (antérieure, postérieure et horizontale), chacune offrant un angle d’imagerie idéal pour une structure de lobe optique distincte.

Introduction

Le système visuel de la drosophile, composé de l’œil composé et du lobe optique sous-jacent, a été un excellent modèle pour l’étude du développement et de la fonction des circuits neuronaux. Ces dernières années, le lobe optique en particulier est devenu un système puissant dans lequel étudier les processus neurodéveloppementaux tels que la neurogenèse et le câblage des circuits 1,2,3,4,5,6,7,8. Il est composé de quatre neuropilles : la lame, la moelle, le lobule et la plaque lobula (ces deux dernières comprennent le complexe lobula)1,2,3,4,5,6. Les photorécepteurs de l’œil ciblent les neurones de la lame et de la moelle, qui traitent les entrées visuelles et les relaient aux neuropils du complexe lobula 1,2,3,4,5,6. Les neurones de projection du complexe lobula envoient ensuite des informations visuelles aux centres de traitement d’ordre supérieur dans le cerveau central ^1,5,9. L’organisation complexe du lobe optique, rendue nécessaire par la nécessité de maintenir la rétinotopie et de traiter différents types de stimuli visuels, en fait un système attrayant pour étudier l’assemblage de circuits neuronaux sophistiqués. Notamment, la moelle partage des similitudes frappantes dans son organisation et son développement avec la neurorétine, qui a longtemps été un modèle pour le développement des circuits neuronaux des vertébrés ^3,8.

Le développement du lobe optique commence au cours de l’embryogenèse, avec la spécification de ~35 cellules ectodermiques qui forment la placode optique 2,4,5,6,7,8. Après l’éclosion des larves, la plaque optique est subdivisée en deux primordiums distincts : 1) le centre de prolifération externe (OPC), qui génère les neurones de la lame et de la moelle externe et 2) le centre de prolifération interne (IPC), qui génère les neurones du complexe interne de la moelle épinière et du lobula 4,5,6,10 . Chez la larve du deuxième stade tardif, les cellules neuroépithéliales de l’OPC et de l’IPC commencent à se transformer en neuroblastes qui génèrent ensuite des neurones via les cellules mères ganglionnaires intermédiaires 4,5,11,12. Les neuroblastes du lobe optique sont structurés par des facteurs de transcription limités dans l’espace et dans le temps, qui agissent ensemble pour générer une diversité neuronale dans leur descendance 11,12,13,14. Dans la nymphe, les circuits des neuropils du lobe optique sont assemblés via la coordination de plusieurs processus, notamment la mort cellulaire programmée^11,15, la migration neuronale^12,16, le ciblage axonal/dendritique^10,17, la formation des synapses^18,19 et les rotations neuropil^10,17.

Ici, nous décrivons la méthodologie par laquelle les cerveaux larvaires et adultes sont disséqués, immunocolorés et montés pour l’imagerie du lobe optique. Compte tenu de son organisation tridimensionnelle complexe, l’analyse du lobe optique nécessite de comprendre comment ses neuropils adultes et ses progéniteurs larvaires sont positionnés les uns par rapport aux autres et par rapport au cerveau central. Ainsi, nous mettons un accent particulier sur la façon dont l’orientation du montage est liée à l’organisation spatiale des structures du lobe optique. Nous décrivons trois stratégies de montage pour les cerveaux larvaires (antérieur, postérieur et latéral) et trois pour les cerveaux adultes (antérieur, postérieur et horizontal), chacune fournissant un angle optimal pour l’imagerie d’une population spécifique de progéniteurs du lobe optique ou neuropil.

Protocole

1. Préparation des cerveaux larvaires pour l’imagerie confocale

1. Dissections
   REMARQUE : Avant de commencer la dissection, préparez les solutions de correctif (formaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)) et de PBT (0,1 à 0,3 % de Triton dans le PBS). La solution fixe doit être placée sur de la glace pendant la dissection. Bien que le fixateur de paraformaldéhyde (PFA) soit utilisé dans ce protocole, d’autres stratégies de fixation (utilisant le PLP²⁰ ou le PEM²¹) ont été décrites pour des épitopes spécifiques. Pour les dissections larvaires, deux paires de pinces (Dumont #5 ou #55s) sont nécessaires. Voir la table des matériaux pour plus de détails.
   1. Commencez par remplir chaque puits du plat de dissection avec 400 μL de 1x PBS. À l’aide d’une paire de pinces, vous pouvez choisir délicatement les larves du troisième stade qui rampent à l’intérieur du flacon. Placez les larves dans le premier puits du plat rempli de PBS.
   2. Prenez une larve et transférez-la dans le puits du milieu. À l’aide de la main non dominante, maintenez le corps de la larve à la base du puits.
   3. Avec la main dominante, saisissez doucement le crochet buccal de la larve et retirez-le du corps. Le cerveau larvaire doit être attaché au crochet buccal et à d’autres tissus accessoires et se détachera lorsque le tissu sera retiré.
   4. Retirez les disques imaginaux accessoires et transférez le cerveau larvaire dans le troisième puits de la boîte de dissection. Les disques imaginaux sont des tissus épithéliaux entourant le cerveau larvaire, qui génèrent des structures adultes telles que les antennes, les yeux, les pattes et les ailes²⁰. S’ils sont laissés sur le tissu, les disques imaginaux peuvent obstruer une immunocoloration correcte du cerveau larvaire.
      1. Pour retirer les disques imaginaires, utilisez une paire de pinces pour saisir fermement le cerveau via le cordon nerveux ventral. À l’aide d’une autre paire de pinces, épilez doucement les disques.
      2. Retirez soigneusement le disque oculaire, car il s’enroule sur la surface des lobes cérébraux. Pour retirer le disque oculaire, utilisez une paire de pinces pour maintenir le cerveau contre la base de la parabole. Au lieu de tenir le cerveau via le cordon nerveux ventral, utilisez la pince pour saisir légèrement le lobe cérébral en faisant attention de ne pas serrer le lobe. À l’aide d’une autre paire de pinces, retirez doucement le disque oculaire.
         REMARQUE : Le disque imaginal de l’œil finira par donner naissance aux photorécepteurs de la rétine. Pour ceux qui s’intéressent à l’étude de la connectivité neuronale entre la rétine et le lobe optique, le disque oculaire peut être laissé sur le cerveau. Cependant, pour ceux qui s’intéressent uniquement aux structures du lobe optique, il est recommandé d’enlever le disque oculaire car il peut entraver la qualité de l’image en raison de son emplacement à la surface du cerveau.
   5. Répétez les étapes 1.1.2\u20121.1.4 jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cerveaux aient été prélevés (ou que 30 minutes de dissection se soient écoulées). Les dissections ne doivent pas durer plus de 30 minutes pour s’assurer que l’intégrité du tissu n’est pas compromise.
   6. Une fois la période de dissection terminée, utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement le PBS du troisième puits. Assurez-vous qu’un petit volume de liquide reste dans le puits pour garder le cerveau immergé.
      REMARQUE : Il est crucial de garder le cerveau immergé dans un liquide à tous les points du protocole. Si le tissu se dessèche, la qualité de la coloration peut être compromise par une autofluorescence indésirable dans l’image confocale.
   7. Ajouter 500 μL de la solution de réparation à froid dans le troisième puits. Utilisez une paire de pinces pour remuer doucement le liquide, en laissant la cervelle tourbillonner dans le plat. Couvrez le plat avec une lame de verre et placez-le sur de la glace pendant 30 min pour permettre la fixation des tissus.
   8. Retirez la solution de fixation et lavez la cervelle avec 400 μL de PBT, 5 fois.
      REMARQUE : Triton est un détergent en PBT qui empêche les cerveaux de coller les uns aux autres ou à la parabole, et prépare les tissus pour une pénétration optimale des anticorps.
2. Immunohistochimie
   REMARQUE : Il existe plusieurs anticorps primaires disponibles auprès de la Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) qui peuvent être utilisés pour marquer des structures spécifiques du lobe optique ou des types de cellules. DE-Cadherin marque les neuroépithéliums IPC et OPC, Bruchpilot (Brp) marque le neuropil en développement et le teckel marque les neurones de la lame et du lobule (ainsi qu’un petit sous-ensemble de neurones de la moelle). De plus, Elav peut être utilisé pour marquer les neurones, Prospero pour marquer les cellules mères ganglionnaires et Repo pour identifier les cellules gliales.
   1. Préparez la solution primaire d’anticorps en ajoutant des anticorps au PBT jusqu’à un volume total de 100 μL. Un agent bloquant (10 % de sérum de chèvre normal) peut être utilisé pour empêcher la liaison non spécifique entre l’anticorps primaire et les tissus 20,22,23. Les anticorps utilisés dans ce protocole marquent spécifiquement le tissu cérébral sans avoir besoin d’agents bloquants.
   2. Retirez le dernier lavage post-fixation et ajoutez la solution d’anticorps primaires. Assurez-vous qu’il n’y a qu’une petite quantité de PBT dans le puits avant d’ajouter la solution d’anticorps. Après avoir ajouté la solution, remuez doucement le cerveau avec des pinces 5 à 10 fois. Couvrir avec une lame de verre, sceller avec un film de laboratoire et incuber à 4 °C pendant la nuit.
      1. Alternativement, si un agitateur orbital réfrigéré est disponible, placez le plat sur le shaker pour optimiser l’incubation pendant la nuit.
         REMARQUE : L’incubation primaire de l’anticorps et toutes les étapes ultérieures peuvent également être effectuées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Le volume des incubations primaires et secondaires peut rester de 100 μL, mais les étapes de lavage doivent être effectuées avec 800 μL ou plus de PBT.
   3. Après l’incubation, éliminez les anticorps primaires avec le PBT comme à l’étape 1.1.8 de la section précédente.
      REMARQUE : La solution primaire d’anticorps doit être conservée à 4 °C car elle peut être réutilisée pour des expériences ultérieures. De nombreux anticorps primaires peuvent être réutilisés jusqu’à quatre fois.
   4. Ajoutez 400 μL de PBT dans le cerveau pour un lavage final. Couvrez le plat avec une diapositive, scellez-le avec un film de laboratoire et placez-le sur un agitateur orbital à basse vitesse (100 tr/min) et à température ambiante (RT) pendant ~4 h.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les cerveaux peuvent être laissés au lavage pendant 2 à 3 jours à 4 °C.
   5. Préparez la solution secondaire d’anticorps dans un volume total de 100 μL.
      REMARQUE : Dans ce protocole, tous les anticorps secondaires sont utilisés à une dilution de 1:500, sans agents bloquants.
   6. Retirez le lavage PBT du puits et ajoutez la solution d’anticorps secondaire. Mélangez le tissu dans la solution à l’aide d’une paire de pinces. Recouvrez le plat d’une diapositive et d’un film de laboratoire. Placez la parabole sur un agitateur orbital à RT pendant une période d’incubation minimale de 2 h. Étant donné que les anticorps secondaires contiennent des fluorophores sensibles à la lumière, couvrez le plat de papier d’aluminium.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les cerveaux peuvent être laissés dans une solution secondaire d’anticorps pendant la nuit à 4 °C.
   7. Éliminez les anticorps secondaires comme décrit à l’étape 1.2.3. Ajoutez 400 μL de PBT dans le cerveau pour un lavage final. Couvrez le plat avec une lame, scellez avec un film de laboratoire et du papier d’aluminium. Placez les cerveaux sur un agitateur à RT pendant 4 h.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les cerveaux peuvent être laissés au lavage pendant 2 à 3 jours à 4 °C.
3. Montage
   1. Retirez le dernier lavage PBT et remplacez-le par deux gouttes de support de montage sans fluorescence. Placez une goutte du support de montage au centre d’une diapositive.
   2. Transférez les cerveaux du puits à la goutte sur la lame à l’aide d’une pince. Pour éviter d’endommager les lobes optiques, les cerveaux peuvent être maintenus par le cordon nerveux ventral lors du transfert vers la lame.
   3. Montez les cerveaux selon les stratégies de montage qui suivent (Figure 1A).
      1. Face antérieure vers le haut
         REMARQUE : Pour ceux qui souhaitent visualiser la moelle antérieure, la lame ou le bouchon lobula, cette orientation de montage est idéale. La meilleure façon de distinguer les montures antérieures et postérieures est d’examiner la position du cordon nerveux ventral par rapport aux lobes cérébraux.
         1. Utilisez l’orientation antérieure pour observer le cordon nerveux ventral qui fait saillie au-dessus des lobes (Figure 1B).
      2. Face postérieure vers le haut
         REMARQUE : Cette orientation est recommandée pour ceux qui souhaitent visualiser les pointes postérieures de l’OPC (pOPC) ou de l’IPC ^10,11.
         1. Utilisez l’orientation postérieure pour voir le cordon nerveux ventral qui fait saillie sous les lobes cérébraux (Figure 1C).
      3. Vue latérale
         REMARQUE : Une orientation de montage latéral est utilisée pour visualiser le croissant des neurones de la lame, de la moelle ou du lobule dans les axes dorsal-ventral et antéro-postérieur dans un seul plan (Figure 1G).
         1. Pour un montage latéral, séparez les lobes cérébraux les uns des autres pour qu’ils tombent à plat sur le côté, avec la lame et le bouchon de lobule vers le haut.
         2. À l’aide de deux paires de pinces tranchantes, fendez le cordon nerveux ventral en deux, en commençant par l’endroit où le cordon s’attache aux lobes. Notez que les deux lobes sont déjà séparés l’un de l’autre, le cordon nerveux ventral les maintenant intacts. Ainsi, séparez le cordon nerveux ventral à partir du point de clivage entre les lobes, pour les séparer. Ensuite, retournez chaque lobe cérébral et le cordon nerveux ventral attaché sur leurs côtés avec les surfaces latérales vers le haut.
            REMARQUE : Pour le montage en vue latérale, il est recommandé d’utiliser une aiguille en tungstène avec une pointe fine pour orienter le lobe cérébral sur son côté. Pour visualiser clairement l’orientation des lobes et la direction du cordon nerveux ventral lors du montage, l’éclairage du microscope peut être réglé. Si vous utilisez une source lumineuse à LED à col de cygne, les cols de cygne doivent être positionnés parallèlement à la surface du toboggan pour une bonne visibilité. De plus, l’intensité de l’éclairage peut être augmentée ou diminuée pour améliorer le contraste entre les structures cérébrales et fournir une clarté lors du montage.
   4. Placez une petite goutte de PBS de chaque côté du support de montage contenant les cerveaux. Placez une lamelle sur chaque goutte et une dernière lamelle sur la cervelle. Les bords droit et gauche de la lamelle supérieure doivent reposer sur les deux autres lamelles (Figure 1A).
      REMARQUE : Avant de placer une lamelle sur le cerveau, un pont doit être construit. Le cerveau des larves a une épaisseur d’environ 200 m et, par conséquent, pour préserver l’intégrité du tissu, un pont est créé qui augmente la distance entre la lamelle et la surface de la lame.
   5. Scellez les bords du pont avec du vernis à ongles pour fixer les cerveaux montés.
   6. Imagez les cerveaux à l’aide de la microscopie confocale.

2. Préparer le cerveau adulte à l’imagerie confocale

1. Dissections
   REMARQUE : Les dissections cérébrales chez l’adulte sont plus difficiles que les cerveaux larvaires et nécessitent une manipulation soigneuse. Il est fortement recommandé d’utiliser au moins une paire de pinces ultra-fines (Dumont #55) pour cette partie du protocole.
   1. Anesthésiez les mouches avec du CO₂, à l’aide d’une aiguille ou d’un tampon anti-mouches, et placez-les sur une lingette de laboratoire ou une serviette en papier sur de la glace (pour les garder anesthésiées).
   2. Ajoutez 400 μL de PBS dans les trois puits de la boîte en verre. À l’aide d’une paire de pinces, attrapez doucement une mouche adulte par les ailes et placez-la dans le premier puits du plat.
   3. Utilisez une paire de pinces tenues dans la main non dominante pour maintenir le thorax de la mouche contre la base du puits. Avec la main dominante, retirez doucement la tête du reste du corps.
   4. Transférez la tête dans le deuxième puits. Souvent, la tête flotte dans le PBS et peut être difficile à manipuler. Utilisez une paire de pinces pour le maintenir contre la base du puits près de la trompe.
   5. Décollez une région de la cuticule entre les yeux à l’aide des deux pinces. Étant donné que le cerveau se trouve juste en dessous de la cuticule, soyez aussi doux que possible pour éviter d’endommager les tissus sous-jacents. Continuez à décoller la cuticule un morceau à la fois, jusqu’à ce que le cerveau soit exposé. Retirez tout tissu accessoire (c.-à-d. la rétine, la trachée, les sacs aériens) qui pourrait rester attaché au cerveau.
      REMARQUE : L’ablation de la rétine a été décrite dans les protocoles précédents^22,24, mais la lame peut également être séparée du reste du lobe optique. Ceci est utile pour ceux qui souhaitent étudier le complexe de la moelle ou du lobule, car la lame se trouve à la surface et peut obstruer la visualisation de ces autres neuropixels du lobe optique lors de l’imagerie. Pour retirer la lame, utilisez une paire de pinces tranchantes pour tirer doucement sur l’indentation entre la lame et la moelle neuropille. La lame commencera lentement à se détacher de la moelle. Répétez ce mouvement jusqu’à ce que toute la lame soit retirée. Au cours de ce processus, il est important de maintenir une prise ferme sur le cerveau. Utilisez une autre paire de pinces pour maintenir le cerveau contre la base de la parabole en le positionnant de manière à ce que le haut et le bas du cerveau central s’insèrent parfaitement entre les pointes de la pince. Une prise ferme autour du cerveau central évitera des dommages indésirables au lobe optique.
   6. Transférez le cerveau propre dans le troisième puits. Répétez les étapes 2.1.2\u20122.1.6 jusqu’à ce qu’un nombre suffisant de cerveaux soit obtenu ou qu’une période de dissection maximale de 30 minutes se soit écoulée.
   7. Retirez le PBS dans le troisième puits et ajoutez 500 μL de solution fixe. Assurez-vous que les cerveaux ne se dessèchent pas ici ou pendant les étapes de lavage, car cela entraînerait une fluorescence de fond dans les images confocales. Couvrez le plat avec une lame de verre et laissez les cerveaux incuber en fixe pendant 20 min à RT.
   8. Après la fixation, laver le cerveau avec 400 μL de PBT, 5 fois.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Les cerveaux peuvent être recouverts d’une lame de verre et d’un film de laboratoire et laissés au lavage pendant 2 à 3 jours à 4 °C. Pour les chercheurs novices dans le système, il peut être plus facile de laisser des tissus accessoires sur le cerveau avant et pendant la fixation. Cela permettra aux chercheurs de maximiser le nombre d’échantillons de cerveau obtenus au cours d’une période de dissection donnée. Une fois que le tissu a été fixé et lavé, les cerveaux peuvent être soigneusement nettoyés avant d’ajouter une solution d’anticorps primaires. Les cerveaux adultes avec des tissus accessoires ont tendance à flotter et risquent donc de se dessécher. Par conséquent, il est recommandé d’utiliser une paire de pinces pour regrouper soigneusement tous les cerveaux au centre de la parabole lors de l’ajout de la solution fixe, et de nettoyer les cerveaux immédiatement après la fixation.
2. Immunohistochimie
   1. Effectuer l’immunohistochimie décrite pour les cerveaux larvaires à la section 1.2.
   2. Les anticorps primaires utiles du DSHB comprennent ceux qui sont mentionnés dans le protocole d’immunohistochimie larvaire à la section 1.2. Voir le tableau des matériaux pour une liste complète des anticorps et des dilutions correspondantes.
      REMARQUE : Des précautions supplémentaires doivent être prises lors des étapes de lavage pour les cerveaux adultes, car ils peuvent flotter à la surface de la solution de lavage et risquer de se dessécher sur les côtés du puits lorsque la solution est retirée (ce qui entraînera une fluorescence de fond). Une bonne pratique consiste à tenir la pipette dans une main pour ajouter ou aspirer du liquide, et une paire de pinces dans l’autre pour maintenir le cerveau immergé.
3. Montage
   1. Avant l’étape de montage, effectuez un dernier lavage avec du PBS (au lieu du PBT). Le PBS rend le cerveau légèrement collant, ce qui lui permet de rester dans l’orientation souhaitée pendant le montage.
   2. Retirez le lavage final et remplacez-le par trois gouttes de support de montage sans danger pour la fluorescence. Placez une goutte du support de montage au centre d’une lame de microscope.
   3. Transférez les cerveaux du puits à la goutte sur la lame à l’aide d’une pince. Pour éviter d’endommager les lobes optiques et d’éviter le dessèchement des tissus, récupérez soigneusement un cerveau par capillarité. Fermez lentement une paire de pinces autour d’un cerveau jusqu’à ce qu’un petit volume de liquide contenant le cerveau soit aspiré entre les pointes.
      REMARQUE : Lors du transfert du cerveau sur la lame, veillez à ne pas fermer la pince car cela endommagerait le cerveau. Alternativement, une pipette P200 peut être utilisée pour transférer les cerveaux. Coupez l’extrémité de l’embout pour élargir l’ouverture et pré-rincez avec du PBT pour éviter que la cervelle ne colle à l’intérieur de l’embout.
   4. Montez les cerveaux selon les stratégies suivantes (Figure 2A).
      1. Face antérieure vers le haut
         REMARQUE : Pour visualiser les neurones de la lame et de la moelle, orientez le cerveau avec la face antérieure vers le haut (Figure 2B). Cela peut être réalisé en examinant l’anatomie et la courbure des lobes antennaires centraux.
         1. À l’aide d’une paire de pinces, tournez doucement le cerveau sur le côté pour examiner les côtés antérieur et postérieur. Observez que sur la face antérieure, la courbure du cerveau est prononcée et que les lobes antennaires dépassent légèrement vers l’extérieur par rapport au centre.
      2. Face postérieure vers le haut
         1. Positionnez le cerveau avec le côté postérieur (plat) vers le haut et les lobes antennaires vers le bas (figure 2C).
            REMARQUE : Cela rapprochera le lobula et la plaque lobula de la surface d’imagerie et est idéal pour ceux qui souhaitent visualiser les neurones du complexe lobula.
      3. Vue horizontale
         REMARQUE : Pour visualiser tous les neuropixels du lobe optique simultanément, utilisez une stratégie de montage horizontal (Figure 2G). Dans cette orientation, les corps cellulaires neuronaux, les trajectoires axonales et les arborisations dendritiques peuvent être visualisés dans le même plan.
         1. Dans un premier temps, orientez le cerveau avec le côté antérieur vers le haut. À l’aide d’une aiguille en tungstène, inclinez doucement le cerveau de 90° vers le haut de manière à ce qu’il repose sur sa face dorsale, les lobes antennaires tournés vers l’extérieur. Vérifiez que les côtés antérieur et postérieur du cerveau sont visibles dans cette orientation.
   5. Au lieu d’un pont de couverture, utilisez de l’argile pour élever la lamelle de couverture de la diapositive. L’utilisation de l’argile permet de remonter les cerveaux après l’imagerie (décrite dans la section discussion).
      1. Placez un petit morceau d’argile à chaque coin d’une lamelle. Assurez-vous que chaque morceau d’argile a relativement la même épaisseur. Les morceaux d’argile doivent avoir une épaisseur comprise entre 0,5 et 1 mm. Placez doucement la lamelle sur la cervelle et appliquez une légère pression sur les coins. La lamelle doit immédiatement récupérer le liquide et former un joint. La lame est maintenant prête pour l’imagerie.
         REMARQUE : Pour un stockage à long terme de la lame, il est recommandé de sceller la lamelle avec du vernis à ongles et de la conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.

Résultats

Des images confocales des lobes optiques larvaires et adultes montés dans les orientations décrites dans le protocole sont présentées à la figure 1 et à la figure 2.

La figure 1 montre des schémas et des coupes confocales représentatives de cerveaux larvaires positionnés dans les orientations antérieure, postérieure et latérale. Dans l’orientation antérieure montante, l’épithélium OPC (...

Discussion

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour immunocolorer les cerveaux des larves et des adultes de drosophile et les monter dans plusieurs orientations. Bien que des méthodes de coloration des cerveaux larvaires et adultes aient déjà été décrites 22,23,24,27,28, les stratégies de montage pour la visualisation optimale de structures spécifiques du lobe optique ont reçu moins d’attention²⁸.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506