זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים

Summary

מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.

Abstract

אימונוגלובולין A (IgA) נפרופתיה היא סוג של גלומרולונפריטיס ראשונית המאופיינת בתצהיר חריג של IgA, המוביל לאי ספיקת כליות סופנית. בשנים האחרונות דווח על מעורבות של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. עם זאת, אין שיטה מבוססת ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים. לכן, פיתחנו שיטה אמינה לניתוח miRNA בכליה של מודל עכבר IgA (עכבר HIGA). מטרת פרוטוקול זה היא לזהות את רמות הביטוי המשתנות של miRNA בכליות של עכברי HIGA בהשוואה לרמות בכליות של עכברי ביקורת. בקצרה, שיטה זו מורכבת מארבעה שלבים: 1) קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA; 2) טיהור RNA כולל מדגימות כליה; 3) סינתזה של דנ"א משלים מרנ"א כולל; ו-4) תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בשעתוק לאחור (qRT-PCR) של miRNA. באמצעות שיטה זו זיהינו בהצלחה את רמות הביטוי של מספר miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p) בכליות של עכברי HIGA. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA.

Introduction

Immunoglobulin A (IgA) נפרופתיה היא סוג של glomerulonephritis ראשוני המאופיין על ידי תצהיר חריג של IgA באזור mesangial גלומרולרי הכליה ^1,2. זהו הנפוץ ביותר של glomerulonephritis הראשוני ומוביל לאי ספיקת כליות סופנית ב 20%-40% מהחולים². הסיבה עדיין לא ידועה, אך זיהום רירית מתמשך היה מעורב ^1,3. קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין הוצעו כשיטות טיפוליות^1,3, אך לא נקבעו לחלוטין³. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה ואת שיטות הטיפול של טיפול נפרופתיה IgA.

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קטנים ולא מקודדים הממלאים תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים ^4,5. miRNA מדווחים כמעורבים בפתוגנזה של מחלות שונות, וחלקם זוהו כסמנים ביולוגיים של מחלות וסוכנים טיפוליים ^4,5. בשנים האחרונות דווח גם על קשר בין miRNAs לבין הפתוגנזה של נפרופתיה IgA ^2,6,7. לדוגמה, miR-148b הוכח כמעורב בהפרעות מבניות של IgA בחולים עם נפרופתיה IgA ^2,6,7, בעוד miR-148b ו- let-7b תועדו כסמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי נפרופתיה IgA⁷. למרות שהבנת ההשפעות של miRNA על נפרופתיה IgA עשויה לעזור להבהיר עוד יותר אטיולוגיה וטיפול 2, שיטות סטנדרטיות ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים טרם נקבעו².

כאן פיתחנו שיטה פשוטה ואמינה למדידת רמות ביטוי miRNA בכליות של עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA). עכבר HIGA הוא זן ddY אופייני המראה רמה גבוהה במיוחד של IgA בסרום ואת התצהיר החריג של IgA בגלומרולי כליות 8,9,10,11. לכן, עכברי HIGA יכולים לשמש כעכבר נפרופתיה IgA מודל 8,9,10,11. השיטה שלנו מורכבת מארבעה שלבים עיקריים: ראשית, קבלת דגימות כליה כירורגית מעכברי HIGA; שנית, הומוגניזציה של דגימות וטיהור הרנ"א הכולל באמצעות עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה; שלישית, סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) מסך הרנ"א באמצעות שעתוק הפוך; ורביעית, זיהוי רמות הביטוי של miRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (qRT-PCR). הרציונל לשיטה זו ומהימנות התוצאות מבוססים על דוחות קודמים^12,13. אנו מראים כי זוהי טכניקה שימושית למדידה מדויקת של רמות ביטוי miRNA במודל עכבר נפרופתיה IgA, וכי ניתן להשתמש בה כדי להקל על מחקר עתידי של miRNA בנפרופתיה IgA.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ועומדים בהנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה.

1. קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA

הערה: עכברי HIGA מראים פנוטיפ יציב של נפרופתיה IgA לאחר 25 שבועות של גיל 8,9,10,11. עכברי Balb/c צריכים להיבחר כקבוצת הביקורת 8,9,10,11. התקבלו נקבות עכברי HIGA בנות 25 שבועות (n = 10) ועכברות Balb/c בנות 25 שבועות (n = 10). יש לקבוע מראש את מספר העכברים הדרושים לניסויים. שלב זה דורש כ-7-8 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי Balb/c.

1. הכינו את הפריטים הבאים: עכברי HIGA (בני 25 שבועות, נקבה), עכברי Balb/c (בני 25 שבועות, נקבה), מכשיר הרדמה בשאיפה, איזופלורן, יריעת שעם, סיכה, מלח חוצץ פוספט (PBS), מזרקי הזרקה, מחטים, מספריים כירורגיים ומלקחיים.
2. מרדימים עכבר HIGA באמצעות 4%-5% איזופלורן עם מכשיר הרדמה באינהלציה ומרכיבים אותו במצב גבי על יריעת השעם באמצעות פינים. להתאים את ריכוז isoflurane ל 2%-3% כמינון תחזוקה לאחר השראת הרדמה.
   הערה: עומק ההרדמה נשמר ברמה שבה הכאב הקשור להליך הפולשני נעלם לחלוטין. בפרט, ריכוז isoflurane צריך להיות מותאם ל 4-5% בעת כריתת רקמות כגון בית החזה. הסרת שיער ומשחת עיניים אינן חיוניות. אין צורך להרכיב את העכבר על כרית חימום אם ניתן לבצע את ההליך במהירות.
3. בצע חתך קו אמצע של 3-4 ס"מ של דופן הבטן של העכבר עם מספריים כירורגיים ומלקחיים וזהה בזהירות את שני צידי הכליה.
4. חותכים את הצלעות והסרעפת עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר חיתוך האטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב בהיר (הליך זה אומר שכל גוף העכבר מחורר עם PBS).
5. חותכים את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, ומוציאים את הכליה. מחלקים את הכליה לחתיכות של 30 מ"ג לשימוש בשלב הבא.
   הערה: הפתולוגיה של נפרופתיה IgA כוללת בעיקר את glomerulus בקליפת הכליה (החלק החיצוני של הכליה). למרות שקשה להבחין באופן מקרוסקופי ומוחלט בין קליפת המוח לבין המדולה, רצוי לאסוף בעיקר את החלק החיצוני של הכליה. דגימות אלה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

2. טיהור RNA כולל מדגימות כליה

הערה: בשלב זה, ערכת בידוד miRNA זמינה מסחרית משמשת להפקת RNA כולל. בנוסף, ביופולימר גריסה עמוד ספין משמש. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכת בידוד miRNA מכילה עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרות איסוף של 1.5 או 2.0 מ"ל, 100% אתנול, כלורופורם, הומוגנייזר סיליקון, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, צנטריפוגה, עמוד ספין לגריסת ביופולימר, עמוד ספין מבוסס סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז.
2. הומוגניזציה של דגימות כליה של 30 מ"ג באמצעות הומוגנייזר סיליקון ו-700 מיקרוליטר של מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין בטמפרטורת החדר.
   הערה: ה-miRNA בדגימה פגיעים עד שנחשפו למגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין, ולכן יש לבצע שלבים אלה בהקדם.
3. מעבירים את הליזט לעמוד הספין הגורס ביופולימר וצנטריפוגות אותו במהירות של 15,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
4. מוסיפים 140 μL כלורופורם לתסנין ומערבבים במרץ במשך 15 שניות. להשאיר במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם ב 4 ° C במשך 15 דקות.
5. מעבירים בעדינות את הסופרנאטנט השקוף מבלי לגעת בשכבה האמצעית לצינור איסוף חדש ומוסיפים את הנפח שנקבע (ראו להלן) של 100% אתנול. מערבולת במשך 5 שניות.
   הערה: נדרש 100% אתנול בנפח של פי 1.5 מהסופרנאטנט המתקבל.
6. מעבירים את הדגימה (גבול עליון 700 μL) לעמוד ספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב-8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
7. הוסף 700 μL של חיץ כביסה 1 לעמוד הספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את העמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
8. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
9. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
10. צנטריפוגו שוב את עמוד הסחרור המבוסס על קרום סיליקה מבלי להוסיף דבר כדי להסיר אתנול נוסף, בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לזרוק את התסנין לאחר צנטריפוגה.
11. שנה את הצינור המחובר לעמודת הסחיטה לצינור איסוף חדש.
12. הוסף 30 μL של מים נטולי נוקלאז לעמוד הסחרור מבוסס קרום הסיליקה וצנטריפוגה אותו ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: תמיסת 30 μL המתקבלת מכילה ריכוז גבוה של RNA כולל. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

3. סינתזה של cDNA מסך RNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת תמלול לאחור הזמינה באופן מסחרי. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך וחיץ. הליך זה חייב להתבצע על קרח כדי למנוע התקדמות של התגובה. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

1. הכינו את הפריטים הבאים: צינורות איסוף 1.5 מ"ל, צינורות רצועת שמונה בארות, מיקרופיפטים, קצות פיפטה, ספקטרופוטומטר, מים ללא נוקלאז, קרח, תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך, חיץ ומחזור תרמי.
2. למדוד את ריכוז הרנ"א הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, חשב את הנפח הנדרש של מים ללא נוקלאז, כך 12 μL מכיל 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
3. הכינו תערובת אב עם התכולה הבאה: 2.0 μL של תערובת חומצות גרעין, 2.0 μL של תערובת שעתוק לאחור, ו- 4.0 μL של חיץ לסך של 8.0 μL לדגימה.
4. הוסף 8 μL של תערובת האב לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
5. לדלל את סך הרנ"א בנפח המים נטולי הנוקלאז המחושב ב-3.2. לאחר מכן, הוסף 12 μL של תמיסת RNA הכוללת (המכילה 1 מיקרוגרם של RNA כולל) לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
6. לדגור את הדגימה ב 8 צינורות רצועת באר ב 37 ° C במשך 60 דקות באמצעות מחזור תרמי. לאחר מכן, לדגור ב 95 ° C במשך 5 דקות באמצעות מחזור תרמי.
   הערה: התמיסה לאחר הדגירה מכילה ריכוז גבוה של cDNA.
7. העבר תמיסה זו לצינור של 1.5 מ"ל והוסף 200 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
   הערה: 200 μL המתקבל של פתרון יכול לשמש עבור qRT-PCR כמו cDNA תבנית. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 °C במשך כשנה.

4. qRT-PCR של miRNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת PCR זמינה מסחרית. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת PCR, פריימר אוניברסלי ומים ללא נוקלאז. דוגמאות צריך להיות מוכן כפול, ואת הדיוק של התוצאות צריך להיחשב בכל מקרה. רמות הביטוי של miRNA מכומתות בשיטת ΔΔCT. שלב זה דורש כ-4 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרת איסוף של 1.5 מ"ל, צלחת תגובה של 96 בארות, סרט דבק לצלחת התגובה של 96 בארות, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, תערובת PCR, פריימר אוניברסלי, מים ללא נוקלאז, פריימרים ספציפיים ל-miRNA ומכשיר PCR בזמן אמת.
2. הכן את תערובת האב עם התוכן הבא: 12.5 μL של תערובת PCR, 2.5 μL של פריימר אוניברסלי, 1.25 μL של 5 μM פריימר ספציפי miRNA, ו 6.25 μL של מים ללא nuclease עבור כל באר.
   הערה: בבדיקה זו נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים ל-miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p]. RNU6-2 שימש כבקרה אנדוגנית¹⁴.
3. הוסף 22.5 μL של תערובת האב לכל באר של צלחת התגובה 96 באר.
4. הוסף 2.5 μL של cDNA שהוכן בשלב 3.7 לבאר בודדת של צלחת באר 96.
5. כסו את צלחת התגובה של באר 96 בסרט הדבקה, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של 1,000 x גרם למשך 30 שניות.
6. הפעל את מכשיר ה- PCR בזמן אמת. תכנת את מכשיר ה- PCR באופן הבא: הפעלה ראשונית ב- 95 ° C למשך 15 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב- 94 ° C למשך 15 שניות, חישול ב- 55 ° C למשך 30 שניות, והרחבה ב- 70 ° C למשך 30 שניות.
7. כימות ביטוי גנים בשיטת ΔΔCT. רמות ביטוי יחסיות נקבעות כ- 2^–ΔΔCT.
   הערה: יש לשקול עקומות הגברה חריגות של PCR לצורך אי הכללה מהתוצאות.

תוצאות

חקרנו את רמות הביטוי של miRNA בכליות של עכברי HIGA (n=10). תוצאה זו התקבלה לחלוטין על בסיס הפרוטוקול המתואר. הכליות של עכברי Balb/c נבחרו כקבוצת הביקורת (n=10). בשתי הקבוצות נבחרו בני 25 שבועות. רק נקבות עכברי HIGA היו זמינות מהספק. רמות הביטוי של שלוש miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p; איור 1) זוהו, אש?...

Discussion

הצלחנו למדוד את רמות הביטוי של miRNA בכליות של מודל עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA) באמצעות שיטה חדשה זו. IgA נפרופתיה היא מחלה בלתי מוסברת הזקוקה למחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה שלה ואת המטרות הטיפוליות ^1,3. עם זאת, השגת דגימות כליה אנושיות היא פולשנית ביותר. טכני?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/cCrSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	Mouse for control
HIGA/NscSlc (25-week-old, female)	Japan SLC, Inc.	none	IgA nephropathy mouse model
MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	96-well reaction plate
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	adhesive film for 96-well reaction plate
miScript II RT kit	Qiagen	218161	Experimental kit for synthesis of cDNA
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	Experimental kit fot extraction of total RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)	Qiagen	MS00033740	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-155-5p)	Qiagen	MS00001701	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-146a-5p)	Qiagen	MS00001638	miRNA-specific primer
miScript Primer Assay (miR-21-5p)	Qiagen	MS00009079	miRNA-specific primer
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	Experimental kit for real-time PCR
QIA shredder	Qiagen	79654	biopolymer-shredding spin column
QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument
QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	real-time PCR instrument software
takara biomasher standard	Takara Bio	9790B	silicon homogenizer