Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

요약

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

초록

초파리 시신경엽( Drosophila optic lobe)은 4개의 신경세포(lamina, medulla, lobula 및 lobula plate)로 구성되어 있으며, 신경 다양성을 생성하고 회로 조립을 주도하는 발달 메커니즘을 탐구하기 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 여기에서는 시신경 이미징을 위한 유충 및 성충 뇌의 절개, 면역 염색 및 장착을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 장착 방향과 시신경엽의 공간 조직 사이의 관계에 특히 중점을 둡니다. 유충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 측방)과 성충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 수평)에 대해 설명하며, 각 전략은 뚜렷한 시신경 구조를 위한 이상적인 이미징 각도를 제공합니다.

서문

겹눈과 기저 시신경엽으로 구성된 초파리 시각 시스템은 신경 회로 발달 및 기능 연구를 위한 훌륭한 모델이었습니다. 최근 몇 년 동안 특히 시신경엽은 신경 발생 및 회로 배선 1,2,3,4,5,6,7,8과 같은 신경 발달 과정을 연구하는 강력한 시스템으로 부상했습니다. 그것은 4 개의 신경 필로 구성됩니다 : lamina, medulla, lobula 및 lobula plate (후자의 두 개는 소엽 복합체를 구성)1,2,3,4,5,6. 눈의 광수용체는 박판(lamina)과 수질(medulla)의 뉴런을 표적으로 하여 시각적 입력을 처리하고 소엽 복합체 1,2,3,4,5,6의 뉴로pils로 전달합니다. 소엽 복합체(lobula complex)의 투영 뉴런(projection neuron)은 이후 시각 정보를 중추 뇌(central brain) ^1,5,9의 고차원 처리 센터로 보냅니다. 시신경의 복잡한 조직은 망막근시를 유지하고 다양한 유형의 시각적 자극을 처리해야 할 필요성에 의해 필요하기 때문에 정교한 신경 회로가 어떻게 조립되는지 연구하는 데 매력적인 시스템입니다. 특히, 수질은 오랫동안 척추 신경 회로 발달의 모델이었던 신경 망막과 그 조직과 발달 모두에서 놀라운 유사성을 공유합니다 ^3,8.

시신경 엽 발달은 배아 발생 중에 시작되며, 시신경 플라코드 2,4,5,6,7,8을 형성하는 ~35개의 외배엽 세포의 사양이 지정됩니다. 유충 부화 후, 시포는 두 개의 뚜렷한 원시골로 세분됩니다: 1) 층막과 외골의 뉴런을 생성하는 외부 증식 센터(OPC)와 2) 내부 수질과 소엽 복합체 4,5,6,10의 뉴런을 생성하는 내부 증식 센터(IPC). 후기 2차 인스타 유충에서 OPC 및 IPC의 신경 상피 세포는 신경 아세포로 변형되기 시작하여 중간 신경절 모세포 ^4,5,11,12를 통해 신경 세포를 생성합니다. 시신경 엽 신경 아세포는 공간적 및 시간적으로 제한된 전사 인자에 의해 패턴화되며, 이들은 함께 작용하여 자손에서 신경 다양성을 생성합니다 11,12,13,14. 번데기에서 시신경 엽의 회로는 프로그램 된 세포 사멸^11,15, 신경 세포 이동^12,16, 축삭 / 수지상 표적^10,17, 시냅스 형성^(18,19) 및 신경 필 회전^10,17을 포함한 여러 과정의 조정을 통해 조립됩니다.

여기에서는 유충과 성충의 뇌를 절개하고, 면역 염색하고, 시신경엽을 이미징하기 위해 장착하는 방법을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 따라서 우리는 장착 방향이 시신경엽 구조의 공간 조직과 어떻게 관련되는지에 특히 중점을 둡니다. 유충 뇌(전방, 후방 및 측방)를 위한 세 가지 장착 전략과 성체 뇌를 위한 세 가지 장착(전방, 후방 및 수평)을 설명하며, 각 전략은 특정 시신경엽 전구 개체군 또는 신경생물을 이미징하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.

프로토콜

1. 컨포칼 이미징을 위한 유충 뇌 준비

1. 해부
   참고: 해부를 시작하기 전에 수정액(인산염 완충 식염수(PBS)의 4% 포름알데히드) 및 PBT(PBS의 0.1-0.3% 트리톤) 용액을 준비하십시오. 수정 용액은 해부 중에 얼음 위에 놓아야 합니다. 이 프로토콜에서는 파라포름알데히드(PFA) 고정제가 사용되지만, 특정 에피토프에 대한 대체 고정 전략(PLP²⁰ 또는 PEM²¹ 사용)이 설명되었습니다. 유충 해부를 위해서는 두 쌍의 겸자(Dumont #5 또는 #55s)가 필요합니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
   1. 먼저 해부 접시의 각 웰을 400μL의 1x PBS로 채웁니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 바이알 내부를 기어 다니는 떠돌이 세 번째 별모양 유충을 부드럽게 선택합니다. PBS로 채워진 접시의 첫 번째 우물에 유충을 놓습니다.
   2. 유충 한 마리를 잡아 중간 우물로 옮깁니다. 자주 사용하지 않는 손을 사용하여 유충의 몸을 우물 바닥에 내려 놓습니다.
   3. 주로 사용하는 손으로 애벌레 입 고리를 부드럽게 잡고 몸에서 잡아당깁니다. 유충 뇌는 구강 고리 및 기타 부속 조직에 부착되어야 하며 조직을 잡아당길 때 떨어져 나갑니다.
   4. 부속 상상 디스크를 제거하고 유충 뇌를 해부 접시의 세 번째 우물로 옮깁니다. 상상 디스크는 유충 뇌를 둘러싼 상피 조직으로, 더듬이, 눈, 다리 및 날개와 같은 성인 구조를 생성합니다²⁰. 조직에 남아 있으면 상상 디스크가 유충 뇌의 적절한 면역 염색을 방해할 수 있습니다.
      1. 상상 디스크를 제거하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 복부 신경삭을 통해 뇌를 단단히 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 디스크를 부드럽게 뽑아냅니다.
      2. 눈 디스크는 뇌엽의 표면을 감싸고 있으므로 조심스럽게 제거하십시오. 눈 디스크를 제거하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 뇌를 접시 바닥에 고정합니다. 복부 신경삭을 통해 뇌를 유지하는 대신 겸자를 사용하여 뇌엽을 쥐어짜지 않도록 주의하면서 뇌엽을 가볍게 잡습니다. 다른 겸자를 사용하여 안구를 부드럽게 잡아당깁니다.
         참고: 눈의 상상 디스크는 결국 망막의 광수용체를 일으킵니다. 망막과 시신경 사이의 신경 연결성을 연구하는 데 관심이 있는 사람들은 안구 디스크를 뇌에 남겨둘 수 있습니다. 그러나 시신경 구조에만 관심이 있는 사람들에게는 뇌 표면의 위치로 인해 이미지 품질을 방해할 수 있으므로 안구 디스크를 제거하는 것이 좋습니다.
   5. 충분한 수의 뇌가 수집될 때까지(또는 30분의 절개 시간이 경과할 때까지) 1.1.2\u20121.1.4 단계를 반복합니다. 절개는 조직의 무결성이 손상되지 않도록 30분 이상 진행되어서는 안 됩니다.
   6. 절개 기간이 끝나면 P200 피펫을 사용하여 세 번째 웰에서 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 뇌를 잠글 수 있도록 우물에 소량의 액체가 남아 있는지 확인하십시오.
      참고: 프로토콜의 모든 지점에서 뇌를 액체에 담그는 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 조직이 건조되면 컨포칼 이미지에서 원치 않는 자가형광으로 인해 염색의 품질이 저하될 수 있습니다.
   7. 500μL의 콜드 픽스 용액을 세 번째 웰에 추가합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 액체를 부드럽게 저어 뇌가 접시에서 소용돌이칠 수 있도록 합니다. 유리 슬라이드로 접시를 덮고 티슈가 고정될 수 있도록 30분 동안 얼음 위에 놓습니다.
   8. 고정 용액을 제거하고 400 μL PBT로 뇌를 5 회 세척합니다.
      참고: Triton은 PBT의 세제로, 뇌가 서로 또는 접시에 달라붙는 것을 방지하고 최적의 항체 침투를 위해 조직을 준비합니다.
2. Immunohistochemistry(면역조직화학)
   참고: DSHB(Developmental Studies Hybridoma Bank)에서 특정 시신경 구조 또는 세포 유형을 표지하는 데 사용할 수 있는 몇 가지 기본 항체가 있습니다. DE-Cadherin은 IPC 및 OPC 신경 상피를, Bruchpilot(Brp)은 발달 중인 신경 필을 표시하고, Dachshund는 층판 및 소엽 뉴런(및 수질 뉴런의 작은 하위 집합)을 표시합니다. 또한 Elav는 뉴런을 표지하는 데 사용할 수 있으며, Prospero는 신경절 모세포를 표시하는 데 사용할 수 있으며, Repo는 신경교세포를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
   1. 총 부피가 100 μL까지 PBT에 항체를 추가하여 1차 항체 용액을 준비합니다. 차단제(10% 일반 염소 혈청)를 사용하여 1차 항체와 조직^20,22,23 사이의 비특이적 결합을 방지할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 항체는 차단제 없이 뇌 조직을 특이적으로 표지합니다.
   2. 최종 고정 후 세척제를 제거하고 1차 항체 용액을 추가합니다. 항체 용액을 추가하기 전에 웰에 소량의 PBT만 있는지 확인하십시오. 용액을 넣은 후 겸자로 뇌를 5-5회 부드럽게 저어줍니다. 유리 슬라이드로 덮고 실험실 필름으로 밀봉한 다음 4°C에서 밤새 배양합니다.
      1. 또는 냉장 궤도 셰이커를 사용할 수 있는 경우 접시를 셰이커에 올려 놓고 야간 배양을 최적화합니다.
         참고: 1차 항체 배양 및 모든 후속 단계는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 대안적으로 수행할 수 있습니다. 1차 및 2차 배양의 부피는 100μL를 유지할 수 있지만 세척 단계는 800μL 이상의 PBT로 수행해야 합니다.
   3. 배양 후 이전 섹션의 1.1.8단계와 같이 PBT로 일차 항체를 세척합니다.
      참고: 1차 항체 용액은 후속 실험에 재사용할 수 있으므로 4°C에서 보관 및 보관해야 합니다. 많은 1차 항체는 최대 4회까지 재사용할 수 있습니다.
   4. 최종 세척을 위해 뇌에 400μL의 PBT를 추가합니다. 접시를 슬라이드로 덮고 실험실 필름으로 밀봉한 다음 저속(100rpm) 및 실온(RT)에서 ~4시간 동안 궤도 셰이커에 놓습니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 뇌는 4°C에서 2-2일 동안 세척할 수 있습니다.
   5. 총 100 μL의 부피로 2차 항체 용액을 준비합니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 모든 2차 항체가 차단제 없이 1:500으로 희석되어 사용됩니다.
   6. 웰에서 PBT 세척액을 제거하고 2차 항체 용액을 추가합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 용액에 조직을 섞습니다. 슬라이드와 실험실 필름으로 접시를 덮습니다. 최소 2시간의 잠복 기간 동안 RT의 궤도 셰이커에 접시를 놓습니다. 2차 항체에는 빛에 민감한 형광단이 포함되어 있으므로 알루미늄 호일로 접시를 덮으십시오.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 뇌는 4 °C에서 하룻밤 동안 2차 항체 용액에 방치할 수 있습니다.
   7. 단계 1.2.3에 설명된 대로 2차 항체를 씻어냅니다. 최종 세척을 위해 뇌에 400μL의 PBT를 추가합니다. 슬라이드로 접시를 덮고 실험실 필름과 호일로 밀봉합니다. 뇌를 RT에서 4시간 동안 셰이커에 올려 놓습니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 뇌는 4°C에서 2-2일 동안 세척할 수 있습니다.
3. 장착
   1. 최종 PBT 세척을 제거하고 형광에 안전한 장착 미디어 두 방울로 교체합니다. 장착 미디어를 슬라이드 중앙에 한 방울 떨어뜨립니다.
   2. 집게를 사용하여 우물에서 슬라이드의 드롭으로 뇌를 옮깁니다. 시신경엽의 손상을 피하기 위해, 뇌는 슬라이드로 이동하는 동안 복부 신경삭에 의해 유지될 수 있습니다.
   3. 다음 장착 전략에 따라 브레인을 장착합니다(그림 1A).
      1. 앞쪽이 위로
         알림: 전방 수질, 층판 또는 소엽 플러그를 시각화하는 데 관심이 있는 사람들에게는 이 장착 방향이 이상적입니다. 전방산과 후방산을 구별하는 가장 좋은 방법은 뇌엽에 대한 복부 신경삭의 위치를 검사하는 것입니다.
         1. 전방 방향을 사용하여 엽 위로 돌출된 복부 신경삭을 관찰합니다(그림 1B).
      2. 뒤쪽이 위로
         참고: 이 방향은 OPC(pOPC) 또는 IPC ^10,11의 후단을 시각화하는 데 관심이 있는 사람들에게 권장됩니다.
         1. 뇌엽 아래에서 돌출된 복부 신경삭을 보려면 후방 방향을 사용합니다(그림 1C).
      3. 측면 보기
         참고: 측면 장착 방향은 단일 평면에서 등쪽-복부 축과 전방-후방 축 모두에서 층판, 수질 또는 소엽 플러그 뉴런의 초승달을 시각화하는 데 사용됩니다(그림 1G).
         1. 측면 마운트의 경우 뇌엽을 서로 분리하여 층막과 소엽 플러그가 위를 향하도록 하여 옆으로 평평하게 떨어집니다.
         2. 두 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 탯줄이 엽에 붙어있는 지점부터 시작하여 복부 신경삭을 반으로 나눕니다. 두 개의 엽은 이미 서로 분리되어 있으며 복부 신경삭이 그대로 유지하고 있습니다. 따라서 엽 사이의 분열 지점에서 복부 신경삭을 분리하여 분리합니다. 그런 다음 각 뇌엽과 부착된 복부 신경삭을 뒤집어 측면이 위를 향하도록 합니다.
            알림: 측면 view 마운트의 경우 끝이 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 뇌엽의 방향을 옆으로 향하게 하는 것이 좋습니다. 장착할 때 엽의 방향과 복부 신경삭의 방향을 명확하게 시각화하기 위해 현미경 조명을 조정할 수 있습니다. 구즈넥 LED 광원을 사용하는 경우 구즈넥은 명확한 가시성을 위해 슬라이드 표면과 평행하게 위치해야 합니다. 또한 조명 강도를 높이거나 낮춰 뇌 구조 간의 대비를 향상시키고 장착하는 동안 선명도를 제공할 수 있습니다.
   4. 뇌를 포함하는 장착 매체의 양쪽에 PBS를 작은 방울 떨어뜨립니다. 각 방울에 하나의 커버 슬립을 놓고 뇌에 마지막 커버 슬립을 놓습니다. 상단 커버슬립의 오른쪽 및 왼쪽 가장자리는 두 개의 다른 커버슬립 위에 놓여야 합니다(그림 1A).
      참고: 뇌에 커버슬립을 씌우기 전에, 다리를 놓아야 합니다. 유충의 뇌는 약 200μm의 두께를 가지고 있으므로 조직의 무결성을 유지하기 위해 커버 슬립과 슬라이드 표면 사이의 거리를 늘리는 다리가 만들어집니다.
   5. 다리의 가장자리를 매니큐어로 밀봉하여 장착된 뇌를 고정합니다.
   6. 컨포칼 현미경을 사용하여 뇌를 이미지화합니다.

2. 컨포칼 이미징을 위한 성인의 뇌 준비

1. 해부
   참고: 성인 뇌 절개는 유충 뇌보다 더 까다롭고 신중한 취급이 필요합니다. 프로토콜의 이 부분에는 최소 한 쌍의 초미세 겸자(Dumont #55)를 사용하는 것이 강력히 권장됩니다.
   1. 바늘이나 플라이패드를 사용하여 CO₂로 파리를 마취하고 얼음 위에 실험실 물티슈나 종이 타월에 놓습니다(마취 상태를 유지하기 위해).
   2. 유리 접시의 3개 웰 모두에 400μL의 PBS를 추가합니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 성인 파리 한 마리의 날개를 부드럽게 잡고 접시의 첫 번째 우물에 넣으십시오.
   3. 우세하지 않은 손에 들고 있는 한 쌍의 집게를 사용하여 파리의 흉부를 우물 바닥에 대고 잡습니다. 주로 사용하는 손으로 몸의 나머지 부분에서 머리를 부드럽게 잡아당깁니다.
   4. 머리를 두 번째 우물로 옮깁니다. 종종 헤드가 PBS에 떠서 다루기 어려울 수 있습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여 주둥이로 우물 바닥에 대고 누릅니다.
   5. 양쪽 집게를 사용하여 눈 사이의 큐티클 부분을 벗겨냅니다. 뇌는 큐티클 바로 아래에 있기 때문에 기저 조직이 손상되지 않도록 가능한 한 부드럽게 하십시오. 뇌가 노출될 때까지 큐티클을 한 번에 한 조각씩 계속 벗겨냅니다. 뇌에 붙어 있을 수 있는 부속 조직(예: 망막, 기관, 공기 주머니)을 제거합니다.
      주의: 망막의 제거는 이전 프로토콜^22,24에서 설명되었지만, 라미나는 시신경엽의 나머지 부분에서도 분리될 수 있습니다. 이것은 수질 또는 소엽 복합체를 연구하고자 하는 사람들에게 유용한데, 그 이유는 층판이 표면에 위치하여 이미징 시 이러한 다른 시신경 신경층의 시각화를 방해할 수 있기 때문입니다. 얇은 판을 제거하려면 한 쌍의 날카로운 집게를 사용하여 얇은 판과 수질 신경 생물 사이의 움푹 들어간 곳을 부드럽게 잡아당깁니다. 얇은 판은 천천히 수질에서 벗겨지기 시작합니다. 전체 라미나가 제거될 때까지 이 동작을 반복합니다. 이 과정에서 뇌를 단단히 쥐고 있는 것이 중요합니다. 다른 한 쌍의 집게를 사용하여 중추 뇌의 상단과 하단이 겸자의 끝 사이에 완벽하게 맞도록 접시 바닥에 뇌를 고정합니다. 중추 뇌를 단단히 잡으면 시신경에 원치 않는 손상이 생기는 것을 방지할 수 있습니다.
   6. 깨끗한 뇌를 세 번째 우물로 옮깁니다. 충분한 수의 뇌를 얻거나 최대 절개 기간인 30분이 경과할 때까지 2.1.2\u20122.1.6 단계를 반복합니다.
   7. 세 번째 웰에서 PBS를 제거하고 500μL의 수정 용액을 추가합니다. 뇌가 여기나 세척 단계에서 건조해지지 않도록 주의해야 하며, 이로 인해 컨포칼 이미지에서 배경 형광이 발생할 수 있습니다. 유리 슬라이드로 접시를 덮고 뇌가 RT에서 20분 동안 고정된 상태로 부화하도록 합니다.
   8. 고정 후 400 μL의 PBT로 뇌를 5회 세척합니다.
      참고: 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 뇌는 유리 슬라이드와 실험실 필름으로 덮고 4 °C에서 2-20123일 동안 세척할 수 있습니다. 이 시스템을 처음 접하는 연구자의 경우, 고정 전과 고정 중에 뇌에 부속 조직을 남겨두는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 주어진 절개 기간 동안 얻은 뇌 샘플의 수를 최대화할 수 있습니다. 조직을 고정하고 세척한 후 1차 항체 용액을 추가하기 전에 뇌를 조심스럽게 청소할 수 있습니다. 부속 조직이 있는 성인의 뇌는 물에 뜨는 경향이 있으므로 건조해질 위험이 있습니다. 결과적으로, 고정 용액을 추가할 때 한 쌍의 집게를 사용하여 모든 뇌를 접시 중앙에 조심스럽게 모으고 고정 후 즉시 뇌를 청소하는 것이 좋습니다.
2. Immunohistochemistry(면역조직화학)
   1. 섹션 1.2에서 유충 뇌에 대해 설명된 대로 면역조직화학을 수행합니다.
   2. DSHB의 유용한 1차 항체에는 섹션 1.2의 유충 면역조직화학 프로토콜에 언급된 항체가 포함됩니다. 항체 및 해당 희석액의 전체 목록은 Table of Materials 를 참조하십시오.
      알림: 성인의 뇌는 세척 용액의 표면으로 떠오를 수 있고 용액을 제거할 때 우물 측면에서 건조될 위험이 있기 때문에(배경 형광으로 이어질 수 있음) 세척 단계 중에 각별한 주의를 기울여야 합니다. 한 손에는 피펫을 잡고 액체를 추가하거나 빼내고, 다른 손에는 겸자를 들고 뇌가 잠기지 않도록 하는 것이 좋습니다.
3. 장착
   1. 장착 단계 전에 PBT(PBT 대신)로 최종 세척을 수행하십시오. PBS는 뇌가 약간 끈적거리게 하여 장착하는 동안 원하는 방향을 유지할 수 있도록 합니다.
   2. 최종 세척을 제거하고 형광 안전 장착 매체 3방울로 교체합니다. 장착 매체를 현미경 슬라이드의 중앙에 한 방울 떨어뜨립니다.
   3. 집게를 사용하여 우물에서 슬라이드의 드롭으로 뇌를 옮깁니다. 시신경엽의 손상을 방지하고 조직이 건조해지는 것을 방지하려면 모세혈관 작용을 통해 뇌를 조심스럽게 회수해야 합니다. 뇌를 함유하고 있는 소량의 액체가 뇌 끝 사이에 들어갈 때까지 뇌 주위의 한 쌍의 집게를 천천히 닫습니다.
      알림: 뇌를 슬라이드로 옮길 때 뇌가 손상될 수 있으므로 겸자를 닫지 않도록 주의하십시오. 또는 P200 피펫을 사용하여 뇌를 전달할 수 있습니다. 팁의 끝 부분을 잘라내어 입구를 넓히고 PBT로 미리 헹구어 뇌가 팁 안쪽에 달라붙는 것을 방지합니다.
   4. 다음 전략에 따라 브레인을 장착합니다(그림 2A).
      1. 앞쪽이 위로
         참고: 층판 및 수질 뉴런을 시각화하려면 앞쪽이 위로 향하게 뇌의 방향을 지정합니다(그림 2B). 이것은 중앙 더듬이 엽의 해부학과 곡률을 검사함으로써 달성 할 수 있습니다.
         1. 한 쌍의 집게를 사용하여 뇌를 부드럽게 옆으로 돌려 앞쪽과 뒤쪽을 모두 검사합니다. 앞쪽에서 뇌의 만곡이 뚜렷하고 더듬이가 중심에서 약간 바깥쪽으로 돌출되어 있는 것을 관찰하십시오.
      2. 뒤쪽이 위로
         1. 뇌의 위치는 뒤쪽(평평한) 쪽이 위를 향하고 더듬이엽이 아래를 향하도록 합니다(그림 2C).
            참고: 이렇게 하면 소엽과 소엽 플레이트가 이미징 표면에 더 가까워지며 소엽 복합 뉴런을 시각화하는 데 관심이 있는 사람들에게 이상적입니다.
      3. 수평 view
         참고: 모든 시신경 신경을 동시에 시각화하려면 수평 장착 전략을 사용하십시오(그림 2G). 이 방향에서는 신경 세포체, 축삭 궤적 및 수지상 가지화(dendritic arborizations)를 동일한 평면에서 시각화할 수 있습니다.
         1. 처음에는 앞쪽이 위로 향하게 뇌의 방향을 맞춥니다. 텅스텐 바늘을 사용하여 뇌를 위쪽으로 90° 부드럽게 기울여 더듬이가 바깥쪽을 향하도록 등쪽에 앉게 합니다. 이 방향에서 뇌의 앞쪽과 뒤쪽이 모두 보이는지 확인하십시오.
   5. 커버 슬립 브리지 대신 점토를 사용하여 슬라이드에서 커버 슬립을 들어 올립니다. 점토를 사용하면 이미징 후 뇌를 다시 장착할 수 있습니다(토론 섹션에서 설명).
      1. 커버 슬립의 각 모서리에 작은 점토 조각을 놓습니다. 각 점토 조각의 두께가 상대적으로 같은지 확인하십시오. 점토 조각의 두께는 0.5-1mm 사이여야 합니다. 커버슬립을 뇌 위에 부드럽게 놓고 모서리에 약간의 압력을 가합니다. 커버슬립은 즉시 액체를 잡아 밀봉을 형성해야 합니다. 이제 슬라이드를 이미징할 준비가 되었습니다.
         알림: 슬라이드의 장기 보관을 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하고 빛에서 4°C 떨어진 곳에 보관하는 것이 좋습니다.

결과

프로토콜에 설명된 방향으로 장착된 유충 및 성체 시신경엽의 공초점 이미지는 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다.

그림 1은 전방, 후방 및 측방 방향으로 위치한 유충 뇌의 개략도와 대표적인 공초점 절편을 보여줍니다. 전방 장착 방향에서는 OPC 상피(DE-Cadherin), 수질 신경아세포(deadpan>βgal) 및 층판 뉴?...

토론

이 프로토콜에서는 유충 및 성체 초파리의 뇌를 면역염색하고 여러 방향으로 장착하는 방법을 설명합니다. 유충과 성충의 뇌를 염색하는 방법은 이전에 설명되었지만22,23,24,27,28 특정 시신경 구조를 최적으로 시각화하기 위한 장착 전략은 주목을 덜 받았다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Bioshop	PBS405
37% formaldehyde	Bioshop	FOR201
Alexa Fluor 488 (goat) secondary	Invitrogen	A-11055	use at 1:500
Alexa Fluor 555 (mouse) secondary	Invitrogen	A-31570	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (guinea pig) secondary	Invitrogen	A-21450	use at 1:500
Alexa Fluor 647 (rat) secondary	Invitrogen	A-21247	use at 1:500
Cover slips	VWR	48366-067
Dissecting forceps - #5	Dumont	11251-10
Dissecting forceps - #55	Dumont	11295-51
Dissection Dish	Corning	722085
Dry wipes	Kimbery Clark	34155
Goat anti-Bgal primary antibody	Biogenesis		use at 1:1000
Guinea pig anti-Bsh primary antibody	Gift from Claude Desplan		use at 1:500
Guinea pig anti-Vsx1 primary antibody	Erclik et al. 2008		use at 1:1000
Laboratory film	Parafilm	PM-996
Microcentrifuge tubes	Sarstedt	72.706.600
Microscope slides	VWR	CA4823-180
Mouse anti-dac primary antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	mabdac2-3	use at 1:20
Mouse anti-eya primary antibody	DSHB	eya10H6	use at 1:20
Mouse anti-nc82 primary antibody	DSHB	nc82	use at 1:50
Mouse anti-svp primary antibody	DSHB	Seven-up 2D3	use at 1:100
Polymer Clay	Any type of clay can be used
Rabbit anti-GFP	Invitrogen	A-11122	use at 1:1000
Rat anti-DE-Cadherin primary antibody	DSHB	DCAD2	use at 1:20
Slowfade mounting medium	Invitrogen	S36967	Vectashield mounting medium ( cat# H-1000) can also be used
Triton-x-100	Bioshop	TRX506